检索结果-内蒙古大学图书馆

先天性巨结肠层粘连蛋白基因与RET基因表达的关系

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中华普通外科杂志 2006年第8期21卷 607-608页

作者：李爱武张文同栾怡段祥升冯进波王凤英山东大学齐鲁医院小儿外科济南250012 山东大学医学院微生物教研室教育部卫生部心血管重构与功能研究重点实验室

我们通过实时荧光定量pcr技术对先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）病儿层粘连蛋白基因与RET基因的表达以及它们的相关性进行了研究，现将结果报告如下。

关键词：粘连蛋白基因先天性巨结肠 RET基因基因表达实时荧光定量pcr技术 disease 相关性

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E-cadherin在胃癌组织的表达及意义

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江苏医药 2011年第23期37卷 2851-2852页

作者：郭志祥杨小冬宜兴市官林医院普通外科 214200 南京医科大学第一附属医院普通外科

研究认为胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程[1]。阐明其发生发展机制,对其检测及治疗有着重要作用。E-cadherin是一类介导上皮细胞间黏附维持组织结构完整性和是一类介导上皮细胞间黏附维持组织结构完整性... 详细信息

研究认为胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程[1]。阐明其发生发展机制,对其检测及治疗有着重要作用。E-cadherin是一类介导上皮细胞间黏附维持组织结构完整性和是一类介导上皮细胞间黏附维持组织结构完整性和极性的钙依赖性跨膜糖蛋白，与肿瘤侵袭转移关系最密切，细胞间黏附的紊乱是肿瘤侵袭和转移的首要条件[2]。本研究采用实时荧光定量pcr技术，通过在胃癌组织中检测E-cadherin的表达，探讨E-cadherin在胃癌发生发展过程中的作用。

关键词： E-cadherin 胃癌组织实时荧光定量pcr技术钙依赖性跨膜糖蛋白肿瘤侵袭转移结构完整侵袭和转移细胞间

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浸润性乳腺癌SFRP1基因的表达及其启动子甲基化的意义

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广东医学 2012年第4期33卷 469-472页

作者：齐凤杰张丽赵树鹏辽宁医学院病理教研室辽宁锦州121001

目的探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-relat-ed protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义。方法采用实时荧光定量pcr技术及甲基化聚合酶链反应(M... 详细信息

目的探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-relat-ed protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义。方法采用实时荧光定量pcr技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测58例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中SFRP1基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);腋窝淋巴结有转移的浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于腋窝淋巴结无转移组(P<0.05),而与其他临床病理参数无关。SFRP1在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在23例SFRP1基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到SFRP1的mRNA表达。结论 SFRP1基因异常甲基化可能影响其mRNA的转录水平;SFRP1基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助。

关键词：浸润性乳腺癌 SFRP1 甲基化实时荧光定量pcr技术甲基化特异性pcr

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Tim-3表达对慢性乙肝患者外周血CD8+T细胞功能的影响

Tim-3表达对慢性乙肝患者外周血CD8+T细胞功能的影响

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作者：姚伟徐州医学院

学位级别：硕士

目的：1.明确慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T细胞Tim-3的表达及临床意义。 　　2.明确Tim-3表达对慢性乙型肝炎患者外周血总CD8+T细胞及HBV特异性CD8+T细胞功能的影响。 　　方法：1.实时荧光定量pcr... 详细信息

目的：1.明确慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T细胞Tim-3的表达及临床意义。 　　2.明确Tim-3表达对慢性乙型肝炎患者外周血总CD8+T细胞及HBV特异性CD8+T细胞功能的影响。 　　方法：1.实时荧光定量pcr技术测定血清HBVDNA水平。 　　2.时间分辨荧光免疫法测定HBV感染病毒标志物。 　　3.全自动生化分析仪检测肝功能ALT、TBIL等。 　　***特异性CD8+T细胞扩增：CHB患者外周血PBMCs分离，加入工作浓度为1mg/ml HBcAg18-27多肽1μl于48孔板各培养孔，37℃5％ CO2孵箱中孵育，第四天加入细胞因子IL-2维持细胞增殖10天。 　　5.流式细胞技术：a.检测CHB患者外周血PBMCs中HLA-A2阳性型别；b.检测CHB患者外周血PBMCs中CD8+T细胞Tim-3、CD57及IFN-γ表达；C.以Tim-3mAb阻断Tim-3/Tim-3L通路后，检测Core18-27Pentamer+CD8+T细胞增殖和细胞毒功能的改变。 　　6.酶联免疫吸附试验：以Tim-3mAb阻断Tim-3/Tim-3L通路后，ELISA检测培养上清细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的表达。 　　结果：***患者外周血CD8+T细胞Tim-3表达水平显著高于健康人(F=33.41，P<0.01)。进一步研究发现CHB患者外周Tim-3+CD8+T细胞CD57表达水平显著高于Tim-3-CD8+T细胞(P<0.05)，并且Tim-3表达水平与CD57水平呈正相关(r＝0.41，P<0.05)。 　　***患者外周血Tim-3+CD8+T细胞IFN-γ表达水平显著低于Tim-3-CD8+T细胞IFN-γ水平(P<0.01)，并且Tim-3表达与IFN-γ水平呈负相关(r=0.55，P<0.01)。 　　***患者外周血PBMCs中Tim-3mAb阻断组core18-27Pentamer+CD8+T细胞频数显著高于Tim-3mAb未阻断组(t=2.29，P<0.05)。 　　***患者外周血PBMCs中Tim-3mAb阻断组Pentamer+CD8+T细胞perforin和CD107a表达水平明显高于Tim-3mAb未阻断组(t=2.87，P<0.05)。 　　***患者外周血PBMCs中Tim-3mAb阻断组分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2显著高于Tim-3mAb未阻断组(t值分别为2.62、2.30和2.61，P<0.05)。 　　结论：***患者外周血CD8+T细胞高表达Tim-3，与肝脏炎症水平成正相关。 　　***患者外周血表达Tim-3的CD8+T细胞表型老化，生成IFN-γ能力下降。 　　3.以Tim-3mAb阻断Tim-3通路，CHB患者PBMCs中Pentamer+CD8+T细胞数量增多。 　　4.以Tim-3mAb阻断Tim-3通路，能提高CHB患者PBMCs中Pentamer+CD8+T细胞CD107a和perforin表达水平。 　　5.以Tim-3mAb阻断Tim-3通路，CHB患者外周血PBMCs分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平明显增多。

关键词：慢性乙型肝炎病毒 CD8+T细胞功能 MHC-Ⅰ肽五聚体复合物实时荧光定量pcr技术 T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3

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UV-B辐射胁迫环境对莱茵衣藻的生理生化影响

UV-B辐射胁迫环境对莱茵衣藻的生理生化影响

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作者：蔡文凯中国科学院大学

学位级别：硕士

大气平流层中的臭氧层被破坏，导致到达地球表面太阳的UV-B辐射增强，这将对绿色光合自养植物产生了多方面影响。绿色植物在长期演化过程中，相应进化出针对UV-B辐射环境胁迫的适应机制。本文通过模拟UV-B辐射增强环境，检测莱茵衣藻（... 详细信息

大气平流层中的臭氧层被破坏，导致到达地球表面太阳的UV-B辐射增强，这将对绿色光合自养植物产生了多方面影响。绿色植物在长期演化过程中，相应进化出针对UV-B辐射环境胁迫的适应机制。本文通过模拟UV-B辐射增强环境，检测莱茵衣藻（水生单细胞绿藻，通常作为研究光合作用的模式生物之一）各种生理生化指标的变化，对莱茵衣藻适应UV-B辐射的生物学机制进行了研究。　　本研究主要的结果如下:　　叶绿素荧光快相实验显示，UV-B辐射胁迫对莱茵衣藻光合系统第一个损伤位点在于QB上，即在光合系统中光能电子在沿电子传递链从QA-向QB-传递过程中受阻，导致进入光合系统的能量减少，最终影响植物光合作用;另外还发现UV-B辐射胁迫能够抑制莱茵衣藻的生长，减少细胞内光合色素的含量，色素的吸光光谱峰值降低，光合放氧速率的明显受到抑制，细胞死亡率上升。通过叶绿素荧光技术表明电子传递在向PSⅡ电子受体的初级醌受体(QA)传递中过程并没有受阻，但是UV-B辐射使得电子在沿电子传递链从QA-向QB-传递过程中受阻，从而导致光合速率下降;同时实时荧光定量pcr实验显示，编码D1，D2蛋白基因(psbA，psbD基因)在UV-B辐射胁迫环境下基因表达水平下降，这暗示着由于光合系统Ⅱ骨架蛋白的减少，导致QB与D1蛋白结合的位点减少，使得了QB受体从光合系统中脱落，导致了电子传递过程受阻，最终使莱茵衣藻光合作用活性下降。　　首次证明了莱茵衣藻中存在micorRNA参与高UV-B辐射的调控:通过下调表达cre-miR918的转录水平，提高了ASO1基因的表达水平，来实现莱茵衣藻对UV-B辐射环境的适应。高通量测序结果表明，UV-B辐射胁迫不仅会使莱茵衣藻编码蛋白基因的表达量发生变化，而且发现了一部分非编码RNA也参与莱茵衣藻抵抗UV-B辐射的调节。其非编码小RNA(cre-miR918)在低UV-B辐射剂量下表达量下调，使得其对应靶基因(ASO1基因)表达量上调，增加ASO1基因表达蛋白的合成，使莱茵衣藻更好应对UV-B辐射的损害。这项研究为进一步研究UV-B辐射条件下莱茵衣藻光合作用过程和研究莱茵衣藻中microRNA的功能研究打下了良好的基础。

关键词： UV-B辐射莱茵衣藻实时荧光定量pcr技术叶绿素荧光生物学机制

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基于DNA信号放大技术超灵敏检测水中沙丁胺醇

基于DNA信号放大技术超灵敏检测水中沙丁胺醇

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作者：赵领娣河北科技大学

学位级别：硕士

沙丁胺醇是一种肾上腺素能受体激动剂,因非法使用产生的环境残留,严重影响人类的身体健康,因此针对其建立一种超灵敏检测方法尤为重要。目前的一些检测技术以大型仪器为主,很难满足现场需要。本文建立了一种基于免疫磁珠、桥接DNA与两... 详细信息

沙丁胺醇是一种肾上腺素能受体激动剂,因非法使用产生的环境残留,严重影响人类的身体健康,因此针对其建立一种超灵敏检测方法尤为重要。目前的一些检测技术以大型仪器为主,很难满足现场需要。本文建立了一种基于免疫磁珠、桥接DNA与两种不同的DNA扩增技术相结合的高灵敏、特异性检测沙丁胺醇（SAL）的方法。首先,分别在3端和5端修饰了完全抗原形成邻位连接探针,通过偶联磁珠的抗体特异性识别两个邻位连接探针,在桥接DNA（bridge）的桥接作用下将两个邻位探针连接形成全长扩增子,以此为模板通过两种DNA扩增技术实现信号放大。两种DNA信号放大技术分别是实时荧光定量pcr（qpcr）技术和链置换扩增（SDA）技术。结果表明,该方法的设计具有较高的灵敏度,其中,在使用实时荧光定量pcr方法检测SAL的线性范围为1.0×10-21.0×10～3 ng·mL-1,检出限为1.20×10-22 ng·mL-1,测定在自来水中SAL的加标回收率在87.1%108.8%之间;在使用链置换扩增技术检测SAL的线性范围为1.0×10-31.0×10～2 pg·mL-1,检出限为2.90 fg·mL-1,测定在自来水样品中SAL的加标回收率在93.1%103.3%之间。两种方法在其结构功能类似物中具有良好的特异性。本研究通过设计免疫磁珠、桥接DNA在不同的扩增技术下实现对沙丁胺醇的高灵敏检测,搭建了一个高特异性、通用的检测平台。

关键词：沙丁胺醇桥接DNA 实时荧光定量pcr技术链置换扩增技术免疫磁珠

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基于线粒体全序列的特异性pcr法鉴定哈蟆油的研究

基于线粒体全序列的特异性PCR法鉴定哈蟆油的研究

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作者：李小清吉林大学

学位级别：硕士

哈蟆油(Ranae Oviductus)是我国一味传统的珍贵中药材,然而学术界对其基源考证一直存在争议。同时,市售哈蟆油也普遍存在混伪品众多、药材掺杂掺假等乱象。为解决上述难题,本研究基于哈蟆油近源物种的线粒体全基因序列中线粒体呼吸链特... 详细信息

哈蟆油(Ranae Oviductus)是我国一味传统的珍贵中药材,然而学术界对其基源考证一直存在争议。同时,市售哈蟆油也普遍存在混伪品众多、药材掺杂掺假等乱象。为解决上述难题,本研究基于哈蟆油近源物种的线粒体全基因序列中线粒体呼吸链特异基因间隔序列建立哈蟆油的特异性pcr鉴定方法,并采用该方法对采自长白山地区的19个哈蟆油样本进行基源分析。此外,利用实时荧光定量pcr技术建立哈蟆油的定量分析方法。具体实施步骤如下:1基源动物线粒体全基因序列的分析从GenBank数据库中分别下载中国林蛙(Rana chensinensis David,1875)、东北林蛙(Rana dybowskii Günther,1876)、桓仁林蛙(Rana huanrensis Liu,Zhang et Liu,1993)、黑龙江林蛙(Rana amurensis Boulenger,1886)、牛蛙(Rana catesbeiana Shaw,1802)、青蛙(Pelophylax nigromaculatus Hallowell,1860)以及中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor,1842)的线粒体全基因序列。利用MEGA v7.0软件构建线粒体全基因序列的NJ系统进化树,确定***、***和R.-huanrensis为近源物种。通过MEGA v7.0软件的Clustal W功能进行近源物种的COI、Cyt b、12S rRNA以及线粒体全基因序列的多序列比对,发现线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6的基因间隔序列的变异性明显大于COI基因、Cyt b基因和12S rRNA基因。因此,ND5与ND6的间隔序列适合用来进行近源林蛙属的物种鉴定。2哈蟆油特异性pcr鉴定方法的建立基于***、***和***的线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6的基因间隔序列分别设计上游引物LFP(Large Forward Primer)和下游引物LRP(Large Reserve Primer)。使用常规改良SDS法分别提取哈蟆油对照药材、中国林蛙油、东北林蛙油、桓仁林蛙油、黑龙江林蛙油、青蛙油和中华大蟾蜍油的基因组DNA。利用上述引物对LFP/LRP分别对各基因组DNA进行特异性pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳。中国林蛙油的扩增片段大小为856bp,东北林蛙油为692bp,桓仁林蛙油为1047bp,青蛙油为596bp。并以上述特异性pcr鉴定方法对长白山地区的19个哈蟆油样本进行鉴定,结果表明19个样本均来自于***。为了进一步验证鉴定结果的可靠性,基于***的线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6的基因间隔序列设计了***的特异性引物对SFP/SRP(Small Forward Primer/Small Reserve Primer),其扩增片段大小为290bp。利用引物对SFP/SRP分别扩增长白山地区的19个哈蟆油样本,进一步证实了其均来自于***。3哈蟆油定量分析方法的建立基于上述哈蟆油(东北林蛙油)的线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6基因间隔序列,使用软件Primer Express 3.0.1设计哈蟆油的特异性引物对QFP/QRP(Quantitative Forward Primer/Quantitative Reserve Primer)。按不同比例混合哈蟆油和环糊精以制备一系列(0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)对照品。以改良SDS法分别提取其基因组DNA后进行实时荧光定量pcr反应,以哈蟆油含量及其Ct值制作标准曲线。标准曲线为y=-11.649x+30.967,R=0.9809,说明哈蟆油含量在0%00%范围内线性关系良好。本研究的创新性在于:1.首次建立基于线粒体基因间隔序列特异性pcr技术的哈蟆油鉴别方法。2.首次研究采用实时荧光定量pcr法进行哈蟆油定量分析。本研究建立的鉴定方法可准确区分***和***等近源物种,无需通过基因测序,降低了检测成本,具有推广应用价值。本研究建立的哈蟆油定量分析方法,可用于哈蟆油及其相关产品中哈蟆油含量的测定,弥补现有含量测定方法的不足。

关键词：哈蟆油分子鉴定线粒体全基因序列特异性pcr技术实时荧光定量pcr技术定量

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拟穴青蟹JHBP和JHE基因家族的克隆与表达模式分析

拟穴青蟹JHBP和JHE基因家族的克隆与表达模式分析

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作者：李秀上海海洋大学

学位级别：硕士

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海地区主要的海产蟹类之一,隶属于甲壳纲,青蟹属。由于性成熟的雌蟹(膏蟹)在营养、经济、医药等多方面的价值,日益受到消费者和研究者的青睐。近年来,研究者对如何在青蟹养殖过程中获得优质... 详细信息

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海地区主要的海产蟹类之一,隶属于甲壳纲,青蟹属。由于性成熟的雌蟹(膏蟹)在营养、经济、医药等多方面的价值,日益受到消费者和研究者的青睐。近年来,研究者对如何在青蟹养殖过程中获得优质的膏蟹进行了大量研究,并取得了一定进展。甲基法尼酯(Methyl farnesoate,MF)是调节拟穴青蟹生长发育和繁殖过程中重要的内分泌激素,在青蟹性成熟的过程中起着至关重要的作用。甲基法尼酯在拟穴青蟹大颚器(Mandibular organ,MO)合成后,在进入靶器官发挥作用的过程中需要借助甲基法尼酯结合蛋白(Methyl farnesoate binding protein,MFBP)的保护和运输,防止被特异的酯酶降解。特异的羧酸酯酶能够水解MF,对控制MF的滴度平衡起着至关重要的作用。因此对拟穴青蟹MF代谢过程中相关基因的研究对了解甲壳动物的内分泌调控机制具有良好的指导意义。本研究基于拟穴青蟹的转录组数据,拟从分子生物学的角度,对拟穴青蟹生长发育和繁殖过程中与MF代谢相关的保幼激素结合蛋白(Juvenile hormone binding protein,JHBP)和保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)基因家族进行了克隆和表达模式分析,获得的主要研究成果如下:1.拟穴青蟹Sp-JHBP的克隆和表达分析JHBP蛋白是一类在保幼激素(Juvenile hormone,JH)信号传导通路上承担保护/运输等重要作用的一类蛋白家族,是JH代谢系统中关键的组成元素。本研究在拟穴青蟹中克隆获得七条JHBP,具有JHBP结构域,分析后命名为Sp-JHBP,七条ORF最长为1,326 bp,最短为663 bp,编码221-441个氨基酸,预测蛋白分子量为24,157-48,188 Da,等电点4.10-5.77。只有Sp-JHBP1不含信号肽。七条Sp-JHBP序列的一致性为38.96%。七条Sp-JHBPs的二级结构包括26.0-39.7%的α-螺旋(alpha helix),28.5-47.6%的链(strand),以及25.0-31.8%的环(loop),除Sp-JHBP5外,均含有2-6个蛋白结合区域。经分子对接模拟预测,七条Sp-JHBP蛋白的三级结构均能结合MF。荧光定量pcr分析表明7个基因在溞状幼体I-V(Z1-Z5)、大眼幼体(M)、仔蟹(C1-C2)8个幼体发育阶段几乎都有表达,但Sp-JHBP1和Sp-JHBP5表达量很低。Sp-JHBP2在Z1期表达量最高,Z2-Z4溞状幼体几乎检测不到表达,随后在Z5-C1变态发育期出现较高的表达量。Sp-JHBP3和Sp-JHBP4具有相似的表达模式,在Z5和M期表达量很低,在C1期出现较高的表达。Z5和M期这两个时期是青蟹幼体变态过渡阶段,我们推测,Sp-JHBP3和Sp-JHBP4可能与MF功能有关。组织分布结果显示,Sp-JHBP2主要表达于卵巢组织,Sp-JHBP3,4,5,6,7最高表达量均出现在肝胰腺中。MF成体诱导实验表明,MF能抑制卵巢中Sp-JHBP2的表达,对肝胰腺中Sp-JHBP3,4,5,6,7的表达影响不显著。MF诱导大眼幼体实验结果显示,MF明显上调了Sp-JHBPs的表达,其中以0.1μM上调效果最为显著。以上结果说明青蟹Sp-JHBPs受MF的调控。2.拟穴青蟹JHE的克隆及表达分析JHE是存在于节肢动物体内的羧酸酯酶家族成员,对维持生物体内内分泌激素-JH滴度的平衡具有非常重要的作用。本研究在拟穴青蟹中克隆获得4条JHE序列,结合本实验室之前的研究,共十一条JHE,该十一条基因序列的相似性较高,为52.56%,分析后命名为Sp-JHE。它们的cDNA序列全长介于1,594-4,371 bp之间,ORF介于720-1,797 bp之间,编码239-598个氨基酸,预测蛋白质的分子量为26,488-66,729Da,等电点为5.02-6.29。除了Sp-JHE5,8-11之外,其他六个Sp-JHE在N端含有大约17-22个氨基酸残基的信号肽序列。进化树结果表明拟穴青蟹中推测的Sp-JHEs和甲壳动物拟长额虾属(Pandalopsis japonica)中两条JHE氨基酸序列聚为一大支,显示遗传距离较近。Sp-JHEs转录本结果显示不同的分布特征,Sp-JHE2、6、11几乎在所有的组织中都有所表达,其中Sp-JHE2在肌肉和脑神经节中表达量较高,Sp-JHE6、11在上皮细胞中表达量最高。Sp-JHE3只在胸神经节和上皮细胞中表达,且在上皮细胞中的表达量要远远高于其他几个基因。在卵巢组织中,除Sp-JHE3外,另外几个Sp-JHEs都有表达,其中以Sp-JHE10的表达

关键词：拟穴青蟹甲基法尼酯保幼激素酯酶结合蛋白降解保幼激素酯酶实时荧光定量pcr技术

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实时定量RT-pcr检测急性早幼粒白血病PML/RARα融合基因mRNA表达量方法的建立及临床应用

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒白血病PML/RARα融合基因mRNA表达...

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作者：楼瑾广州医学院

学位级别：硕士

目的: 研究通过实时定量RT-pcr技术检测PML/RARα融合基因mRNA转录本在治疗过程中的改变，分析急性早幼粒细胞白血病患者在以砷剂为主的序贯治疗不同阶段的微小残留病水平，评估患者对治疗的反应，及早预测复发，指导个体化治疗。 ... 详细信息

目的: 研究通过实时定量RT-pcr技术检测PML/RARα融合基因mRNA转录本在治疗过程中的改变，分析急性早幼粒细胞白血病患者在以砷剂为主的序贯治疗不同阶段的微小残留病水平，评估患者对治疗的反应，及早预测复发，指导个体化治疗。方法: 收集我院血液科和深圳市其他医院血液科2003年1月～2006年2月的急性早幼粒细胞白血病的骨髓标本，采用实时定量RT-pcr技术，用Taqman探针检测这些患者的PML/RARα融合基因3种常见类型的mRNA在以砷剂为主的序贯治疗的不同阶段的表达量。结果: 1.实时定量RT-pcr的敏感度为101拷贝数/ul，标准品日间差异及日内差异均＜5％。 2.29例PML/RARα融合基因阳性的急性早幼粒白血病初治患者，19例为PML/RARα融合基因L型异构体；10例为PML/RARα融合基因S型异构体。29例初治患者PML/RARα融合基因异构体L型及S型标准拷贝数(normalizedcopynumber,NCN)无明显统计学差异，均数为1.43％。 ***/RARα融合基因异构体L型患者在发病时外周血白细胞总数为6.08±13.21(×109/l)较S型患者15.11±20.26(×109/l)低，P＜0.01、血红蛋白74.1±22.78(g/l)较S型患者92.8±20.30(g/l)低，P＜0.01、血小板总数41.86±22.16(×109/l)较S型患者30.54±22.16(×109/l)高，P＜0.01，存在统计学差异；年龄、性别组成、骨髓幼稚细胞比例、荧光原位杂交(FISH)融合基因阳性细胞比例、患者经治疗达到缓解时间两者未见明显统计学差异。 4.随访治疗后6月的6名患者，1人PML/RARα融合基因MRD值降低1个对数级；3人PML/RARα融合基因MRD值2个对数级；2人实时定量RT-pcr检测阴性，即PML/RARα融合基因MRD值至少降低3个对数级，达到分子生物学缓解；治疗后12月复查的4名患者，3人转为阴性，1人PML/RARα融合基因MRD值由降低2个对数级转为降低3个对数级；1名患者治疗后18月复查PML/RARα融合基因仍为阳性，该患者治疗后30月复查PML/RARα融合基因为阴性；4名患者治疗后36月复查，实时定量RT-pcr检测PML/RARα融合基因基因均为阴性。 5.1例通过荧光原位杂交(FISH)检测PML/RARα融合基因阴性的患者通过定量RT-pcr检测为PML/RARα融合基因阳性，经测序证实为PML/RARα融合基因异构体L型。结论: 1.建立了检测急性早幼粒白血病微小残留病的高敏感性、高特异性的实时定量RT-pcr方法。 2.经过以砷剂为主的序贯治疗后，急性早幼粒白血病患者PML/RARα融合基因转录本mRNA进行性减低。 3.治疗18个月后仍有部分患者经实时定量RT-pcr检测出PML/RARα融合基因阳性，说明不能过早停药。

关键词：急性早幼粒白血病实时荧光定量pcr技术融合基因微小残留病砷剂序贯治疗

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PLAG1在肝癌患者血浆中异常表达的研究

PLAG1在肝癌患者血浆中异常表达的研究

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作者：付琳郑州大学

学位级别：硕士

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PLC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC，简称肝癌）则是其中最常见的一种类型，其发病率位居恶性肿瘤中第五位，并且是癌症相关性死亡的三大常见... 详细信息

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PLC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC，简称肝癌）则是其中最常见的一种类型，其发病率位居恶性肿瘤中第五位，并且是癌症相关性死亡的三大常见原因之一，目前已成为全球性关注的健康问题。我国肝癌主要发病因素为肝炎病毒感染包括慢性乙型肝炎病毒（HBV）以及丙型肝炎病毒（HCV）感染、长期大量饮酒、黄曲霉毒素污染的食物及一些其他肝脏代谢疾病等。肝癌发病比较隐匿，病情进展十分迅速。早期一般没有症状或者症状并不十分明显，确诊时大多数的患者已达局部晚期或已发生远处转移，治疗难度大，预后差。当前肝癌的诊断金标准主要是病理学诊断，但这在临床上并不实用。故目前得到国内外共识的临床诊断标准主要取决于三个因素，即影像学检查、血清AFP水平以及慢性肝病病史。AFP作为肝癌相对特异的血清肿瘤标志物，其持续升高是发生肝癌的危险因素，但其诊断阳性率一般仅为60%70%。近年来，一些欧美学者指出AFP作为肝癌肿瘤标记物其特异性及敏感性并不高。当前肝癌的首选治疗依然为外科手术，但是在确诊时大部分患者已经达到中晚期，往往失去了手术的机会，仅有不到20%的患者适合手术治疗。并且由于射频消融、粒子植入、TACE等治疗有其一定的局限性，效果并不令人十分满意。因此通过研究肝癌的发生、发展机制，寻找新的分子标志物以便提高肝癌的诊断率，同时可针对肿瘤进行分子靶向治疗的意义十分重大。多形性腺瘤基因1（pleomorphic adenoma gene1，PLAG1）是位于人染色体8q12的原癌基因，包含5个外显子，cDNA全长7313bp，基因库编号为U65002，其中只有第4外显子的最后端和第5外显子的起始端进行编码，编码框共1503bp。最早是在多形性腺瘤组织中被发现。本研究分别采用了实时荧光定量pcr（Real-time pcr）技术和酶联免疫吸附法（ELISA）检测正常人血浆、肝硬化患者血浆和肝癌患者血浆中PLAG1mRNA及蛋白表达水平的差异，并分析其表达与临床病理参数之间的关系。材料与方法 1．材料实验组选择2012年04月-2012年12月河南省人民医院肝胆外科住院的肝癌患者62例，其中男性42例，女性20例，年龄34-78岁，平均年龄（54.2±11.1）岁。所有肝癌患者诊断均经过病理证实，收集标本时均未进行手术治疗、放疗及化疗。对照组45例为河南省人民医院消化内科住院的肝硬化患者，并经影像学检查排除肝癌；另40例为本院同期同年龄段健康体检者。所有受试者均获得知情同意。 2．方法 2.1Real-time pcr：分别提取正常对照者、肝硬化患者和肝癌患者血浆中总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳（150V，15min）检测RNA28S和18S比例，并应用紫外分光光度计检测A260/A280测定总RNA吸光度，以评估总RNA完整性和纯度。按照RT-pcr试剂盒的操作步骤进行反转录pcr，应用所得CT值计算扩增产物相对定量，同时应用4%的琼脂糖凝胶电泳进行扫描和分析验证PLAG1DNA扩增产物的正确性。2.2ELISA检测各组标本均按照PLAG1-ELISA试剂盒说明书进行操作，测出OD值。然后根据标准品应用Excel2007软件绘制标准曲线,通过已知标准品浓度值计算样品浓度值。 3．统计学处理采用SPSS17.0统计学软件，各组表达差异采用χ2检验，相对表达量采用中位数（最小值，最大值）表示。多组定量资料运用Kruskal-Wallis秩和检验。ELISA计量资料采用mean±SD表示，组间定量资料运用t检验和方差分析及LSD-t检验。以α=0.05为检验标准。结果 ***-time pcr：各组总RNA提取结果良好，电泳证实提取的是高纯度RNA，完整性较好，总RNA吸光度在A260/A280在1.5-1.9之间，符合纯度要求。 PLAG1mRNA阳性表达率在肝癌组、肝硬化组和正常对照组中分别为75.8%，20.0%，7.5%，肝癌组血浆中PLAG1mRNA的阳性表达率明显高于肝硬化组及正常对照组，肝癌组与肝硬化组、正常对照组之间的差异有统计学意义（P均＜0.05）。而肝硬化组与正常对照组差异无统计学意义（P＝0.099）。肝癌组PLAG1mRNA的相对定量为45.25（9.85，207.94），肝硬化组为11.31（5.66，51.98），正常对照组为12.99（1.00，18.38），三组之间差异有统计学意义（P=0.001）。两两比较，肝癌组与肝硬化组、正常对照组之间的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。肝硬化组与正常对照组之间的差异无统计学意义

关键词：肝细胞癌血浆多形性腺瘤基因1 实时荧光定量pcr技术酶联免疫吸附法循环核酸

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