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福建省第七届猪病学术研讨会

作者：赵东岳王琨温福利岳良平黄翠琴王寿昆福建农林大学龙岩学院

目的：本研究选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-time pcr检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量pcr的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法：将529bp重复序... 详细信息

目的：本研究选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-time pcr检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量pcr的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法：将529bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量pcr.结果：529bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R2)均为0.998,并且扩增效率均为96.724％;通过溶解曲线分析可以确定529bp、ITS-1和B1扩增的片段的Tm值分别为86.7±0.5℃、78.8±0.5℃、83.1±0.5℃;特异性试验表明,529bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529bp、ITS-1和B1序列最低检出限为173copies/μL、123copies/μL和135 copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13％;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体检测阳性率41.72％,ELISA与荧光定量pcr检测核酸阳性符合率为53.44％(P<0.01)三重SYBRGreenⅠReal-time pcr检测的阳性率根据靶基因在基因组中的拷贝数不同,检测的阳性率略有不同,529bp为35.67％、ITS-1为33.44％、B1为33.12％,并且检测ELISA的假阴性率也略有不同,529bp为8.06％、ITS-1为4.84％、B1为4.03％。

关键词：猪场弓形虫检测实时荧光定量pcr法酶联免疫吸附剂比较分析

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miR-148a在膀胱癌组织中的异常表达及初步临床意义探讨

miR-148a在膀胱癌组织中的异常表达及初步临床意义探讨

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作者：茅利明温州医科大学

学位级别：硕士

目的：　　采用Trizol提取膀胱上皮移形细胞癌(TCCB)及正常膀胱粘膜组织(NBE)的总RNA，采用实时荧光定量pcr方法检测miR-148a在TCCB组及NBE组织中的相对表达量，分析比较miR-148a在两组间的相对表达量是否有显著性差异，并进一步结合... 详细信息

目的：　　采用Trizol提取膀胱上皮移形细胞癌(TCCB)及正常膀胱粘膜组织(NBE)的总RNA，采用实时荧光定量pcr方法检测miR-148a在TCCB组及NBE组织中的相对表达量，分析比较miR-148a在两组间的相对表达量是否有显著性差异，并进一步结合临床资料来分析TCCB组不同病理分级之间以及不同临床分期组之间miR-148a的相对表达量是否具有统计学意义。对miR-148a在膀胱癌组织中的临床意义进行初步探讨，并为进一步研究miR-148a在膀胱癌发生发展过程中可能的作用机制奠定基础。　　方法：　　 1.从2011年到2012年，采集温州医学院附属第一医院及浙江大学附属浙二医院泌尿外科诊疗中心膀胱肿瘤患者标本，按照膀胱癌临床诊断标准收集BCa组织66例为实验组，经病理证实均为膀胱上皮移形细胞癌(TCCB)，以及外伤性膀胱破裂患者正常膀胱粘膜组织18例为对照组，经病理证实均为正常膀胱粘膜组织(NBE)。标本取得后迅速冷冻于液氮中，随后放置于-80℃低温冰箱中储存备用。　　 2.采用美国Invitrogen公司的TRIzol(@) Reagent Kit对膀胱癌组织和正常对照粘膜组织进行总RNA的抽提，流程步骤为:组织匀浆、分离相、RNA沉淀、RNA洗涤和RNA溶解。操作过程严格按照原装试剂盒的说明书进行操作。采用Thermo NanoDrop2000分光光度计（美国Thermo公司）对总RNA浓度及纯度进行检测。　　 3.采用美国ABI(Applied Biosystems)公司的TaqMan(@) MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒及TaqMan(@) MicroRNA Assays的特异性引物miRNA-specific RT primer进行逆转录过程，把总RNA逆转录成cDNA，整个准备过程需要在冰上操作。使用美国ABI公司的stepone plus实时荧光定量pcr仪进行逆转录反应过程，反应条件为:16℃30min;42℃30min;85℃5min;4℃∞。逆转录后的产物直接用于pcr扩增过程。　　 4.采用美国ABI公司的TaqMan(@)MicroRNA Assays试剂盒进行pcr扩增过程:pcr反应体系需要加入TaqMan(@) MicroRNA Assays的上下游引物及探针miRNA-specific forward pcr primer, reverse pcr primer和Taqman MGB probe的混合物，内参U6和miR-148a的逆转录引物，以及TaqMan(@) UniversalMaster MixⅡ(No UNG，即不含尿嘧啶-N-糖苷酶)。反应体系所有试剂需要在冰上准备，整个体系不能有气泡存在。扩增过程利用美国ABI公司的stepone plus型实时荧光定量pcr仪进行，扩增循环参数如下:95℃，10mins;95℃，15s，60℃，60s，一共40个循环。　　 5.扩增结束后适当调整基线，扩增曲线与基线的交叉点即为Ct值(Cycle threshold))。根据各样本miR-148a和所对应U6的Ct值，采用相对定量方法计算原组织标本中miR-148a的相对表达量，结果表示为2-△Ct(△Ct=CtmiR-148a-CtU6)。　　 6.用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析:各分组相对表达量呈偏态分布用中位数（四分位数）表示，不同膀胱组织类型miR-148a的表达差异用完全随机设计两样本比较的Mann-Whitney U检验;TCCB组中不同病理分级间的差异用Kruskal-Wallis H秩和检验;TCCB组不同临床分期(Tis+T1)和(T2+T3+T4)间的差异用两个独立样本比较的Mann-Whitney U检验，均设p＜0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　 ***组织及NBE组织的RNA浓度测定:所有样品A260/A280在1.8-2.0之间，RNA纯度较高，无DNA、蛋白质等污染，可以为下游实验提供合格样本。　　 2.用ABI stepone plus型实时荧光定量pcr仪对TCCB组与NBE组进行miR-148a的相对表达量的检测，经两独立样本Mann-Whitney U检验统计学方法对数据作统计，结果显示:TCCB组中miR-148a的相对表达量明显低于NBE组，统计有显著性差异，z值为-5.22(p＜0.001)。　　 3.对miR-148a在膀胱癌诊断中进行效能评估，发现miR-148a对于膀胱癌诊断的特异性非常高，达到94.4％，阳性预测值为97.87％。使用Pearson卡方检验再次验证miR-148a的表达在膀胱癌组织和正常组织中是否存在差异，同时检测OR

关键词：膀胱上皮移形细胞癌实时荧光定量pcr法 miR-148a基因基因治疗

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乙型病毒性肝炎患者血清学标志物和HBV DNA定量相关性分析

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上海预防医学 2013年第8期25卷 449-450页

作者：周方满顾大磊浙江省宁波市北仑区人民医院检验科浙江宁波315800

我国属乙型病毒性肝炎（乙肝）高流行地区，一般人群HBsAg阳性率为7．2％。目前临床上诊断乙肝一般采用ELISA法检测乙肝血清标志物。随着基因诊断技术的不断发展，采用实时荧光定量pcr法检测乙肝病毒DNA数量也逐渐在临床普及。为了探讨... 详细信息

我国属乙型病毒性肝炎（乙肝）高流行地区，一般人群HBsAg阳性率为7．2％。目前临床上诊断乙肝一般采用ELISA法检测乙肝血清标志物。随着基因诊断技术的不断发展，采用实时荧光定量pcr法检测乙肝病毒DNA数量也逐渐在临床普及。为了探讨乙肝5项血清标志物与HBVDNA两者之间的相关性，我们运用两种方法同时检测乙肝病毒感染者血清，并对其结果进行分析，现报道如下。

关键词： HBVDNA定量乙型病毒性肝炎血清学标志物相关性分析病毒性肝炎患者乙肝血清标志物实时荧光定量pcr法 HBsAg阳性率

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SLC30A8基因多态性与移植后糖尿病的相关性研究

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中国药理通讯 2013年第3期30卷 63-64页

作者：余爱荣范星刘慧明辛华雯吴笑春广州军区武汉总医院临床药理科武汉430070 广州军区武汉总医院肾内科武汉430070

目的：探讨锌转运蛋白-8（SLC30A8）基因多态性与移植后糖尿病（PTDM）的相关性。方法：采用实时荧光定量pcr法检测97例PTDM患者（PTDM组）和301例未发生PTDM的肾移植患者（对照组）的SLC30A8 rs13266634的基因型，采用logistic回归分... 详细信息

目的：探讨锌转运蛋白-8（SLC30A8）基因多态性与移植后糖尿病（PTDM）的相关性。方法：采用实时荧光定量pcr法检测97例PTDM患者（PTDM组）和301例未发生PTDM的肾移植患者（对照组）的SLC30A8 rs13266634的基因型，采用logistic回归分析该基因多态性与PTDM的相关性。

关键词：基因多态性相关性糖尿病移植后 logistic回归分析实时荧光定量pcr法肾移植患者 PTDM

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实验室2种检测小儿巨细胞病毒方法的比较

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微生物学杂志 2013年第1期33卷 100-103页

作者：李娇马洪刚单风平中国医科大学免疫教研室辽宁沈阳110001 沈阳市儿童医院检验科辽宁沈阳110001

比较胶体金法和实时定量pcr法对小儿巨细胞病毒IgM抗体水平检测的敏感性及准确率。收集临床上243例小儿的血液标本,分别采用实时荧光定量pcr法和胶体金法检测这243例患者外周血巨细胞病毒IgM抗体水平,并对这2种检测方法的阳性率和敏感... 详细信息

比较胶体金法和实时定量pcr法对小儿巨细胞病毒IgM抗体水平检测的敏感性及准确率。收集临床上243例小儿的血液标本,分别采用实时荧光定量pcr法和胶体金法检测这243例患者外周血巨细胞病毒IgM抗体水平,并对这2种检测方法的阳性率和敏感性进行比较分析。实时荧光定量pcr法阳性率为11.93%,胶体金法为6.58%,2者差异有统计学意义(P<0.01)。在HCMV-DNA检测阳性患者中,IgM抗体阳性组HCMV-DNA拷贝数显著高于阴性组(P<0.01),比较这2种检测方法的敏感性,实时荧光定量pcr法的敏感性为72.5%,胶体金法的敏感性为40%,两者差距有统计学意义(P<0.01)。实时荧光定量pcr法与胶体金法相比,对巨细胞病毒IgM抗体检测具有较高的敏感性和准确率,值得临床推广应用。

关键词：实时荧光定量pcr法胶体金法巨细胞病毒IgM抗体

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丙型肝炎检验方法的临床研究与分析

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中国医药科学 2013年第13期3卷 125-126页

作者：欧慧广东省中山市疾病预防控制中心广东中山528400

目的回顾性分析丙型肝炎患者检验结果,探讨丙型肝炎的有效检验方法。方法对209份标本进行酶联免疫法(ELISA)检测抗-HCV和实时荧光定量pcr法(FQ-pcr)检测HCV-RNA,分析两种检测方法的有效性及差异。结果检出抗-HCV阳性138份(66.03%),HCV-... 详细信息

目的回顾性分析丙型肝炎患者检验结果,探讨丙型肝炎的有效检验方法。方法对209份标本进行酶联免疫法(ELISA)检测抗-HCV和实时荧光定量pcr法(FQ-pcr)检测HCV-RNA,分析两种检测方法的有效性及差异。结果检出抗-HCV阳性138份(66.03%),HCV-RNA阳性128份(61.24%),差异无统计学意义(P>0.05)。抗-HCV与HCV-RNA均阳性者112份(53.59%),两者均阴性的55例(26.32%)。两种检测方法总符合率为79.90%(配对x2=2.3810,P>0.05)。结论 ELISA和FQ-pcr法检测HCV比较无显著差异,但二者结合检测可提高HCV检出率。

关键词：丙型肝炎检验实时荧光定量pcr法酶联免疫法

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宫颈鳞癌患者组织中miR-145的表达及意义

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疑难病杂志 2013年第5期12卷 359-361页

作者：师婕张林燕内蒙古医科大学内蒙古医科大学附属人民医院妇产科内蒙古医科大学第一附属医院妇产科

目的探讨miR-145在宫颈上皮内瘤变Ⅲ级(CINⅢ级)和宫颈鳞癌患者组织中的表达情况及与宫颈鳞癌发生之间的关系。方法 2010年11月—2011年8月在内蒙古医科大学第一附属医院提取49例宫颈鳞癌组织(宫颈癌组)、27例宫颈上皮内瘤变Ⅲ级和2例... 详细信息

目的探讨miR-145在宫颈上皮内瘤变Ⅲ级(CINⅢ级)和宫颈鳞癌患者组织中的表达情况及与宫颈鳞癌发生之间的关系。方法 2010年11月—2011年8月在内蒙古医科大学第一附属医院提取49例宫颈鳞癌组织(宫颈癌组)、27例宫颈上皮内瘤变Ⅲ级和2例原位癌(CINⅢ级组)、11例宫颈良性病变患者(健康对照组)组织中的miRNA,用实时定量pcr的方法分析miR-145在各组患者组织中的表达情况。结果 (1)宫颈鳞癌患者组织中miR-145的表达较健康对照组、CINⅢ级组降低(P<0.05),miRNA-145在宫颈癌组织中的表达是CINⅢ级组的0.579倍,是健康对照组的0.521倍;(2)miR-145在宫颈鳞癌Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期以及在宫颈鳞癌高、中分化与低分化组的表达均无明显差异(P>0.05)。结论 miR-145在宫颈鳞癌组织中存在异常表达,提示其与宫颈鳞癌的发生及进展可能有关,值得进一步研究。

关键词： miR-145 宫颈鳞癌宫颈上皮内瘤变实时荧光定量pcr法

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龙眼TIR1和ABP1基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

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园艺学报 2012年第2期39卷 253-264页

作者：李惠华赖钟雄苏明华林玉玲福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002 福建省亚热带植物研究所福建厦门361006

采用RT-pcr结合RACE法,分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织生长素受体基因TIR1(Transport inhibitor response 1,即DL-TIR1)和生长素结合蛋白基因ABP1(Auxin biding protein 1,即DL-ABP1),运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量pcr法研究其在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达。结果表明:DL-TIR1为2328bp的mRNA全长序列(GenBank,GQ870264),包含1个长为1761bp的开放阅读框,5′非编码区为118bp,3′非编码区为449bp,推定的氨基酸序列含586个氨基酸,与其它植物TIR1具有85%～57%同源性;DL-TIR1在龙眼体胚的各阶段均有表达,整个变化趋势呈近似"W"状,在子叶形胚中的表达量最高。DL-ABP1为869bp的mRNA全长序列(GenBank,GQ900592),包含1个长为567bp的开放阅读框,5′非编码区为43bp,3′非编码区为259bp;推定的氨基酸序列含188个氨基酸,与其它植物ABP1具有87%～72%同源性,DL-ABP1在龙眼体胚中整个表达变化趋势也呈现近似"W"状。生长素受体DL-TIR1和"可能的"生长素受体DL-ABP1在龙眼体胚中的变化趋势极为相似。

关键词：龙眼胚性愈伤组织生长素受体基因生长素结合蛋白基因克隆序列分析实时荧光定量pcr法

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龙眼生长素应答因子基因克隆及其在体胚中的表达分析

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西北植物学报 2012年第12期32卷 2383-2389页

作者：李惠华赖钟雄苏明华林玉玲福建农林大学园艺植物生物工程研究所福州350002 福建省亚热带植物研究所福建厦门361006

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-pcr结合RACE法克隆生长素应答因子基因(auxin response fac-tor,即DL-ARF1),运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量pcr法研究其在龙眼体细胞胚胎发生过程中的表达。结果表明:DL-ARF1基... 详细信息

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-pcr结合RACE法克隆生长素应答因子基因(auxin response fac-tor,即DL-ARF1),运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量pcr法研究其在龙眼体细胞胚胎发生过程中的表达。结果表明:DL-ARF1基因的mRNA全长序列为2 695bp(GenBank登录号GQ923778),包含2 046bp开放阅读框,163bp 5′非编码区(5′UTR),486bp 3′非编码区(3′UTR);推定的氨基酸序列含681个氨基酸,与其它植物ARF基因相似性达40%～81%。DL-ARF1基因可能属于转录抑制因子,在龙眼体胚的各阶段均有表达,整个变化趋势呈双峰形,在胚性愈伤Ⅱ(Stage 2)中的表达量最高。

关键词：龙眼胚性愈伤组织生长素应答因子(ARF) 基因克隆序列分析实时荧光定量pcr法

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他克莫司对人Jurkat淋巴瘤细胞分泌IL-6和sIL-2R及表达IL-6和sIL-2RmRNA的影响

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中华皮肤科杂志 2012年第10期45卷 745-746页

作者：张峻岭闫翠彦索丹凤马秀亮天津市长征医院皮肤色素科 300120 北京市丰台区妇幼保健院皮肤科天津市第一中心医院皮肤科

目的探讨他克莫司对淋巴细胞分泌IL-6和sIL-2R及表达1L-6和sIL-2RmRNA的影响。方法酶联免疫吸附试验测定不同浓度他克莫司对人Jurkat淋巴瘤细胞产生IL-6和sIL-2R的影响，实时荧光定量pcr法分析他克莫司对淋巴瘤细胞IL-6mRNA和sIL-2RmRN... 详细信息

目的探讨他克莫司对淋巴细胞分泌IL-6和sIL-2R及表达1L-6和sIL-2RmRNA的影响。方法酶联免疫吸附试验测定不同浓度他克莫司对人Jurkat淋巴瘤细胞产生IL-6和sIL-2R的影响，实时荧光定量pcr法分析他克莫司对淋巴瘤细胞IL-6mRNA和sIL-2RmRNA表达的影响。结果102-10nmol／L他克莫司可以抑制Jurkat淋巴瘤细胞分泌IL-6、sIL-2R（P值均〈0．05），其中10^3-10^4 nmol／L他克莫司作用显著。10^2nmol／L他克莫司可下调淋巴瘤细胞IL-6和sIL-2RmRNA的表达（P值均〈0．05）。结论适当浓度他克莫司可抑制淋巴细胞分泌IL-6和sIL-2R，下调IL-6和sIL-2RmRNA的表达。

关键词： IL-6mRNA t淋巴瘤细胞 sIL-2R 他克莫司细胞分泌实时荧光定量pcr法酶联免疫吸附试验 mRNA表达

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