检索结果-内蒙古大学图书馆

军事医学 2019年第6期43卷 442-447页

作者：宾蕾邓慧敏李正超毕玉晶邓仲良南华大学公共卫生学院湖南衡阳417000 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071 衡阳市健康危害因子检验检疫新技术研究重点实验室湖南衡阳421001

目的运用实时细胞分析(RTCA)法和MTT法检测干酪乳杆菌(***)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)的细胞毒性,并比较两者优缺点。方法将***及EHEC的菌液、菌体裂解液(MOI=200)以及上清液(25%)感染HT-29和LoVo细胞,经RTCA法和MTT法观察细菌对细胞的... 详细信息

目的运用实时细胞分析(RTCA)法和MTT法检测干酪乳杆菌(***)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)的细胞毒性,并比较两者优缺点。方法将***及EHEC的菌液、菌体裂解液(MOI=200)以及上清液(25%)感染HT-29和LoVo细胞,经RTCA法和MTT法观察细菌对细胞的校正细胞指数(NCI)及细胞活力的影响。结果RTCA法与MTT法结果一致,***的活菌、菌体裂解液对HT-29细胞和LoVo细胞无明显毒性。EHEC的活菌对HT-29细胞和LoVo细胞有明显毒性,其菌体裂解液对HT-29细胞有明显毒性、对LoVo细胞无明显毒性。在上清液实验中,RTCA法检测出***和EHEC对HT-29细胞无明显毒性,而LoVo细胞受培养基影响未能正确反映出上清液细胞毒性结果。结论与MTT法相比,RTCA法更适于细菌细胞毒性检测,但应在实验前选择合适的细胞系及种植浓度,建议在选用RTCA法检测细胞毒性时选择两种或两种以上细胞系,多方验证以避免漏检。

关键词：实时细胞分析 MTT 干酪乳杆菌肠出血性大肠杆菌细胞毒性

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钙影响鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用的实验研究

钙影响鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用的实验研究

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作者：陈懿浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的二价金属离子虽已被证实在控制鲍曼不动杆菌生物膜形成以及病原微生物毒力方面占据重要地位,但是钙影响细菌-细胞相互作用机制尚有待明确。本研究拟探索分析鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞的动态相互作用过程以及钙对鲍曼不动杆... 详细信息

目的二价金属离子虽已被证实在控制鲍曼不动杆菌生物膜形成以及病原微生物毒力方面占据重要地位,但是钙影响细菌-细胞相互作用机制尚有待明确。本研究拟探索分析鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞的动态相互作用过程以及钙对鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用的可能影响,并从纳米微观层面对活体生物样本表面进行高分辨探测,为鲍曼不动杆菌定植或感染防控研究提供思路。方法通过倒置显微镜、实时细胞分析和定量PCR技术观测研究:①鲍曼不动杆菌在不同感染复数、细菌细胞共培养不同时间点以及不同细胞培养状态下对人呼吸道上皮细胞形态与增殖的影响,评价鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞的相互作用,并从中确定合适的细菌感染复数(MOI)以及细菌细胞共培养时间段;②通过改变钙的加入浓度和作用时间分析评价其对鲍曼不动杆菌增殖、相关基因mRNA表达、细菌粘附感染力、人呼吸道上皮细胞形态与增殖以及细菌细胞相互作用(包括细菌生物膜形成、粘附/侵袭细胞等)的可能影响。另外,构建绿色荧光蛋白标记鲍曼不动杆菌菌株,通过扫描离子电导显微镜和激光共聚焦显微镜联用技术实现对呼吸道上皮细胞表面纳米微观层面的高分辨探测和形貌成像。结果①确定细菌细胞共培养4h以及感染复数50:1所对应的细菌浓度用于后续研究。随MOI的增加,鲍曼不动杆菌粘附感染人呼吸道上皮细胞的数量也逐渐增加。鲍曼不动杆菌感染诱发细胞生长指数(CI)升高并伴随之后的下降过程,在感染初期,低浓度的鲍曼不动杆菌对细胞生长可能有刺激作用。随着MOI的减小,到达CI峰值的时间逐渐推迟,且峰值也越高,感染过程中出现独特的“双峰现象”(MOI越小,现象越明显)。②外源性加钙可能对鲍曼不动杆菌的增殖以及人呼吸道上皮细胞的贴壁生长起促进作用,并对鲍曼不动杆菌相关基因mRNA的表达有影响,主要表现为促进abaI、ompA基因mRNA表达,而对bap、carO、bfmR/S基因mRNA表达起抑制作用。另外,钙对鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用有影响,细菌感染细胞时,随培养液中钙浓度的增加,CI上升越快、峰值越高,其刺激生长作用越显著(表现为协同效应),并随着作用时间的推移CI急速下降(钙浓度越大,CI下降越快),感染过程中出现尖锐的“单峰现象”。钙浓度越大、作用时间越长,鲍曼不动杆菌粘附感染人呼吸道上皮细胞的数量就越多。③初步构建了绿色荧光蛋白标记鲍曼不动杆菌菌株(因表达荧光强度弱还需改造优化),成功扫描获得人呼吸道上皮细胞表面纳米微观层面形态图像。结论钙对鲍曼不动杆菌与人呼吸道上皮细胞相互作用有影响,可增加鲍曼不动杆菌对人呼吸道上皮细胞的粘附和侵袭,从而进一步加重细菌对细胞的感染。钙浓度越大(尤其是高钙情况下)、作用时间越长,细胞受细菌粘附感染程度就越严重。由此推测降低或抑制钙浓度对鲍曼不动杆菌定植或感染可以起到防控作用,从而可为多重耐药鲍曼不动杆菌预防及治疗提供新思路。

关键词：鲍曼不动杆菌钙细菌-细胞相互作用粘附感染实时细胞分析

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利用hiPSC-CM评价莫西沙星和左氧氟沙星与抗心律失常药物联用的心脏毒性风险

利用hiPSC-CM评价莫西沙星和左氧氟沙星与抗心律失常药物联用的心...

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中国毒理学会药物毒理与安全性评价学术大会（2019年）暨粤港澳大湾区生物医药产业第一届高峰论坛

作者：颜玉静文海若任璐黄芝瑛王雪中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室中山大学药学院

目的:利用诱导多能干细胞分化的心肌细胞(Human Induced pluripotent stem cell derived cardiacmyocytes,hiPSC-CM)和阻抗分析平台实时细胞分析系统(xCELLigence Real-Time Cell Analyze Cardio system,RTCA)建立体外药物心脏毒性评价模型,评价喹诺酮类抗生素莫西沙星和左氧氟沙星与抗心律失常药物奎尼丁、普鲁卡因胺和胺碘酮联用的心脏毒性风险。方法:hiPSC-CM复苏后接种于RTCA Cardio E-Plate 96孔板,细胞搏动72h后,分别给予不同浓度的莫西沙星和左氧氟沙星,观察并根据hiPSC-CM的细胞指数(Cell Index,CI)、搏动频率(Beating Rate,BR)等指标对两者毒性浓度进行筛选。分别选择莫西沙星和左氧氟沙星无毒性浓度和有毒性浓度对hiPSC-CM预处理48h,以0.1%DMSO为阴性对照。之后分别给予不同浓度的奎尼丁、普鲁卡因胺和胺碘酮,观察莫西沙星和左氧氟沙星预处理组与对照组CI、BR等指标的差异。结果:莫西沙星32μM给药后CI和BR值均无明显变化,64μM和128μM给药后CI值明显降低(P<0.05),且均出现了较长时间的搏动信号消失。左氧氟沙星70μM给药后CI值先降低后升高,但未监测到BR值的明显变化,80μM和100μM给药后CI值明显降低(P<0.05),给药后均出现了搏动信号的减弱甚至消失。选择莫西沙星32μM、64μM,左氧氟沙星70μM、80μM对hiPSC预处理48h后给予奎尼丁、普鲁卡因胺和胺碘酮。与对照组相比,给予奎尼丁后,莫西沙星32μM和64μM预处理组的CI值均明显降低(P<0.05),左氧氟沙星预处理组则未监测到CI和BR值的明显变化;给予普鲁卡因胺和胺碘酮后,左氧氟沙星70μM和80μM预处理组的CI值均明显降低(P<0.05),莫西沙星预处理组则未监测到CI和BR值的明显变化。结论:莫西沙星和左氧氟沙星均具有一定的心脏毒性,且莫西沙星可增强心肌细胞对奎尼丁的敏感性,左氧氟沙星可增强心肌细胞对普鲁卡因胺和胺碘酮的敏感性,增加其心脏毒性风险。该结论部分与临床数据相符,提示基于hiPSC-CM和RTCA的体外药物心脏毒性评价模型对药物心脏毒性风险预测的准确性。该模型可以综合评价药物处理后细胞的收缩力、细胞活性、搏动频率、搏动幅度等指标,即时反映药物处理对细胞生物学功能的影响,能够更为准确、灵敏地用于药物的心脏毒性筛选。

关键词：莫西沙星左氧氟沙星心律失常 hiPSC-CM 实时细胞分析心脏毒性

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基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法研究及应用

基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法研究及应用

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第二届(2016年)中国安全药理学学术年会暨第五届安全药理学国际学术研讨会

作者：汪溪洁王淑颜赵琪汤纳平马璟国家上海新药安全评价研究中心(上海益诺思生物技术有限公司) 上海郭守敬路199号201203

目的心脏毒性一直是新药研发失败的主要原因之一,其评价方法也是各国学者研究的热点.本文对基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法进行了研究.方法采用转染hERG钾通道或Nav1.5钠通道、Cav1.2钙通道基因的HEK293细胞,利用膜片... 详细信息

目的心脏毒性一直是新药研发失败的主要原因之一,其评价方法也是各国学者研究的热点.本文对基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法进行了研究.方法采用转染hERG钾通道或Nav1.5钠通道、Cav1.2钙通道基因的HEK293细胞,利用膜片钳技术记录hERG钾电流或Nav1.5钠电流、Cav 1.2钙电流,并采用阳性药物对上述电流进行验证;采用人胚胎干细胞分化的心肌细胞(human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte,hESC-CM),接种到RTCA Cardio E-Plate 96孔板,利用实时细胞分析技术观察hESC-CM的搏动频率和幅度,并采用不同浓度的阳性药物进行验证;在此基础上,利用上述方法,评价化合物的心脏毒性.

关键词：心脏毒性替代方法膜片钳实时细胞分析

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基于人源性细胞的药物体外心脏毒性评价替代方法的研究

基于人源性细胞的药物体外心脏毒性评价替代方法的研究

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2017（第三届）毒性测试替代方法与转化毒理学（国际）学术研讨会

作者：汪溪洁赵琪王淑颜马璟上海益诺思生物技术有限公司(国家上海新药安全评价研究中心)

目的:在药物心脏毒性评价方法的发展过程中,由动物实验外推到人的过程中存在诸多问题,研究人员一直在探索药物心脏毒性评价研究的体外替代方法。本文对基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法进行了研究。方法:采用转染hERG钾通... 详细信息

目的:在药物心脏毒性评价方法的发展过程中,由动物实验外推到人的过程中存在诸多问题,研究人员一直在探索药物心脏毒性评价研究的体外替代方法。本文对基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法进行了研究。方法:采用转染hERG钾通道或Nav1.5钠通道、Cav1.2钙通道基因的人胚肾细胞（HEK293细胞）和全自动膜片钳系统建立基于人源性细胞模型的离子通道心脏毒性评价方法,并采用阳性药物进行验证;采用人诱导多能干细胞分化的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell derived-cardiomyocyte,hiPSC-CM）和实时细胞分析系统建立基于人源性细胞模型的功能性心脏毒性评价方法,并采用阳性药物进行验证;在此基础上,利用上述方法,评价化合物的心脏毒性。结果:采用不同的电压刺激程序,在培养良好的HEK293细胞上,成功记录并验证了hERG钾电流(I)或Nav1.5钠电流(I)、Cav1.2钙电流(I)。E-4031和西沙必利对I有浓度依赖性的抑制作用,IC分别为7.6nmol/L和5.8 nmol/L;利多卡因对I有浓度依赖性的抑制作用,IC为0.23μmol/L;硝苯地平对I有浓度依赖性的抑制作用,IC为0.19μmol/L;上述结果均与文献报道接近。采用实时细胞分析技术在hiPSC-CM接种24小时后,可观察到hiPSC-CM的特征性搏动图谱。E-4031对hiPSC-CM的搏动图谱和细胞指数有浓度依赖性的抑制作用,IC为0.04μmol/L,与文献中E-4031的IC接近;异丙肾上腺素对hiPSC-CM的搏动图谱有兴奋作用,对hiPSC-CM的细胞指数有浓度依赖性的影响,EC为0.03μmol/L,与文献中异丙肾上腺素的EC接近。利用上述方法,已评价了近30个化合物的心脏毒性。结论:人源性细胞模型是体外替代研究较为理想的模型,本研究成功建立并验证了基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法,并应用于已知或未知化合物的心脏毒性评价,为临床安全用药提供理论和实践依据。

关键词：心脏毒性替代方法膜片钳实时细胞分析

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基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法研究及应用

基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法研究及应用

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2015毒性测试替代方法与转化毒理学（国际）学术研讨会

作者：汪溪洁王淑颜惠涛涛赵琪马璟国家上海新药安全评价研究中心

目的心脏毒性一直是新药研发失败的主要原因之一,其评价方法也是各国学者研究的热点。本文对基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法进行了研究。方法采用转染hERG钾通道或Nav1.5钠通道、Cav1.2钙通道基因的HEK293细胞,利用膜片... 详细信息

目的心脏毒性一直是新药研发失败的主要原因之一,其评价方法也是各国学者研究的热点。本文对基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法进行了研究。方法采用转染hERG钾通道或Nav1.5钠通道、Cav1.2钙通道基因的HEK293细胞,利用膜片钳技术记录hERG钾电流或Nav1.5钠电流、Cav1.2钙电流,并采用阳性药物对上述电流进行验证;采用人胚胎干细胞分化的心肌细胞（human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte,hESC-CM）,接种到RTCA Cardio E-Plate 96孔板,利用实时细胞分析技术观察hESC-CM的搏动频率和幅度,并采用不同浓度的阳性药物进行验证;在此基础上,利用上述方法,评价化合物的心脏毒性。结果采用不同的电压刺激程序,在培养良好的HEK293细胞上,成功记录并验证了hERG钾电流或Nav1.5钠电流、Cav1.2钙电流,E-4031(0.001、0.003、0.01、0.03和0.1μmol·L)、西沙必利(0.01、0.03、0.1、0.3和1μmol·L)可浓度依赖性的抑制hERG钾电流,利多卡因(1、10、100和1000μmol·L)可浓度依赖性的抑制Nav1.5钠电流,维拉帕米(0.001、0.003、0.01、0.03和0.1μmol·L)、硝苯地平(0.001、0.01、0.1、1和10μmol·L)可浓度依赖性的抑制Cav1.2钙电流,提示所记录的电流为hERG钾电流或Nav1.5钠电流、Cav1.2钙电流。选择不同的接种密度和检测时段,及不同的阳性药物氟哌啶醇(0.01,0.1,1和10μmol·L)、奎尼丁(0.78,3.13,12.5,和50μmol·L)和异丙肾上腺素(0.01,0.1,1和10μmol·L),成功记录并验证了hESC-CM搏动情况,确定了40000/孔为最佳接种密度,60-96 h为最适检测时段。氟哌啶醇浓度≥0.1μmol·L可浓度依赖性的抑制细胞搏动频率和幅度,奎尼丁浓度≥3.13μmol/L时可浓度依赖性的抑制细胞搏动频率和幅度,异丙肾上腺素浓度>0.01μmol/时可浓度依赖性的影响hESC-CM生长状态和特征性搏动图谱,细胞搏动频率显著增加,细胞搏动幅度显著降低。利用上述方法,已评价了近10个化合物的心脏毒性。结论已成功建立并验证了基于人源性细胞的药物心脏毒性评价体外替代方法,并用于已知或未知化合物的心脏毒性评价,为临床安全用药提供理论依据,同时也为上述替代方法用于药物在临床前安全性评价阶段早期、快速、准确的预测潜在心脏毒性提供可行性、代表性与指导性的理论与实践基础。

关键词：心脏毒性替代方法膜片钳实时细胞分析

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