检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：关洪鑫中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的一种人兽共患传染病，可以导致被感染的家畜生产机能严重下降，相关畜产品品质不佳，并且严重影响畜产品及其相关产品的国际... 详细信息

口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的一种人兽共患传染病，可以导致被感染的家畜生产机能严重下降，相关畜产品品质不佳，并且严重影响畜产品及其相关产品的国际贸易，给国民经济带来巨大冲击。目前，对口蹄疫的防治主要是以灭活疫苗为主，但是随着防疫标准的不断提高，以及出于生物安全的考虑，传统疫苗暴露出了一系列的问题。因此，研制新型的基因工程疫苗显得异常重要。为鉴定O型FMDV衣壳抗原的耐酸稳定性相关位点，通过改变相关位点以提高衣壳抗原在家蚕杆状病毒表达系统（Bombyx mori baculovirorus expression system）中的表达量，最终研制基因亚单位疫苗。本研究利用PH6.0的PBS对FMDV O/ON/CHA/株进行酸化处理，经Tris（PH7.6）中和后，通过中性红蚀斑克隆技术得到两株耐酸性单克隆毒株S-A和S-B。将二者的P1基因与未酸化处理的原毒的P1基因进行序列比对，在编码衣壳蛋白的P1基因上发现4个突变位点，其中VP1的N17D和VP2的D86H氨基酸突变为两株共有，且为错义突变；位于VP3和VP4上两个突变未导致氨基酸改变。合成P12A2B3C基因，将其中的两个错义突变的位点进行替换，密码子优化后，构建穿梭质粒pVL-P12A2B3C，与线性化的Bm-BacPAK6DNA共转染家蚕的BmN细胞，收获重组病毒Bm-P12A2B3C。免疫荧光检测显示，外源基因获得正确表达。用重组毒感染5龄的家蚕幼虫，双抗体夹心ELISA法检测家蚕淋巴血，可成功检测到O型FMDV衣壳抗原，1:640稀释时为阳性，高于对照组的1:80，且其保存时间也明显提高。为进一步研究影响O型FMDV衣壳抗原高效表达的相关区域，以能高效表达衣壳抗原的AsiaⅠ型/HNK/CHA/05FMDV的P12A2B3C为骨架，将O型FMDV的5个主要抗原位点以四种组合形式替换到该骨架上，四种形式分别为：VP1全部替换；VP2上的13个氨基酸及VP1；VP3上的3个氨基酸及VP1；VP1及VP2的13个氨基酸和VP3的3个氨基酸全部替换。之后按照先前的方法在家蚕体内表达衣壳抗原，经检测，可成功表达嵌合抗原，四种嵌合抗原1:320稀释后均为阳性。VP1替换后，表达量较AsiaⅠ型大幅下降，表明VP1可能是影响O型FMDV衣壳抗原在家蚕体内高效表达的主要区域。

关键词： FMDV 耐酸改造抗原位点替换家蚕杆状病毒表达系统衣壳抗原

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麻疹核蛋白基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及鉴定

麻疹核蛋白基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及鉴定

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作者：马丽敏温州医科大学

学位级别：硕士

麻疹是由麻疹病毒(Measles Virus，MV)通过飞沫传播引起的一种以出疹、发热为主要临床表现的急性呼吸道传染病。麻疹病毒属副粘病毒科麻疹病毒属，为单股负链RNA病毒，编码6种结构蛋白，从3'端到5'端分别次序为:核蛋白(N)、磷蛋... 详细信息

麻疹是由麻疹病毒(Measles Virus，MV)通过飞沫传播引起的一种以出疹、发热为主要临床表现的急性呼吸道传染病。麻疹病毒属副粘病毒科麻疹病毒属，为单股负链RNA病毒，编码6种结构蛋白，从3'端到5'端分别次序为:核蛋白(N)、磷蛋白(P)、内膜蛋白(M)、血溶素蛋白(F)、血凝素蛋白(H)以及RNA聚合酶(L)，各基因的起始序列与终止序列都含有与mRNA的合成与加工有关系的共有序列。　　近年的研究发现，在麻疹病毒的6个结构基因中，核蛋白(N)基因和血凝素(H)基因变异最大，N基因C末端450个核苷酸为该病毒最大变异区。在不同的麻疹野毒株之间最高变异程度可达12％，故N基因是国际上公认对麻疹毒株鉴定的重要指标。在麻疹病毒感染的急性期会产生强烈的体液免疫和细胞免疫，在所有结构蛋白中，核蛋白最早刺激机体产生有效的免疫反应。　　目前麻疹检测方法主要有血清学检测和病原学检测，临床采用的检测方法一般直接利用麻疹全病毒作为抗原，存在分离困难和生物安全的问题。本研究试图通过表达重组蛋白获得具有一定抗原性的麻疹核蛋白，代替麻疹全抗原检测人群IgG抗体。为此，本试验选取麻疹病毒的核蛋白进行研究，通过成功表达麻疹核蛋白并检测其基本的抗原性，为开发快速、特异的麻疹血清抗体检测试剂奠定了基础。　　本文以NCBI中麻疹病毒基因序列（GenBank: DQ211902.1）为基础，选取麻疹病毒核蛋白基因，通过PCR技术扩增核蛋白基因并连接到克隆载体。为更好适应大肠杆菌表达，将该目的片段分为两个小片段（A段40bp-873bp，B段739bp-1536bp）连接到原核表达载体pET28a(+)，成功构建了重组质粒pET-28a-MV-NA/NB，转化表达菌BL21(DE3)，重组大肠菌于37℃0.5mmol/LIPTG诱导表达4h后，该菌体裂解物经SDS-PAGE分析，在分子量约为30 kDa和29kDa处分别出现一条特异性蛋白条带，与预期的目的蛋白分子质量相符。Western blot检测结果显示麻疹核蛋白基因在大肠杆菌中表达成功，将重组蛋白按不同的量包被进行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其抗原性，结果显示，兔免疫血清结果良好，而人免疫血清出现非特异性，P/N＜2.1，因而该重组蛋白不适合用于麻疹病毒人免疫血清学检测。　　将麻疹核蛋白基因序列定向连接到真核表达时所用转载移体pVL1393上，鉴定后得到重组质粒pVL-MV-N，将病毒Bm-BacPAK6 DNA进行线性化处理后，与pVL-MV-N共转染家蚕BmN细胞。成功发生同源重组或转座后获得重组病毒BacPAK6-MV-N，用其感染家蚕5龄幼虫，收集幼蚕血淋巴，Western blot检测结果显示该重组蛋白在家蚕表达系统中得到成功表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)显示，兔免疫血清及人免疫血清结果良好，表明所表达蛋白有较好的特异性和抗原性，可用于麻疹病毒血清学检测。本研究为制备安全有效的麻疹基因工程疫苗、研制诊断试剂盒、研究病毒粒子的形成和病毒与细胞受体的相互关系等奠定基础。

关键词：麻疹病毒核蛋白基因原核表达家蚕杆状病毒表达系统抗原表达血凝素蛋白

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《蚕业科学》(双月刊)2014年第40卷总目次

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蚕业科学 2014年第6期 1139-1148页

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A型与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达

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江苏农业科学 2012年第9期40卷 28-31页

作者：刘航田永强张韵李志勇柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃兰州730046 兰州交通大学化学与生物工程学院甘肃兰州730070

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建... 详细信息

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物,结果显示目的蛋白在感染病毒后108 h的蚕血淋巴中表达量最高,A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1 024,而亚洲Ⅰ型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2 048。结果表明A型和亚洲Ⅰ型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。

关键词： A型口蹄疫病毒基因工程疫苗 P1—2A3C基因家蚕杆状病毒表达系统

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家蚕传染性软化病病毒翻译起始机制的研究

家蚕传染性软化病病毒翻译起始机制的研究

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作者：李明乾浙江大学

学位级别：博士

家蚕软化病是一类严重影响蚕业生产的病害,家蚕传染性软化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus, BmIFV)作为导致该病的重要病原之一,曾引起国内外学者的广泛关注。BmIFV是一种正义单链小RNA病毒,专一寄生家蚕中肠组织的杯状... 详细信息

家蚕软化病是一类严重影响蚕业生产的病害,家蚕传染性软化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus, BmIFV)作为导致该病的重要病原之一,曾引起国内外学者的广泛关注。BmIFV是一种正义单链小RNA病毒,专一寄生家蚕中肠组织的杯状细胞,被归入小RNA病毒目(Picornavirales)传染性软化病毒科(Iflaviridae)传染性软化病毒属(Iflavirus)。本研究通过运用生物信息学分析BmIFV结构蛋白前的5’端序列发现：其5’端序列具有多个同框的起始密码子AUG(具有相同的终止密码子)且5’端序列的前端与具有内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)功能的榕透翅毒蛾病毒(Perina nuda virus, PnV)的序列结构十分相似,而其后端与小RNA病毒Ⅱ型的IRES结构十分相似。通过构建含有双荧光蛋白基因和双荧光素酶基因的两类重组杆状病毒表达系统,验证不同长度的BmIFV5’端序列的IRES功能。结果证实：BmIFV不同长度的5’端片段具有不同的IRES活性,其中1-155nt片段的IRES介导下游外源基因的翻译活性最低,而1-599nt片段的IRES介导外源蛋白的翻译活性最高。利用构建的含有双荧光蛋白的重组杆状病毒vR-IFV599-G侵染四种鳞翅目昆虫细胞系(BmN细胞系、Sf9细胞系、Tn细胞系和SL细胞系),结果发现BmIFV IRES介导的下游外源基因能够在BmN、Sf9和Tn细胞系中表达;SL细胞系中,BmIFV IRES介导和帽子结构介导的下游外源基因均未表达,经Dot blotting分析发现在添加重组病毒vR-IFV599-G的SL细胞中,未杂交到EGFP的mRNA,由此推测所构建的重组杆状病毒未侵染SL细胞或多角体启动子未能在SL细胞中被激活,导致EGFP的mRNA未转录。进而证实BmIFV的IRES功能在BmN、Sf9和Tn细胞系中无种属特异性。构建含有双荧光蛋白的重组杆状病毒vR-IFV599-G侵染5龄起蚕发现：被重组病毒侵染的家蚕全身都具有红色和绿色荧光。对被感染家蚕的4种组织(中肠、丝腺、脂肪体和表皮)进行Western blotting分析发现：4种组织中均具有红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的杂交条带出现,说明BmIFV的IRES介导的下游外源基因的表达在家蚕中无组织特异性。这与BmIFV特异性的侵染家蚕中肠组织杯状细胞的特性有差异,说明BmIFV侵染的特异性与其翻译的特性无关,可能与其侵染受体的特异性或复制的特异性有关。根据BmIFV的5’端序列设计5条siRNA序列(siRNA-Loop4、 siRNA-Loop7、siRNA-Loop8、siRNA-Loop12和siRNA-Loop15),通过瞬时转染的方法,将5条siRNA转染到BmN细胞中,再用重组杆状病毒vR-IFV599-F接种侵染细胞,发现RNAi-Loop15可显著抑制BmIFV IRES介导的下游的萤火虫荧光素酶基因的表达。进而我们利用piggy Bac转座体系成功构建了含有shRNA-Loop15的可供G418筛选的转基因BmN细胞(T-15i-BmN)。综上所述,本研究证明了BmIFV的5’端序列具有非帽子依赖的IRES功能,且该功能在BmN、Sf9和Tn细胞系中无种属特异性与在家蚕组织中无组织特异性。同时,应用RNA干扰技术能够显著抑制BmIFV的IRES活性,并针对IRES功能序列构建了转基因细胞。

关键词：家蚕传染性软化病病毒家蚕杆状病毒表达系统内部核糖体进入位点翻译起始机制 RNA干扰

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MABV VP2、VP3基因及SVCV G、M基因在家蚕细胞中的表达

MABV VP2、VP3基因及SVCV G、M基因在家蚕细胞中的表达

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作者：何时雨福建农林大学

学位级别：硕士

海洋双RNA病毒（MABV）能够引起海洋生物尤其是鱼贝类生物的腹水病等，该病的暴发给海产养殖业带来巨大的经济损失。MABV隶属于双RNA病毒科水生生物双RNA病毒属，传染性胰腺坏死病毒（IPNV）是该属的代表种。VP2和VP3为MABV病毒的主要... 详细信息

海洋双RNA病毒（MABV）能够引起海洋生物尤其是鱼贝类生物的腹水病等，该病的暴发给海产养殖业带来巨大的经济损失。MABV隶属于双RNA病毒科水生生物双RNA病毒属，传染性胰腺坏死病毒（IPNV）是该属的代表种。VP2和VP3为MABV病毒的主要结构蛋白，常用于该病毒的诊断和疫苗设计。鲤春病毒血症病毒（SVCV）引起的鲤春病毒血症（SVC）是一种急性、出血性、高致死性的传染性疾病，它的流行给各国特别是欧洲的水产养殖业带来了巨大的经济损失。近年来，该病已扩展到美洲和亚洲，成为鱼类重要的传染性疾病。SVCV隶属于弹状病毒科水泡性病毒属，G蛋白是其囊膜蛋白，M蛋白是其基质蛋白，二者都是病毒的主要结构蛋白，常用于该病毒的诊断和疫苗设计。本研究利用家蚕杆状病毒表达系统实现了MABV主要结构蛋白基因VP2e和VP3以及SVCV囊膜蛋白基因G和基质蛋白基因M在家蚕细胞中的表达。首先，以PCR扩增获得了VP2e、VP3及G蛋白、M蛋白基因；其次，与载体PMD19-T连接，验证正确后，再将其分别克隆到载体pFastBac HTB和pFastBacI上，获得了转移质粒pHTB-VP2e、pHTB-VP3以及pF1-G和pF1-M；然后，将转移质粒转化具家蚕杆状病毒（BmNPV）Bacmid的*** BmDH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，PCR验证后，获得了重组Bacmid His-VP2e/rBm、His-VP3/rBm以及G/rBm和M/rBm；最后，提取重组Bacmid DNA，利用脂质体转染家蚕Bm5细胞，获得了重组杆状病毒His-VP2e/vBm、His-VP3/vBm及G/vBm和M/vBm。收集感染病毒细胞，经SDS-PAGE、Western blot分析，表明，VP2e、VP3及G、M基因在家蚕细胞内成功进行了表达。这为进一步研究MABV VP2e、VP3和SVCV G蛋白、M蛋白的功能，开发快速诊断试剂盒及利用这些表达蛋白进行MABV和SVCV的疫苗研究奠定了研究基础。通过对SVCV G蛋白的生物信息学分析，我们发现其具有信号肽、跨膜域等，我们构建了表达SVCV G蛋白不同结构域片段的重组病毒Bacmid，为阐明G蛋白的结构域打下了研究基础。首先，将增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因克隆至载体pcDNA3.1，构建载体pcDNA3.1-EGFP。然后，分别克隆G蛋白基因的不同片段至pcDNA3.1-EGFP，构建载体pcDNA3.1-EGFP-G、pcDNA3.1-EGFP-GA、pcDNA3.1-EGFP-GB、pcDNA3.1-EGFP-G(1-466)。再分别将EGFP-G、EGFP-GA、EGFP-GB、EGFP-G(1-466)等基因片段克隆至转移载体pFastBac I，构建转移质粒pF1-EGFP-G、 pF1-EGFP-GA、 pF1-EGFP-GB和pF1-EGFP-G(1-466)；提取转移质粒DNA，转化*** BmDH10Bac感受态细胞，获得了重组Bacmid EGFP-G/rBm、 EGFP-GA/rBm、 EGFP-GB/rBm和EGFP-G(1-466)/rBm；将进一步通过在家蚕细胞中融合表达这些基因片段及EGFP，明确SVCV G蛋白的信号肽、跨膜域等蛋白的结构域。

关键词：海洋双RNA病毒 VP2e VP3 鲤春病毒 G蛋白 M蛋白家蚕杆状病毒表达系统

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蚕素Bombyxin B4（Bbx-b4）基因的表达及其产物活性研究

蚕素Bombyxin B4（Bbx-b4）基因的表达及其产物活性研究

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作者：陈维芹浙江理工大学

学位级别：硕士

蚕素（bombyx mori bombyxin）是一种属于胰岛素家族的5kD的家蚕脑组织分泌肽，是由A-链和B-链组成的异源二聚体，氨基酸序列与脊椎动物胰岛素有较高的同源性。虽然蚕素的具体功能现在尚不完全清楚，其在家蚕中的一些基本功能可能像生... 详细信息

蚕素（bombyx mori bombyxin）是一种属于胰岛素家族的5kD的家蚕脑组织分泌肽，是由A-链和B-链组成的异源二聚体，氨基酸序列与脊椎动物胰岛素有较高的同源性。虽然蚕素的具体功能现在尚不完全清楚，其在家蚕中的一些基本功能可能像生长因子一样，对各个发育时期和各个组织的细胞生长、增殖和分化起作用，可能通过调节细胞增殖和分化与卵子发生和胚胎发生的调控有关。另外，蚕素的含量增长与血淋巴中葡萄糖滴度增加有很大相关性，所以可能与体内碳水化合物的代谢有关。所以大量制备蚕素蛋白对其功能研究有重要意义。本研究利用原核表达系统和家蚕杆状病毒载体表达系统分别在大肠杆菌和家蚕中表达蚕素蛋白，并对家蚕表达的蚕素进行了降血糖作用研究。首先，通过融合家蚕杆状病毒病毒多角体基因(polyhedrin,Polh)，本研究将Bbx-b4基因在大肠杆菌中高效表达，利用多角体蛋白的碱可溶性分离纯化重组蚕素作为抗原免疫制备了多克隆抗体，同时，将Bbx-b4克隆到pFastBac1中构建重组载体，利用转座重组构建了重组BmNPV。重组病毒，分别在大肠杆菌和家蚕细胞BmN中表达。原核表达融合蛋白利用多角体特点，通过调节缓冲液pH变化溶解包涵体和镍柱亲和层析的方法进行蛋白纯化，将纯化的重组蛋白免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体；将成功构建的pFastBac1-Bbx-b4转化感受态细胞*** DH10Bac，经蓝白斑筛选和PCR检测方法证明Bacmid中含有目的片段，脂质体法将重组Bacmid转染家蚕细胞，获得完整的重组杆状病毒，重组病毒在BmN细胞中扩增，经三代传代后，收集重组病毒液，接种新鲜蚕蛹，Western blotting检测结果表明在发病家蚕细胞BmN和发病蚕蛹中以蚕素原的形式存在。同时流式细胞检测表明Bbx-b4蚕素原会加速BmN细胞进入S期，具有促进细胞生长的能力。小鼠降血糖实验表明蚕蛹中表达的Bbx-b4蚕素原较正常蚕蛹具有一定的降血糖作用。本实验结果提示蚕素可能与体内碳水化合物的代谢有关，为其以后的应用研究奠定了基础。

关键词：蚕素 Bbx-b4 多角体融合表达家蚕杆状病毒表达系统降血糖活性

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家蚕表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的研究

家蚕表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的研究

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作者：南芙蓉浙江理工大学

学位级别：硕士

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种常见的累及关节的自身免疫性疾病。研究表明，肿瘤坏死因子TNFα是RA病理机制中的关键因子，重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)是一种可溶性肿瘤坏死因子拮抗剂，可特异... 详细信息

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种常见的累及关节的自身免疫性疾病。研究表明，肿瘤坏死因子TNFα是RA病理机制中的关键因子，重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)是一种可溶性肿瘤坏死因子拮抗剂，可特异性地与体内的肿瘤坏死因子（TNFα）竞争性结合，从而抑制TNFα诱发的关节免疫反应，达到治疗类风湿性关节炎的目的。家蚕杆状病毒表达系统作为一种新的真核表达系统，具有生产成本低、安全性高、高效、表达产物翻译后修饰水平高等优势，是外源蛋白表达研究的理想表达系统。本研究尝试利用家蚕杆状病毒表达系统来表达纯化重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)。首先，我们利用Bac-to-Bac系统构建了重组转移载体pFast-BacⅠ-（rhTNFR-Fc），并转化大肠杆菌感受态DH10Bac筛选出重组Bacmid。用脂质体介导法将重组Bacmid转染家蚕BmN细胞，获得重组杆状病毒vBm-（rhTNFR-Fc）。然后将扩增的F4代重组病毒感染家蚕BmN细胞，接种家蚕五龄幼虫和蚕蛹，经鉴定目的蛋白在BmN细胞、蚕血淋巴和蚕蛹中均得到表达。我们从蚕血淋巴中纯化得到rhTNFR-Fc融合蛋白，利用糖苷酶PNGaseF对纯化后的蛋白进行酶切去糖基化分析，酶切后的rhTNFR-Fc蛋白比去糖基化前小2～3kDa，但比预期分子量还要大，说明rhTNFR-Fc蛋白在该表达系统中得到了N-糖基化修饰，并可能存在O-糖基化修饰。最后，我们采用夹心ELISA法检测融合蛋白rhTNFR-Fc的受体结合活性，并用MTT法检测该蛋白的中和活性，结果表明纯化后的目的蛋白具有很好的体外生物学活性，为接下来研究该蛋白对佐剂型大鼠关节炎模型的治疗效果奠定基础。本研究证实利用家蚕杆状病毒表达系统可以高效表达并纯化出有生物活性的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)，为该蛋白的高效表达提供了一种新途径，也为在家蚕杆状病毒表达系统中表达其它的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。

关键词：家蚕杆状病毒表达系统 rhTNFR-Fc融合蛋白表达纯化糖基化生物学活性

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家蚕BmNPV Polh⁺Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建方法

家蚕BmNPV Polh<Sup>+</Sup>Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建方...

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作者：相兴伟吴小锋于少芳杨锐 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号

本发明公开了一种家蚕BmNPV Polh+Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建方法：以家蚕野生型BmNPV基因组DNA为模板，分别以P10-upF/P10-upB和P10-downF/P10-downB为引物PCR扩增得p10-up和p10-down，处理后插入到pUC19中的BamHI-PstI-HindII... 详细信息

标准号: CN101724652A

本发明公开了一种家蚕BmNPV Polh⁺Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建方法：以家蚕野生型BmNPV基因组DNA为模板，分别以P10-upF/P10-upB和P10-downF/P10-downB为引物PCR扩增得p10-up和p10-down，处理后插入到pUC19中的BamHI-PstI-HindIII位点，得重组质粒pUC19-p10-up-down；利用pUC19-p10-up-polh-down、脂质体lipofectin和MilliQ H₂O制备DNA-Lipofectin混合液，加入到BmN细胞中培养；收集转染后的细胞上清，接种BmN细胞，回收多角体；从多角体中抽提病毒DNA并电转化DH10β感受态细胞，筛选蓝斑培养；对PCR阳性的菌斑培养后抽提大分子DNA转染入BmN细胞；从AcMNPV Bac-to-Bac的DH10Bac培养菌中分离获得辅助质粒；将辅助质粒转化入含有Polh⁺BmBacmid的*** DH10β中，筛选同时含有Polh⁺BmBacmid和辅助质粒的DH10β菌株。本发明可产生经口添食即可感染的重组病毒，重组病毒无需经皮接种感染，提高家蚕杆状病毒表达系统的生产效率。

关键词：辅助质粒细胞重组病毒抽提家蚕转染培养接种家蚕杆状病毒表达系统杆状病毒表达系统筛选大分子DNA 基因组DNA 细胞上清重组质粒病毒DNA 混合液野生型脂质体感染经口菌斑菌株引物转化回收

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深海嗜压菌SS9中水通道蛋白基因的异源表达及生物学功能评价

深海嗜压菌SS9中水通道蛋白基因的异源表达及生物学功能评价

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作者：陈旭浙江大学

学位级别：硕士

水通道蛋白(AQP)对水具有极高的渗透性,有可能在仿生废水回收以及海水淡化等领域具有潜在的重要应用价值。本论文的研究目标是对来源于深海嗜压菌Photobacterium profundum SS9的潜在水通道蛋白基因(aqpSS9)进行在多种异源表达体系中进... 详细信息

水通道蛋白(AQP)对水具有极高的渗透性,有可能在仿生废水回收以及海水淡化等领域具有潜在的重要应用价值。本论文的研究目标是对来源于深海嗜压菌Photobacterium profundum SS9的潜在水通道蛋白基因(aqpSS9)进行在多种异源表达体系中进行表达,并分析其可能的生物学功能。首先利用生物信息学分析表明,AqpSS9肽链一级结构与大肠杆菌AqpZ的同源性高达67%,内含水通道蛋白的2个NPA保守序列,具有6个跨膜结构,从而具有强烈疏水特性,预测将整合在细胞膜上,有可能是一种新型的水通道蛋白。采用PCR方法从P. profundum SS9细菌基因组扩增得到AqpSS9的编码基因,构建成功表达载体pUC19-AqpSS9和pSJ2-AqpSS9,转化大肠杆菌,形成大肠杆菌MM/pUC19-AqpSS9和MM/pSJ2-AqpSS9。然后将这二种基因工程菌与AqpZ-改造菌MM1211(aqpZ-)在低渗条件下分别进行混合培养,以观察重组菌与改造菌的生长竞争现象。实验发现重组菌对改造菌有极明显的生长竞争优势,两者菌量比值最高可达32倍,从而间接鉴定了AqpSS9具有一定的水透过功能。进一步对AqpSS9在大肠杆菌中的表达条件进行优化。在优化了诱导条件(包括诱导时间、培养温度、IPTG浓度、诱导后培养时间)下,*** Rossetta(DE3)对AqpSS9的活性表达效率最高,AqpSS9表达量达48 mg/L。最后,为有效避免AqpSS9因强烈疏水性而导致的细胞毒性,论文采用适合于细胞毒性蛋白表达的Bac-to-Bac家蚕杆状病毒真核表达系统开展AqpSS9表达的研究。首先构建了重组穿梭载体Bacmid-AqpSS9,转染家蚕BmN细胞,发病后获得重组家蚕多角体病毒rBmAqpSS9。经过数代扩增,收获并保存适宜滴度的病毒储液,按感染复数MOI为5感染BmN细胞,最终成功表达了AqpSS9,表达量高达130 mg/L。

关键词：水通道蛋白深海微生物功能鉴定大肠杆菌家蚕杆状病毒表达系统 Photobacterium profundum SS9

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