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范例一：(K=图书馆学 OR K=情报学) AND A=范并思 AND Y=1982-2016
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文献类型

2 篇 学位论文

馆藏范围

2 篇 电子文献
0 种 纸本馆藏

日期分布

学科分类号

1 篇 农学
- 1 篇 植物保护
1 篇 医学
- 1 篇 临床医学

主题

2 篇 实时免疫荧光定量...
1 篇 草甘膦
1 篇 喉癌
1 篇 基因芯片
1 篇 表观遗传
1 篇 荧光免疫分析方法
1 篇 络氨酸激酶受体b
1 篇 寡聚核苷酸功能化...
1 篇 荧光共振能量转移

机构

1 篇 西南医科大学
1 篇 吉林大学

作者

1 篇 关乃瑜
1 篇 邹武君

语言

2 篇 中文

检索条件"主题词=实时免疫荧光定量PCR"

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详细简洁

排序：

基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究

基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究

引用

作者：关乃瑜吉林大学

学位级别：博士

草甘膦（glyphosate,GLYP）是由美国孟山都公司在二十世纪60年代开发一种非选择性广谱除草剂。自2005年以来,GLYP的销量稳居全球农药销售排行榜首位。1995年首株GLYP抗性大豆系培育成功,此后GLYP的生产量与使用量逐年锐增。目前,GLYP已... 详细信息

草甘膦（glyphosate,GLYP）是由美国孟山都公司在二十世纪60年代开发一种非选择性广谱除草剂。自2005年以来,GLYP的销量稳居全球农药销售排行榜首位。1995年首株GLYP抗性大豆系培育成功,此后GLYP的生产量与使用量逐年锐增。目前,GLYP已成为世界上应用最广、生产量最大的除草剂,也是目前我国使用量最大的除草剂。GLYP的长期大量施用导致环境及农作物中具有高水平的GLYP残留,对生态环境和人类健康构成了严重的威胁。2015年,世界卫生组织国际癌症研究机构将GLYP归类为2A类致癌物,即对人类可能致癌的物质。所以开发快速、灵敏、高效的GLYP检测技术对于保障农产品食品安全至关重要。GLYP的传统检测方法主要以色谱技术为主,尽管该方法具有较高检测灵敏度,但仍存在样品前处理步骤复杂,分析成本高,检测周期长和仪器设备昂贵等不足。因此,开发选择性好、灵敏度高、方便、价格低廉的GLYP快速检测方法是保障食品安全的迫切需求。与其他检测技术相比,免疫学检测技术具有检测周期短、成本低、操作简便等优势。然而,现有的GLYP免疫学检测方法则以传统的酶联免疫分析方法（ELISA）为主,相比于色谱法等仪器分析方法,ELISA的检测灵敏性较低。近年来,随着新型纳米材料和生物酶的出现,免疫分析技术快速发展,已经成为一个融合纳米技术、酶工程和基因工程等其他多学科交叉的新型分析技术,为开发更加快速、灵敏、特异的免疫学分析方法提供了新的观点和思路。基于生物功能化纳米粒子材料的新型免疫分析技术,可进一步提高免疫学检测方法的灵敏性和稳定性,弥补现有的GLYP免疫学检测方法灵敏性低、检测步骤多、检测方法单一等不足。本课题旨在结合免疫学检测技术、荧光分析技术和分子探针标记技术,利用寡聚核苷酸和金纳米粒子（AuNPs）在生物传感领域的应用优势,以ELISA检测为基础建立基于寡聚核苷酸纳米结构功能化AuNPs探针的新型GLYP免疫学检测方法。以期提高GLYP免疫学检测方法的检测水平,实现更加灵敏、快速、经济的GLYP检测。同时探究聚核苷酸功能化AuNPs探针在GLYP等小分子物质检测中的应用潜力。本论文的具体工作内容和结论如下:***完全抗原的合成和鉴定。分别采用活化酯法和混合酸酐法合成了GLYP的免疫抗原（BSA-GLYP）和检测抗原（OVA-GLYP）。通过UV-Vis光谱扫描、琼脂糖电泳和Native-PAGE对合成的完全抗原进行分析鉴定,通过比较不同免疫抗原免疫鼠的血清的效价及抑制率,选择具有较高血清效价和抑制率的c BSA-聚醚胺-GLYP用于制备多克隆抗体。***多克隆抗体的制备与鉴定。采用AKTA蛋白纯化系统和A蛋白抗体纯化柱对兔血清中的GLYP抗体进行纯化,并对抗体的浓度、纯度、效价和亲和力进行测定。结果显示,抗体效价为1:256000,抗体的亲和力常数为3.68×10～9 L mol-1,属于高亲和力抗体。***-ELISA检测方法的建立。利用制备的兔抗GLYP多克隆抗体建立检测GLYP的ic-ELISA方法。线性检测范围为0.125 mg m L-1～4 mg m L-1,最低检测限为139.9μg m L-1。建立的ic-ELISA方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率分别为0.61%、0.003%和0.014%,食品样品中的回收率在97.1%～99.9%之间,检测时间为3 h。4.基于AuNPs-TDNs纳米耀斑探针的间接竞争荧光免疫分析方法（AuNP-TDNs-ic-FLIA）的建立。用羊抗兔抗体和荧光染料SYBR Green I（SG）染色的四面体DNA（TDNs）同时修饰AuNPs,制备初始荧光被AuNPs通过FRET作用淬灭的具有可控荧光开启功能的AuNP-TDNs纳米耀斑探针（AuNP-TDNs nanoflare probe）,利用AuNPs的尺度效应及较大的比表面积实现对检测信号的放大。采用TEM、UV-Vis扫描光谱和荧光光谱对制备的探针进行表征,随后基于探针建立检测GLYP的间接竞争荧光免疫分析方法（ic-FLIA）。向包被OVA-GLYP的酶标板中加入GLYP抗体与待检样品混合物后进行孵育,此时样品中的GLYP与酶标板中的OVA-GLYP竞争结合GLYP抗体。洗板后加入AuNP-TDNs纳米耀斑探针进行孵育。再次洗涤后,加入二硫苏糖醇（DTT）释放探针上的耀斑DNA（TDNs-SG）,实现荧光的恢复。结果显示,该方法的检测范围为0.5μg m L-1～32μg m L-1,最低检测线为0.18μg mL-1。灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA方法提高了约700倍。方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率均小于0.01%,食品样

关键词：草甘膦寡聚核苷酸功能化金纳米粒子探针荧光共振能量转移荧光免疫分析方法实时免疫荧光定量pcr

来源：评论

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TrkB调节喉癌侵袭转移相关基因的筛选

TrkB调节喉癌侵袭转移相关基因的筛选

引用

作者：邹武君西南医科大学

学位级别：硕士

目的:利用人类基因芯片表达谱技术筛选出喉癌细胞中与Trk B调节侵袭转移相关的下游基因,为进一步探索Trk B在喉癌中的病理机制奠定实验基础。方法:(1)细胞的分组:本课题组通过前期研究成功获取稳定沉默的Hep-2Trk B shRNA细胞株。将实... 详细信息

目的:利用人类基因芯片表达谱技术筛选出喉癌细胞中与Trk B调节侵袭转移相关的下游基因,为进一步探索Trk B在喉癌中的病理机制奠定实验基础。方法:(1)细胞的分组:本课题组通过前期研究成功获取稳定沉默的Hep-2Trk B shRNA细胞株。将实验细胞分为两组,其中包括实验组:sh NTRK2-1、sh NTRK2-2、sh NTRK2-3和对照组:PLKO1-1、PLKO1-2、PLKO1-3。(2)利用人类基因表达芯片谱筛选实验组与对照组之间的差异表达基因,以|log2(Ratio)|>=2和P-value(Differentially expressed)<0.05为标准挑选出存在显著差异表达的基因。(3)Real-time pcr验证:随机选取差异基因中上调基因10个和下调基因10个,利用Real-time pcr在实验组和对照组中验证这些差异基因的表达情况,明确差异基因结果是否符合人类基因表达芯片谱筛选结果。(4)喉癌侵袭转移相关基因的筛选:利用生物信息学技术,通过GO分析对差异表达基因从分子功能、生物学过程、细胞组分三个层面进行功能分类;利用KEGG数据库进行信号通路富集分析。结合GO和KEGG分析结果确定与喉癌侵袭转移相关的基因,并用Real-time pcr法检测相关基因在实验细胞中的表达情况。(5)喉癌侵袭转移相关最佳基因的确定:通过GO和KEGG分析筛选出候选下游基因,进一步利用TCGA数据库对候选下游基因进行生物信息学分析并选出最有意义的基因,为下一步探讨Trk B在喉癌中的病理机制奠定基础。结果:(1)人类基因表达芯片谱筛选出Hep-2 Trk B shRNA细胞株显著差异表达基因318个。在差异基因中,87个属于高表达,231个属于低表达。(2)Real-time pcr检测CHI3L1、COL8A1、DMKN、DNER、FGG、FHL1、FMOD、FOXN4、GGNBP1、HOXB9、IGFBP1、IRF5、ISM1、LINC01133、NPAS4、RGS2、TARP、TNFAIP6、TRPS1、ABCB1在实验细胞中的表达情况。RT-pcr结果中差异基因表达趋势与芯片结果一致,60%基因有统计学意义。同时,基因原始差异值越大,RT-pcr结果差异性越明显。因此,RT-pcr结果证实基因芯片结果可靠,可用于进一步实验。(3)利用GO和KEGG数据库从多个层面分析差异基因。GO分析结果提示:在生物学过程方面,差异基因主要富集在受体介导的内吞作用、细胞基质粘附、神经元突触可塑性的调节、脊髓发育等生物学过程。在分子功能方面,差异基因主要参与调节氧化还原酶活性、细胞骨架蛋白结合、α-淀粉酶活性等分子功能。在细胞组分方面,差异基因主要富集在质膜、囊泡腔、血小板α颗粒、核周内质网膜、VIII型胶原三聚体等分子成分。KEGG分析结果证实:差异基因主要富集在补体和凝血级联、非小细胞肺癌、非酒精性脂肪肝疾病、TRP通道的炎性介质调节、金黄色葡萄球菌感染、碳水化合物的消化吸收、血小板活化、B细胞受体信号通路、AMPK信号通路、PPAR信号通路、VEGF信号通路、Jak-STAT信号通路、HIF-1信号通路、FcγR介导的吞噬作用等信号通路。结合GO和KEGG分析结果,选出HOXB9、FHL1、DNER、FOXN4、COL8A1继续进行实验。经过RT-pcr验证:在实验组与对照组中,上述候选下游基因均呈差异表达,与基因芯片结果一致。(4)将上述基因进一步于TCGA数据库进行生物信息分析,结果提示:在头颈肿瘤中,COL8A1在调控侵袭转移相关通路上发挥重要作用;DNER主要富集在多种代谢活动相关信号通路;HOXB9主要富集在IL-17及细菌感染相关信号通路;FHL1主要富集在心脏疾病相关通路。COL8A1、DNER在头颈均呈高表达。因此,最终确定COL8A1、DNER作为Trk B的下游基因继续探究其在喉癌中的病理机制。结论:(1)利用基因芯片技术成功筛选出在Hep-2细胞株中Trk B表观遗传修饰的差异基因,提示Trk B可能通过介导下游基因的表达,进而在喉癌侵袭转移中发挥重要作用。(2)利用生物信息学技术成功筛选出HOXB9、FHL1、DNER、FOXN4、COL8A1五个与喉癌侵袭转移相关的下游基因,通过TCGA数据库分析后最终确定COL8A1、DNER作为最佳靶基因,为探讨Trk B在喉癌中的机理提供线索。

关键词：喉癌络氨酸激酶受体B 表观遗传基因芯片实时免疫荧光定量pcr

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