检索结果-内蒙古大学图书馆

中国实验方剂学杂志 2017年第5期23卷 101-106页

作者：曹小雨李钊飞陈琼芳王钢杨秀芬广西中医药大学药学院南宁530001

目的:研究灯盏花素对大鼠脑缺血再灌注损伤相关细胞色素(cytochrome,CYP)4A1,CYP4A3,CYP4A8的作用机制。方法:采用SD雄性大鼠193只,制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,在脑缺血2 h,再灌注术后立即尾静脉... 详细信息

目的:研究灯盏花素对大鼠脑缺血再灌注损伤相关细胞色素(cytochrome,CYP)4A1,CYP4A3,CYP4A8的作用机制。方法:采用SD雄性大鼠193只,制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,在脑缺血2 h,再灌注术后立即尾静脉注射给予灯盏花素注射剂(12,6,3 mg·kg^(-1)),每日1次,连续7 d,末次给药后,断头取右脑组织,用实时荧光定量PCR法检测脑组织内的CYP基因CYP4A1,CYP4A3,CYP4A8的表达情况,用酶联反应吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测大鼠内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)含量。结果:与假手术组比较,模型组大鼠脑损伤168 h后的死亡率、脑梗死体积、行为学评分显著升高(P<0.01),大鼠脑组织CYP4A3,CYP4A8显著上调(P<0.01),e NOS含量显著增加(P<0.01)。与模型组比较,灯盏花素(12,6 mg·kg-1)组可降低的大鼠脑损伤168 h的死亡率、脑梗死体积(P<0.05),降低24 h后行为学评分(P<0.01),下调大鼠脑组织CYP4A3,CYP4A8表达和血清e NOS含量(P<0.05,P<0.01);灯盏花素(3 mg·kg^(-1))组对降低大鼠脑损伤168 h后死亡率和脑梗死体积不明显,可明显降低120 h时行为学评分(P<0.05),显著下调CYP4A3,CYP4A8表达和脑组织e NOS含量(P<0.01)。结论:大鼠脑缺血再灌注损伤会加重大鼠死亡率、脑梗死体积、行为学评分,上调脑组织CYP4A3,CYP4A8的表达和增加脑组织及血清e NOS的含量。灯盏花素可降低大鼠脑缺血再灌注损伤大鼠死亡率和行为学评分,可能是通过下调脑组织CYP4A3,CYP4A8的表达来改善大鼠脑缺血再灌注损伤。

关键词：灯盏花素注射剂大脑中动脉栓塞模型细胞色素基因表达脑组织

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安宫牛黄丸(含天然麝香或人工麝香)对实验性脑缺血的保护作用

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世界科学技术-中医药现代化 2013年第1期15卷 85-90页

作者：董世芬楼黎明张硕峰孙建宁北京中医药大学中药学院/中药基础与新药研究北京市重点实验室北京100102

目的:研究比较含人工麝香或天然麝香的安宫牛黄丸对实验性脑缺血的保护作用。方法:采用大脑中动脉栓塞(MCAT)与大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)两种动物模型,观察两种安宫牛黄丸(84-333 mg·kg-1)对大鼠的神经症状、脑梗死范围以及对缺... 详细信息

目的:研究比较含人工麝香或天然麝香的安宫牛黄丸对实验性脑缺血的保护作用。方法:采用大脑中动脉栓塞(MCAT)与大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)两种动物模型,观察两种安宫牛黄丸(84-333 mg·kg-1)对大鼠的神经症状、脑梗死范围以及对缺血侧脑组织酸中毒和自由基代谢的影响。结果:安宫牛黄丸(含人工麝香或天然麝香)167,333 mg·kg-1剂量组可显著改善MCAT大鼠的神经症状;安宫牛黄丸(含天然麝香)84,167 mg·kg-1剂量组可分别减少MCAT大鼠脑梗死范围27%和37%,安宫牛黄丸(含人工麝香)84-333 mg·kg-1显著减少MCAT大鼠脑梗死灶面积21%-32%,两种安宫牛黄丸对应各剂量组间无显著性差异;两者均可显著降低MCAO大鼠的LDH(10%-12%)和MDA(28%-38%)含量,并显著升高SOD活力(15%-36%)和GSH含量(14%-36%)。结论:含人工麝香或天然麝香的安宫牛黄丸均可通过改善氧化应激损伤而对实验性脑缺血有保护作用,且二者作用未见显著差异。

关键词：安宫牛黄丸人工麝香天然麝香大脑中动脉栓塞模型大脑中动脉缺血再灌注模型

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刍议大鼠线栓法MCAO模型尚待完善之处

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中国中医基础医学杂志 2016年第1期22卷 44-46页

作者：曹泽标周小青余望贻陈娉婷刘旺华湖南中医药大学长沙410208

结合文献及实践认识,发现大鼠线栓法大脑中动脉栓塞(MCAO)模型存在一些尚待完善之处。通过加强相关生理参数的研究,改良或引进即时、客观和可重复的模型评价手段,深化模型的病证及论治探讨,重视造模后的营养支持及护理,必将极大地促进... 详细信息

结合文献及实践认识,发现大鼠线栓法大脑中动脉栓塞(MCAO)模型存在一些尚待完善之处。通过加强相关生理参数的研究,改良或引进即时、客观和可重复的模型评价手段,深化模型的病证及论治探讨,重视造模后的营养支持及护理,必将极大地促进模型的规范化,提高造模的成功率,降低大鼠死亡率,凸显中医辨证论治的特色,为缺血性中风病的实验研究奠定坚实的基础。

关键词：大脑中动脉栓塞模型生理参数模型评价辨证论治营养支持护理

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参附注射液作用机制的计算机系统生物学分析

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中国实验方剂学杂志 2015年第21期21卷 217-221页

作者：吕燕妮付龙生周健蔡军陈璿瑛钟海利南昌大学第一附属医院药学部南昌330046

目的:参附注射液是传统中药红参与附子的复方制剂,临床主适应症为充血性心力衰竭、缺血性脑卒中等。以缺血性脑卒中为导向,采用系统生物学和实验研究方法,对参附注射液调节生物学网络的分子机制做一阐释。方法:以参附注射液的28个成分出... 详细信息

目的:参附注射液是传统中药红参与附子的复方制剂,临床主适应症为充血性心力衰竭、缺血性脑卒中等。以缺血性脑卒中为导向,采用系统生物学和实验研究方法,对参附注射液调节生物学网络的分子机制做一阐释。方法:以参附注射液的28个成分出发,分别从TCMGene DIT数据库系统和Agilent literature search系统中挖掘参附注射液中成分作用的蛋白质数据,并辅助以Pharmmapper反向对接靶标,构建参附注射液多成分-蛋白网络,在Genecards,BIND,Bio GRID,Int Act,Mint等数据库中挖掘蛋白之间关联,建立蛋白相互作用网络。提取显著性差异蛋白子网络一个,并对其中通路以Western blot蛋白印迹方法加以验证。结果:参附注射液成分与55个蛋白有连接,构成53个无孤立结点的蛋白相互作用网络。应用Cluster One模块对蛋白相互作用网络富集分析,提取显著性差异P<0.05的子网络1个,子网络中含有关键蛋白15个,经Biocart信号通路映射,涉及NF-κB信号通路,AKT信号通路,Toll样受体信号通路,MAPK信号通路等。采取Western blot方法对富集指数P值最小的NF-κB信号通路进行验证,发现参附注射液在缺血1 h再灌注24 h的MCAO模型上对NF-κB p65和IκB-α的磷酸化表达有明显下调作用。结论:采用计算机系统生物学和实验验证方式初步阐释了参附注射液主要化合物防治疾病的分子机制,并以分子生物学实验方式对所预测的信号通路进行验证,为中药复方的系统研究提供参考。

关键词：计算机系统生物学参附注射液作用机制信号通路网络大脑中动脉栓塞模型

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丹红注射液对大鼠局灶脑缺血模型外周血内皮祖细胞及神经功能缺损的影响

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中国中医基础医学杂志 2014年第8期20卷 1059-1061,1064页

作者：刘冉邸丽李江郝洪军高枫孙葳黄一宁北京大学第一医院神经内科北京100034 北京宣武医院神经内科北京100053

目的:观察丹红注射液对大鼠局灶脑缺血模型后外周血内皮祖细胞数量及神经功能缺损的影响。方法:SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑梗死组(对照组)和脑梗死丹红注射液治疗组(丹红治疗组)。对照组和丹红治疗组采用线栓法建立左侧永久... 详细信息

目的:观察丹红注射液对大鼠局灶脑缺血模型后外周血内皮祖细胞数量及神经功能缺损的影响。方法:SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑梗死组(对照组)和脑梗死丹红注射液治疗组(丹红治疗组)。对照组和丹红治疗组采用线栓法建立左侧永久性大脑中动脉栓塞(permanent Middle cerebral artery occlusion,p-MCAO)模型。术后24 h±2 h、72 h±2 h、168 h±2 h抽取尾静脉血,通过流式细胞仪测定CD133+/VEGFR-2+双阳性细胞数量并进行神经功能缺损评分。结果:3组术前外周血CD133+/VEGFR-2+双阳性细胞数比较差异无统计学意义。丹红治疗组大鼠术后24 h、72 h、168 h外周血CD133+/VEGFR-2+双阳性细胞数百分率较对照组升高(64.60%(14.62%,82.32%)vs 1.38%(0.05%,24.14%),24.36%(7.38%,72.36%)vs 2.78%(0.09%,32.17%),4.53%(0.57%,11.16%)vs 0.46%(0.07%,0.98%),P<0.01)。丹红治疗组大鼠术后24 h、72 h、168 h神经功能评分较对照组低(2(1,4)vs 2.5(0,4),1(0,4)vs 2(0,4),0(0,1)vs 3(0,4))。结论:丹红注射液有可能提高脑梗死后外周血内皮祖细胞数目,具有改善神经功能缺损的作用。

关键词：大鼠大脑中动脉栓塞模型内皮祖细胞丹红注射液

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头穴丛刺法对脑卒中大鼠缺血半暗带CD34表达影响的研究

头穴丛刺法对脑卒中大鼠缺血半暗带CD34表达影响的研究

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作者：刘华北京中医药大学

学位级别：硕士

研究背景：急性缺血性脑卒中(Acute Ischemic Stroke, AIS)因为其高发病率、高死亡率、高致残率等因素,已经越来越被人们重视。对此,前人已做过大量的实验研究,但目前对于其恢复的机制尚不十分清楚。神经血管单元(Neurovascular Unit, N... 详细信息

研究背景：急性缺血性脑卒中(Acute Ischemic Stroke, AIS)因为其高发病率、高死亡率、高致残率等因素,已经越来越被人们重视。对此,前人已做过大量的实验研究,但目前对于其恢复的机制尚不十分清楚。神经血管单元(Neurovascular Unit, NVU)是最近几年研究的热点,强调神经元、血管内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、基质蛋白等之间作为一个整体,相互作用,动态的对疾病的病理生理学产生影响。本研究依托于国家自然科学基金课题“头穴丛刺法对脑缺血后神经血管单元重塑影响的机制研究”,旨在通过观察头穴丛刺治疗卒中后大鼠神经功能的评分变化及缺血半暗带区域血管新生表达情况的变化,借以阐述其病理变化过程及恢复机制。目的：观察头穴丛刺法对大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)大鼠神经功能评分的影响及缺血半暗带区域CD34微血管密度(Microvessel Density, MVD)表达的影响。方法：订购54只雄性SD大鼠,250-280g,随机分为模型组A、假手术组B、头穴丛刺组C,每组内又按治疗时长分为1d、7d、14d三个时间点。A、C组采用颈总动脉穿刺法制成MCAO模型,B组仅分离颈总动脉(Common Carotid Artery, CCA)。A、B组不做任何治疗,C组予头穴丛刺治疗,1次／日。三组均常规饲养。分别于术后4h、取材前进行神经功能评分。灌注固定后取鼠脑包埋、切片。用免疫荧光法对标本上的CD34抗原染色,并使用荧光显微镜观察MCAO大鼠缺血半暗带区域CD34微血管的表达。结果：1.神经功能评分4h时：A、C组与B组比较具有统计学意义(P<0.05),表明造模及分组成功；A与C组比较无统计学意义(P>0.05),表明具有可比性。1d时：C组神经功能评分略优于A组,但A、C两组比较无统计学意义(P>0.05),表明头穴丛刺治疗1次具有一定疗效,但未见明显差异。7d、14d时：A组与C组比较具有统计学意义(P<0.05),说明头穴丛刺治疗对MCAO大鼠的行为学症状具有明显的改善作用,对MCAO大鼠偏瘫肢体的运动功能恢复具有积极意义。2. CD34微血管密度1d时：A、c组CD34的MVD低于B组,但无统计学意义(P>0.05),可能是因为缺血半暗带区域大量血管缺血坏死,而新生的血管内皮细胞还未组成血管形态有关。而C组MVD略高于A组(P>0.05),说明早期头穴丛刺治疗,对缺血半暗带区域的血管的凋亡具有保护作用。7d时：C组MVD明显高于A组,具有统计学意义(P<0.05)说明头穴丛刺能够促进MCAO后大鼠缺血半暗带区域的血管新生。14d时：C组MVD持续升高,而A组MVD明显降低,且C组与A、B组相比具有统计学意义(P<0.05),说明针刺可延长血管新生的时间,促进血管新生。3.荧光显微镜下可见梗死区几乎无血管新生,新生的血管密集分布于缺血半暗带周围,血管形态扭曲不规则,并向梗死区包围。结论：1.头穴丛刺法能够改善MCAO大鼠的行为学症状,促进肢体运动功能的恢复。2.头穴丛刺法能够提高MCAO大鼠缺血半暗带的微血管密度,促进血管新生。

关键词： CD34 大脑中动脉栓塞模型免疫荧光脑卒中头穴丛刺微血管密度

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骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的实验研究

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的实验研究

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作者：行治国昆明医学院

学位级别：硕士

目的:以改良的Zea-longa线栓法阻断大脑中动脉建立SD大鼠脑梗死模型,分别经颈内静脉、颈内动脉输注和立体定向脑室注射三种途径行骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植,通过对比移植前后大鼠神经功能评分,脑梗死面积测量,以及移植后MSCs存活、... 详细信息

目的:以改良的Zea-longa线栓法阻断大脑中动脉建立SD大鼠脑梗死模型,分别经颈内静脉、颈内动脉输注和立体定向脑室注射三种途径行骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植,通过对比移植前后大鼠神经功能评分,脑梗死面积测量,以及移植后MSCs存活、分布情况,探讨骨髓间充质干细胞在受损脑组织的存活数量、迁移、分布规律以及对受损伤神经元修复的可能机制,同时对比三种不同的移植方式对大鼠脑梗死治疗效果的差别。方法:①细胞来源和培养:经绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记SD大鼠骨髓间充质干细胞,为本实验室前期建立的细胞株,经复苏后采用贴壁法培养。②大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性鉴定:倒置相差显微镜下观察细胞生长及形态,免疫细胞化学染色鉴定细胞表面标记物CD29、CD34、CD44的表达。③以改良的Zea-longa线拴法制作大鼠脑梗死的实验模型,TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride)染色法鉴定大鼠脑梗死部位并测量其面积。④移植及评测:分别采用颈内静脉、颈内动脉输注和立体定向脑室注射三种途径,分别于大鼠脑梗死后第3天移植骨髓间充质干细胞。移植前后均行大鼠神经功能评分。⑤移植后取大鼠脑组织切片,荧光显微镜下观察荧光细胞的存活数量、迁移和分布规律。结果:①骨髓间充质干细胞生物学鉴定:倒置相差显微镜下观察绿色荧光蛋白标记过骨髓间充质干细胞(GFP-BMSCs),复苏后4小时开始贴壁,12小时有少量圆形细胞贴壁,24小时贴壁细胞明显增多,部分细胞伸出伪足变为梭形,第3天细胞呈现克隆性生长,呈BMSCs特征性的旋涡状生长,细胞呈现均一的绿色,阳性标记率高达99%。免疫组化鉴定细胞CD34染色均呈阴性,而CD29、CD44染色阳性细胞＞98%。②神经功能评分:以1-3分为入选标准。骨髓间充质干细胞移植的大鼠,神经功能状况评分明显低于生理盐水对照者;在三种移植方法中,立体定向脑室注射移植组神经功能评分最低,其次是颈内动脉移植组,颈内静脉移植组较高。③荧光显微镜下观察移植后的脑组织切片:三种移植方式的BMSCs均能够迁移至大鼠脑损伤区。立体定向脑室注射移植组中荧光细胞最多,其次是经颈内动脉注射组,经颈内静脉移植组则最少;立体定向脑室注射移植组中荧光细胞分布于梗死灶周围和中心,能够迁移至皮层的最外侧且数量多,与宿主脑组织整合好,未见排斥现象。结论:①骨髓间充质干细胞移植对脑梗死后大鼠神经功能的恢复具有明显的促进作用。②移植入脑梗死大脑的BMSCs能够在受损脑组织中存活、迁移,受损伤的脑组织周围分布最多。③在不同的移植方式中,立体定向脑室注射移植组中存活的细胞数量最多且分布广,能够分布至皮质边缘区域。

关键词：骨髓间充质干细胞脑梗死大脑中动脉栓塞模型移植

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羟基红花黄色素A配伍远志皂苷元改善脑缺血损伤的作用机制研究

羟基红花黄色素A配伍远志皂苷元改善脑缺血损伤的作用机制研究

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作者：张成华东师范大学

学位级别：硕士

近年来,缺血性脑卒中的发病率升高并呈现年轻化的趋势,成为最具威胁人类健康的疾病之一。本课题针对缺血性脑卒中开展基于中药活性成份的药理学研究,我们前期研究结果发现,羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A,HSYA)在8mg/kg、16mg... 详细信息

近年来,缺血性脑卒中的发病率升高并呈现年轻化的趋势,成为最具威胁人类健康的疾病之一。本课题针对缺血性脑卒中开展基于中药活性成份的药理学研究,我们前期研究结果发现,羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A,HSYA)在8mg/kg、16mg/kg浓度下对脑缺血损伤有较好治疗效果,但在16mg/kg剂量下不良反应多,4mg/kg剂量下疗效不明显。因此,我们结合临床上红花或远志的复方疗效研究,依据中医“痰瘀同治”理论,选择并研究化痰药远志皂苷元(Tenuigenin,TEN)单体配伍活血化瘀药HSYA单体对缺血性脑卒中的药理作用及其作用机制。研究采用线栓阻塞大脑中动脉(MCAO)大鼠模型、糖氧剥夺/复氧(OGD/R)细胞模型,通过行为学、分子生物学等多种实验手段,从体内体外不同层面研究HSYA与TEN联合用药对于脑缺血损伤的改善作用,发现两药配伍药效明显优于HSYA或TEN单独用药的疗效。因脑缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)会引起强烈的炎症反应,我们将HSYA或TEN的作用机制研究集中在炎症相关的JAK2/STAT3/SOCS3信号通路,并通过基因沉默等手段探究两中药单体的可能药靶。主要实验结果如下:***配伍TEN治疗脑缺血损伤的药效学及其通路研究体内实验部分,我们构建大鼠MCAO模型以模拟临床脑缺血损伤,并优化模型以提高模型稳定性、降低术后死亡率,缺血90分钟/再灌注90分钟(时间窗:3小时)后经颈动脉给药。采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、苏木精-伊红(HE)等染色实验评估模型稳定性并根据Longa评分标准筛选出合适的大鼠模型用于后续实验。通过TTC染色、脑组织含水量测定、尼氏染色、行为学(神经功能评分、旷场实验、被动回避实验)评估HSYA、TEN单独用药和配伍的药效,包括病灶改变、神经元形态变化、肢体运动和学习认知改善。通过蛋白免疫印迹(Western blotting)实验检测给药后炎症相关信号通路上的蛋白变化。实验结果表明:1)优化的MCAO模型在稳定性和死亡率方面控制较好,能进行后续实验并供研究者参考。2)HSYA、TEN能降低缺血病灶体积、降低脑组织含水量、改善神经元形态、改善肢体运动和学习认知能力,并且配伍组药效优于单独用药组。3)HSYA、TEN抑制JAK2/STAT3信号通路激活,促进SOCS3表达,且配伍组蛋白变化更明显。***配伍TEN改善OGD/R模型损伤的细胞保护作用及其分子机制研究体外实验部分,我们构建SH-SY5Y细胞OGD/R模型以模拟脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。通过CCK8实验检测HSYA、TEN在不同浓度对OGD/R模型细胞活力的影响,并确定后续实验的药物浓度。通过TUNEL实验,研究各用药组对于细胞凋亡的影响。通过酶联免疫吸附实验测定促炎因子IL-6,研究各用药组对细胞炎症反应的影响。通过沉默SOCS3研究各单独用药组细胞活力的变化。通过在线工具预测HSYA的药物靶点。通过Western blotting测定各用药组炎症相关通路上的蛋白变化以及干扰SOCS3后TEN用药组的蛋白变化。实验结果表明:1)HSYA、TEN能够改善OGD/R模型的细胞活力,抑制炎症反应,减少细胞凋亡,且配伍组药效优于单独用药组。2)HSYA可能通过过度激活JAK2磷酸化,引起下游SOCS3负反馈,抑制炎症相关信号通路JAK2/STAT3激活,从而对OGD/R模型产生神经保护作用。3)TEN可能通过直接激活SOCS3,负反馈抑制JAK2/STAT3信号通路,从而对OGD/R模型产生神经保护作用。4)HSYA、TEN可能通过协同激活SOCS3,产生负反馈作用共同抑制JAK2/STAT3通路激活,减缓炎症反应,改善神经元活性。综上所述,HSYA、TEN通过协同作用改善脑缺血损伤,发挥神经保护作用。研究结果初步阐明了临床上常用两味中药的单体提取物HSYA、TEN在CIRI中发挥作用的分子机制,补充了红花类、远志类中草药治疗缺血性脑卒中的理论依据。首次将HSYA配伍TEN用于治疗缺血性脑卒中,充实了“痰瘀同治”理论,其改善脑缺血损伤的潜在分子机制为治疗该病提供新药靶,对临床具有重要指导价值。

关键词：脑缺血损伤大脑中动脉栓塞模型糖氧剥夺/复氧模型羟基红花黄色素A 远志皂苷元痰瘀同治配伍药效学 JAK2/STAT3/SOCS3通路

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铁皮石斛多糖对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化及MCAO模型大鼠预后的影响

铁皮石斛多糖对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化及MCAO模型大鼠...

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作者：刘雪安徽医科大学

学位级别：硕士

目的本研究旨在探讨我国传统中药-铁皮石斛,其主要成分-铁皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharide,DOP)对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经样细胞分化的影响,及其对大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠功能预后的作用,以期为脑卒中的治疗提供新策略。方法实验一:新鲜铁皮石斛原球茎经干燥、粉碎后,采用水提醇沉法对其主要成分-铁皮石斛多糖进行提取,应用苯酚-硫酸法对经上述提取的铁皮石斛多糖进行含量测定。实验二:采用密度梯度离心法对提取的骨髓间充质干细胞进行分离、纯化。培养至P3-P4代时,应用流式细胞技术对骨髓间充质干细胞进行鉴定(检测标记物为CD90,CD44,CD34)。将提取的铁皮石斛多糖配制成不同浓度(10,25,50,75,100μg/ml)的铁皮石斛多糖溶液,与P3-P4代骨髓间充质干细胞共培养7天,同时设置对照组;通过RT-PCR(real time-polymerase chain reaction)检测神经分化相关标记物nestin,MAP2,VEGF-A mRNA在各组中的表达水平并筛选出最佳浓度;应用Western blot检测神经分化相关标记物Enolase,Thy-1,β-tubullinⅢ在各组中的表达情况,应用免疫荧光染色技术检测神经分化相关标记物CD24,Thy-1在各组中的表达情况,以评价铁皮石斛多糖对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响。实验三:80只雄性SD大鼠随机分为假手术组、MCAO模型组、BMSCs组、神经样细胞组。MCAO建模后24h,给予神经样细胞组病灶侧侧脑室定点注射经铁皮石斛多糖诱导后的神经样细胞,BMSCs组给予等量的BMSCs,MCAO组及假手术组给予等量的生理盐水。分别在注射后的第1,4,7,14天对比各组大鼠改良神经系统严重程度评分(modified Neurologic Severity Scores,m NSS);第14天,应用脑组织TTC染色、ELISA法分别对比各组大鼠脑梗死体积和血清炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的水平。结果实验一:经检测,铁皮石斛内物质的提取率为17.04%,提取物中多糖含量为89%。实验二:(1)大鼠BMSCs表面CD90的表达率为96.79%,CD44的表达率98.27%,CD34的表达率2.64%,证实所提取的细胞即BMSCs。(2)不同浓度铁皮石斛多糖(10,25,50,75,100μg/ml)组nestin mRNA的表达水平均显著高于对照组(阴性对照组、阳性对照组);不同浓度组间比较,其中25μg/ml组nestin mRNA表达水平显著高于10,50,75,100μg/ml组。mRNA(MAP2,VEGF-A)表达趋势与nestin mRNA的表达一致。这表明铁皮石斛多糖具有增强BMSCs向神经样细胞分化的作用,并且25μg/ml是最佳浓度。后续实验即以最佳浓度25μg/ml开展。(3)Western blot和荧光染色结果显示Enolase,Thy-1,β-tubullinⅢ,CD24在阴性对照组、阳性对照组、铁皮石斛多糖组均呈现依次递增趋势。实验三:m NSS结果显示神经样细胞组在定点注射后第4,7,14天均较MCAO模型组明显减少,第14天时,神经样细胞组m NSS明显小于BMSCs组。TTC染色结果显示MCAO模型建立后,脑梗死体积明显增加,定点注射后,BMSCs组和神经样细胞组脑梗死体积均较MCAO模型组明显减小,且神经样细胞组脑梗死体积显著小于BMSCs组。ELISA结果显示MCAO模型建立后,三种炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的表达水平均升高,定点注射后,BMSCs组和神经样细胞组三种炎症因子的表达均较MCAO模型组显著降低,且神经样细胞组三种炎症因子的水平均明显低于BMSCs组。结论1.铁皮石斛多糖对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化具有促进作用,且最佳的作用浓度为25μg/ml。2.经铁皮石斛多糖诱导后的神经样细胞对脑缺血-再灌注损伤大鼠的神经功能恢复具有促进作用,机制可能与降低模型鼠体内炎症因子的表达有关。

关键词：铁皮石斛多糖骨髓间充质干细胞神经样细胞大脑中动脉栓塞模型预后

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复方丹蛭片体内化学成分及药代动力学研究

复方丹蛭片体内化学成分及药代动力学研究

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作者：米楠中国医药工业研究总院

学位级别：硕士

复方丹蛭片是由黄芪、丹参、水蛭、地龙、川芎等五味药材按15:12:3:10:6的比例配伍、精制而成。该中药复方口服片剂具有益气活血、化瘀通络的功效,常被用于缺血性脑卒中的治疗,临床应用多年,且疗效显著。然而,复方丹蛭片经口服进入体内... 详细信息

复方丹蛭片是由黄芪、丹参、水蛭、地龙、川芎等五味药材按15:12:3:10:6的比例配伍、精制而成。该中药复方口服片剂具有益气活血、化瘀通络的功效,常被用于缺血性脑卒中的治疗,临床应用多年,且疗效显著。然而,复方丹蛭片经口服进入体内的有效物质及其主要成分在体内的量时变化规律尚未得到阐释,限制了该方作用机制的深入研究,更阻碍了其产业化的发展。本课题以“复方丹蛭片”为研究对象,基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）分析平台,结合智能化分析软件,立足于中药复方药效物质基础,开展对大鼠口服复方丹蛭片后血浆和脑脊液中移行成分全面系统的表征;并基于大鼠脑梗模型组和假手术组对9个主要化学成分在体内的药动学行为进行了比较。课题明确复方丹蛭片的药效物质基础,从而为其作用机制的研究提供科学的数据支持。具体研究内容如下:1.复方丹蛭片的血清药物化学研究本章基于代谢组学思想,以血清药物化学理论为指导,首次建立UPLC-QTOF/MS分析方法,结合UNIFI和多元统计分析软件,对大鼠口服复方丹蛭片后的血中原型成分及代谢产物进行全面表征。首先,建立复方丹蛭片提取物的化学成分数据库,经UNIFI匹配分析后鉴定入血原型成分;其次,利用UNIFI软件对复方中的化合物进行代谢产物预测,并进行匹配分析;第三,利用Progenesis QI和Ezinfo软件对含药血浆和空白血浆进行正交偏最小二乘法-判别（Orthogonal partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA）差异性分析,快速筛选出潜在的目标分析物;最后,将待分析的目标成分归属到单味药材的含药血浆中,通过保留时间、质荷比及碎片离子等信息对化合物进行解析。最终从大鼠口服复方丹蛭片后的血浆中共鉴定移行成分170个,包括51个原型成分和119个代谢产物;分为黄酮类、丹参酮类、苯酞内酯类、酚酸类、呋喃磺酸类和其他类,并推测了相应的代谢途径。以上研究建立了一种快速、全面筛选复杂生物基质中目标成分的方法,首次鉴定大鼠口服复方丹蛭片后血中的移行成分,为后续药代动力学的研究及其作用机制的阐明奠定了基础。2.复方丹蛭片的脑脊液药物化学研究本章在已鉴定的血中移行成分的基础上,以脑脊液药物化学理论为指导,结合UPLC-QTOF/MS技术,首次开展对大鼠口服复方丹蛭片后透过血脑屏障的成分的定性分析研究。通过提取离子色谱（Extracted-ion chromatography,EIC）,筛选空白脑脊液和含药脑脊液中的差异性成分,并将其与含药血浆图谱比对,最终共鉴定了31个入脑成分,包括17个原型成分和14个代谢产物。结果显示,黄酮类、丹参酮类、苯酞内酯类和呋喃磺酸类成分是大鼠口服复方丹蛭片后的主要入脑成分。研究建立了一种灵敏、准确且可用于体内微量成分检测的分析方法,首次鉴定复方丹蛭片透过血脑屏障的成分,为网络药理学研究提供数据支持,也为药代动力学研究目标成分的选取提供了参考。3.复方丹蛭片在大脑中动脉栓塞模型组和假手术组的药代动力学比较研究本章在以上研究的基础上,选取9个具有明确药理活性的目标分析物,采用大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,首次探索性地比较MCAO模型组和假手术组的大鼠灌胃复方丹蛭片（4 g/kg大鼠体重）后药动学参数的差异。血浆样品选用乙腈沉淀蛋白的样品前处理方法,基于正、负扫描的多反应监测（Multiple reaction monitoring,MRM）模式进行梯度洗脱。正模式下选用芦荟大黄素为内标,分别测定血浆中的三个黄酮类（芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素）,一个苯酞类（川芎内酯I）和四个丹参酮类（二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA）,分析时间10 min;负模式下选用异嗪皮啶为内标,测定血浆中的5-乙基-2-己基呋喃-3-磺酸,分析时间5 min。所建立的方法专属性强、灵敏度高。基于非房室模型,采用DAS 2.0软件计算PK参数,结果表明,9个生物活性成分的某些药动学参数在MCAO模型组和假手术组有显著的差异。相比于假手术组,芒柄花苷、二氢丹参酮I和丹参酮I在MCAO模型组的AUC0-t和AUC0-∞较高,而隐丹参酮和丹参酮IIA在MCAO模型组的AUC0-t和AUC0-∞较低;川芎内酯I在MCAO模型组的Cmax和Tmax较大;5-乙基-2-己基呋喃-3-磺酸在MCAO模型组的AUC0-t和AUC0-∞较低;而芒柄花素和毛蕊异黄酮在两组之间没有显著差异。研究首次建立测定MCAO模型组和假手术组的大鼠口服复方丹蛭片后9个活性成分的血药浓度的方法,为指导临床合理用药及提高药物疗效提供了科学依据。综上,本论文首次建立了对大鼠口服复方丹蛭片后血浆和脑

关键词：复方丹蛭片血清药物化学脑脊液药物化学药代动力学大脑中动脉栓塞模型

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