检索结果-内蒙古大学图书馆

中国蚕业 2016年第4期37卷 45-49页

作者：董强鲁兴萌吴姗浙江大学动物科学学院浙江杭州310058 浙江省检验检疫科学技术研究院浙江杭州310016

荧光定量PCR检测技术可实现对病原微生物的早期或快速检测,根据家蚕传染性软化病病毒(BmIFV)的RNA序列,设计了具有物种特异性的引物和探针,建立了荧光PCR检测BmIFV的方法。将设计的引物和探针同时对BmIFV、家蚕微孢子虫(Nb)、家蚕核型... 详细信息

荧光定量PCR检测技术可实现对病原微生物的早期或快速检测,根据家蚕传染性软化病病毒(BmIFV)的RNA序列,设计了具有物种特异性的引物和探针,建立了荧光PCR检测BmIFV的方法。将设计的引物和探针同时对BmIFV、家蚕微孢子虫(Nb)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕浓核病病毒(BmDNV)和桑叶进行特异性验证,结果显示只有BmIFV得到阳性结果。该方法对含BmIFV目标片段质粒的检测灵敏度达10^(-3)ng/μL,对目标病毒的检测灵敏度为3.4ng/μL。同时,对浙江省嘉兴市秀洲区、湖州市南浔区、嘉兴市桐乡市、嘉兴市海宁市、杭州市淳安县5个蚕区家蚕感染BmIFV情况进行了流行病学调查,结果显示这5个蚕区BmIFV感染率约为3.6%,为浙江省家蚕传染性软化病防治提供参考。

关键词：家蚕家蚕传染性软化病病毒荧光定量PCR 引物和探针流行病学

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家蚕传染性软化病病毒翻译起始机制的研究

家蚕传染性软化病病毒翻译起始机制的研究

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作者：李明乾浙江大学

学位级别：博士

家蚕软化病是一类严重影响蚕业生产的病害,家蚕传染性软化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus, BmIFV)作为导致该病的重要病原之一,曾引起国内外学者的广泛关注。BmIFV是一种正义单链小RNA病毒,专一寄生家蚕中肠组织的杯状... 详细信息

家蚕软化病是一类严重影响蚕业生产的病害,家蚕传染性软化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus, BmIFV)作为导致该病的重要病原之一,曾引起国内外学者的广泛关注。BmIFV是一种正义单链小RNA病毒,专一寄生家蚕中肠组织的杯状细胞,被归入小RNA病毒目(Picornavirales)传染性软化病毒科(Iflaviridae)传染性软化病毒属(Iflavirus)。本研究通过运用生物信息学分析BmIFV结构蛋白前的5’端序列发现：其5’端序列具有多个同框的起始密码子AUG(具有相同的终止密码子)且5’端序列的前端与具有内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)功能的榕透翅毒蛾病毒(Perina nuda virus, PnV)的序列结构十分相似,而其后端与小RNA病毒Ⅱ型的IRES结构十分相似。通过构建含有双荧光蛋白基因和双荧光素酶基因的两类重组杆状病毒表达系统,验证不同长度的BmIFV5’端序列的IRES功能。结果证实：BmIFV不同长度的5’端片段具有不同的IRES活性,其中1-155nt片段的IRES介导下游外源基因的翻译活性最低,而1-599nt片段的IRES介导外源蛋白的翻译活性最高。利用构建的含有双荧光蛋白的重组杆状病毒vR-IFV599-G侵染四种鳞翅目昆虫细胞系(BmN细胞系、Sf9细胞系、Tn细胞系和SL细胞系),结果发现BmIFV IRES介导的下游外源基因能够在BmN、Sf9和Tn细胞系中表达;SL细胞系中,BmIFV IRES介导和帽子结构介导的下游外源基因均未表达,经Dot blotting分析发现在添加重组病毒vR-IFV599-G的SL细胞中,未杂交到EGFP的mRNA,由此推测所构建的重组杆状病毒未侵染SL细胞或多角体启动子未能在SL细胞中被激活,导致EGFP的mRNA未转录。进而证实BmIFV的IRES功能在BmN、Sf9和Tn细胞系中无种属特异性。构建含有双荧光蛋白的重组杆状病毒vR-IFV599-G侵染5龄起蚕发现：被重组病毒侵染的家蚕全身都具有红色和绿色荧光。对被感染家蚕的4种组织(中肠、丝腺、脂肪体和表皮)进行Western blotting分析发现：4种组织中均具有红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的杂交条带出现,说明BmIFV的IRES介导的下游外源基因的表达在家蚕中无组织特异性。这与BmIFV特异性的侵染家蚕中肠组织杯状细胞的特性有差异,说明BmIFV侵染的特异性与其翻译的特性无关,可能与其侵染受体的特异性或复制的特异性有关。根据BmIFV的5’端序列设计5条siRNA序列(siRNA-Loop4、 siRNA-Loop7、siRNA-Loop8、siRNA-Loop12和siRNA-Loop15),通过瞬时转染的方法,将5条siRNA转染到BmN细胞中,再用重组杆状病毒vR-IFV599-F接种侵染细胞,发现RNAi-Loop15可显著抑制BmIFV IRES介导的下游的萤火虫荧光素酶基因的表达。进而我们利用piggy Bac转座体系成功构建了含有shRNA-Loop15的可供G418筛选的转基因BmN细胞(T-15i-BmN)。综上所述,本研究证明了BmIFV的5’端序列具有非帽子依赖的IRES功能,且该功能在BmN、Sf9和Tn细胞系中无种属特异性与在家蚕组织中无组织特异性。同时,应用RNA干扰技术能够显著抑制BmIFV的IRES活性,并针对IRES功能序列构建了转基因细胞。

关键词：家蚕传染性软化病病毒家蚕杆状病毒表达系统内部核糖体进入位点翻译起始机制 RNA干扰

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CarMV和IFV衣壳结构、SrMV柱状内含体的电子显微镜三维重构研究

CarMV和IFV衣壳结构、SrMV柱状内含体的电子显微镜三维重构研究

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作者：谢礼浙江大学

学位级别：博士

病毒不但严重威胁人类健康和生命，还引起农作物及禽、畜和经济动物的流行性病害，造成严重的经济损失。对于病毒的研究一直是结构生物学和病理学研究的重要课题。运用传统电子显微学技术和现代结构生物学技术研究病毒蛋白聚合物的三维... 详细信息

病毒不但严重威胁人类健康和生命，还引起农作物及禽、畜和经济动物的流行性病害，造成严重的经济损失。对于病毒的研究一直是结构生物学和病理学研究的重要课题。运用传统电子显微学技术和现代结构生物学技术研究病毒蛋白聚合物的三维结构对了解这些蛋白如何发挥生物学功能，病毒如何完成生命周期具有重要意义。本文运用冷冻电镜单颗粒技术研究了麝香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus，CarMV）和家蚕传染性软化病病毒（Infectious flacherie virus，IFV）的三维空间结构;运用常规超薄切片电镜技术和电子断层成像技术研究了高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）柱状内含体（cylindrical inclusion，CI）的结构以及与胞间连丝的相互联系。得到以下研究结果：运用I-ELISA检测、核酸测序、SDS-PAGE蛋白电泳以及免疫吸附电镜等多种技术鉴定了CarMV云南分离物。细胞病理学观察和免疫金标记定位发现CarMV散布在寄主细胞的细胞质和液泡中，不形成内含体，没有明显的细胞病变特征，叶绿体和线粒体发生病变式膨胀，外壳蛋白在叶绿体中有分布。比较了PEG沉淀法、氯化铯密度梯度离心法和超滤法对该病毒精提纯的效果，探索了适用于冷冻电镜特殊要求的CarMV提纯方法和条件，通过氯化铯密度梯度离心法得到了适用于冻电镜三维重构研究的CarMV精提纯样品。运用冷冻电镜结合单颗粒技术研究了pH7.0的CarMV粒子，得到了分辨率为18（?）的衣壳三维立体结构，经eotest检验并以FSC的数据做图观察其曲线有收敛趋势，证明了重构的可靠性。CarMV病毒衣壳直径为354（?），3次对称轴周围有贯穿衣壳的孔洞，亚基（subunit）排列松散。将该结果已报道的CarMV晶体结构进行比较，结果发现二者在剖分数（T值）、衣壳表面突起的数量以及衣壳的层数上存在差异。冷冻电镜结果显示水溶液状态下CarMV的T=1，表面突起为60个，为双层衣壳;而晶体学结果报道晶体状态下CarMV的T=3，表面突起为90个，为单层衣壳。在对前人报道的番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）和南方菜豆花叶病毒属（Sobemovirus）成员晶体学数据进行比较研究中，运用‘PROSITE’软件分析了植物病毒二十面体衣壳蛋白S结构域特征肽，结合对该特征肽的拓扑学结构所进行的研究分析，发现了一些共同特征：保守序列排列方式不是连续而是间隔的;间隔距离和保守性位点的位置严格保守;位点内保守性较宽松，氨基酸性质相同即可。分离鉴定并提纯了IFV。运用冷冻电镜结合单颗粒技术研究了IFV粒子，得到分辨率为17（?）的衣壳三维立体结构，经eotest检验并以FSC的数据做图观察其曲线有收敛趋势，证明了重构的可靠性。重构结果显示IFV粒子遵循二十面体P=3对称规则，直径为302.4（?），衣壳厚度为15（?）。三维密度图显示IFV衣壳粒子表面光滑，无毛刺和突起。将IFV衣壳三维结构与亲缘关系较接近的蟋蟀麻痹病毒（CrPV）（昆虫类小RNA病毒）和人类鼻病毒（HRV14）、门戈病毒（Mengovirus）、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）和口蹄疫病毒（FMDV）（脊椎动物小RNA病毒）的衣壳三维结构作比较，发现IFV衣壳的三维结构更接近CrPV。运用‘phyre’肽链折叠预测工具得到了IFV-VP2、IFV-VP3的肽链折叠结构，并将预测结果同CrPV晶体结构的肽链进行比较，发现相似度较高。从IFV粒子光滑的表面缺乏明显的沟壑来看，IFV逃避寄主追踪并不是采用类似“峡谷”假说的机制，而是另一种目前未知的机制。运用常规超薄切片电镜观察结合ET三维重构技术研究了SrMV侵染的玉米叶片细胞中柱状内含体（CI）超微结构以及与胞间连丝之间的相互联系。结果显示：细胞质中分布了大量柱状内含体，其基部与粗面内质网或细胞膜相连，线状病毒粒子纵向排列在柱状体的蛋白板上;在侵染早期CI垂直于细胞壁，基部通过细胞膜与胞间连丝相连，每个CI的中央轴芯和辐射状排列的蛋白板可与多个胞间连丝通道相连，胞间连丝直径明显增大，并有线状病毒样粒子通过CI与胞间连丝连接通道穿越的现象;CI与胞间连丝的连接也存在于维管束组织中，游离的CI存在于筛管内。对厚切片（200nm）进行ET三维重构得到的三维立体模型证实了CI的结构以及与胞间连丝的连接关系。通过对该模型进行分割、渲染，结合超薄切片电镜观察所得到的结果进行CI生物学功能分析，我们初步认为：（1） Potyvirus的柱状内含体在病毒胞间运动中起着重要辅助作用，CI能定向连接胞间连丝，帮助纵向定位在CI蛋白板上的病毒粒子完成胞间运动。（2） CI中央的孔道并不是由单独的结构部件所组成，单个CI

关键词：电子显微镜三维重构单颗粒技术电子断层成像技术麝香石竹斑驳病毒家蚕传染性软化病病毒高粱花叶病毒柱状内含体

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