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生物工程学报 2016年第8期32卷 1093-1103页

作者：李田张亮申琦赵威李黎吕银蒋贵兵闫登峰肖俊杰陈萍西南大学生物技术学院重庆400716 重庆市蚕业管理总站重庆400716

观察不同生长期家蚕幼虫血淋巴在体外的黑化速度和对大肠杆菌生长的影响结果显示,随食桑生长幼虫血淋巴的黑化速度逐渐变快,对大肠杆菌生长的抑制作用逐渐增强。RT-PCR实验显示,黑色素合成催化酶Bm Tan、Bm Po-1、Bm Yellow-f和Bm Ddc... 详细信息

观察不同生长期家蚕幼虫血淋巴在体外的黑化速度和对大肠杆菌生长的影响结果显示,随食桑生长幼虫血淋巴的黑化速度逐渐变快,对大肠杆菌生长的抑制作用逐渐增强。RT-PCR实验显示,黑色素合成催化酶Bm Tan、Bm Po-1、Bm Yellow-f和Bm Ddc等的基因在家蚕5 L 3 d血淋巴中表达量高,Bm Black、Bm Yellow和Bm Pah等的基因也有明显表达。q PCR分析显示,黑化病蚕中Bmtan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack,尤其Bmddc表达发生了显著上调。与对照相比,Ddc酶的抑制剂能显著抑制脂多糖对血淋巴的诱导黑化作用。用大肠杆菌注射家蚕幼虫,血淋巴中多巴和多巴胺的含量明显上升。这些表明家蚕幼虫血淋巴黑化与防御免疫有关,Bmddc很可能在幼虫血淋巴的免疫黑化中发挥作用。

关键词：家蚕血淋巴黑化反应黑色素合成催化酶免疫应答

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家蚕血淋巴中氨基代谢物的定量分析研究

家蚕血淋巴中氨基代谢物的定量分析研究

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作者：王瑾华中科技大学

学位级别：博士

生物体中含有种类繁多的氨基代谢物,包括生物胺、氨基酸、氨基酸衍生物、儿茶酚胺和芳香胺等。这些氨基代谢物在生物体的生命活动过程中都发挥着重要作用,其含量变化能够在一定程度上反映机体的不同生理病理状态,因此检测分析氨基代谢... 详细信息

生物体中含有种类繁多的氨基代谢物,包括生物胺、氨基酸、氨基酸衍生物、儿茶酚胺和芳香胺等。这些氨基代谢物在生物体的生命活动过程中都发挥着重要作用,其含量变化能够在一定程度上反映机体的不同生理病理状态,因此检测分析氨基代谢物对相关疾病的诊断和生理病理的研究具有重要意义。靶标代谢组学是对已知代谢物进行定性定量分析,具有从已知代谢物中直接提取生物信息的优势。以液相色谱质谱为基础的靶标代谢组学,可以通过选择合适的分离方法、离子化方法和质量分析器来达到对不同代谢物进行定性定量分析的目的。本文采用新的柱前衍生化试剂5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(5-aminoisoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate,5-AIQC)应用UHPLC-MS/MS对含氨基的代谢物进行分析。本方法通过加入点击反应试剂N-乙基马来酰亚胺和抗氧化试剂,可以同时定量含巯基和二硫键的氨基代谢物、易氧化的氨基代谢物以及其他氨基代谢物。方法还可以检测已报道的衍生化试剂(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate,6-AQC)不能衍生的芳香胺,而且5-AIQC衍生化方法具有更高的灵敏度。该方法检测的124种分析物包括4种氨基糖、20种蛋白氨基酸、57种非蛋白氨基酸、17种修饰氨基酸、26种脂肪胺、8种芳香胺、22种含硫物质、14种神经递质和8种小肽。其中大多数具有相同质荷比(m/z)的同分异构体分析物在反相色谱柱上均可得到分离,且在质谱中均可进行定量分析。该方法定量分析的氨基代谢物涵盖了超过20多种代谢通路,如蛋白质合成/降解、精氨酸的合成、谷胱甘肽和神经递质的合成、尿素循环、尿苷分解和多胺通路等。在对混合标准品、人肾癌组织提取物、大鼠尿液和血清样品中的氨基代谢物进行分析时,本方法中大部分分析物包括含巯基和二硫键的氨基代谢物以及易氧化的胺类物质,具有很好的精密度、准确度、线性关系和回收率。运用该方法对不同生长发育时期家蚕血淋巴中的氨基代谢物进行检测,共检测出45种氨基代谢物,包括常见的20种蛋白氨基酸、11种非蛋白氨基酸、6种含硫代谢物、2种多胺、2种儿茶酚胺和2种乙醇胺,其中文献较少报道有谷胱甘肽、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、2-氨基己二酸、γ-氨基丁酸、2-氨基丁酸、3-氨基异丁酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸砜、腐胺、1,3二氨基丙烷、多巴胺和多巴。在家蚕不同生长发育时期,这些氨基代谢物的浓度变化较大,且不同氨基代谢物的浓度水平也具有较大差异。常见的蛋白氨基酸浓度普遍较高,能达到1mM以上。家蚕在生长发育过程中对不同氨基代谢物的需求不同,因此其机体含量也不相同。绝大多数氨基酸在眠期浓度增加,眠后浓度减少,预蛹期浓度普遍增加。通过比较不同品种家蚕在生长发育的不同时期各氨基代谢物浓度的变化,我们发现:原种蚕(A)与杂交蚕(B和C)在不同时期多数代谢物浓度在同一水平;与家蚕主要生理活动(如色素合成、丝蛋白合成、脯氨酸能量代谢等)相关的氨基代谢物浓度差异较大。三组家蚕在预蛹期都产生大量的蛋氨酸亚砜,其浓度比之前生长发育时期高出2个数量级,可能是由蛋白质的甲硫氨酸残基氧化后降解产生。5-AIQC柱前衍生化氨基代谢物的定量方法能够有效的应用于生物样品的测试中。本方法一次进样可以同时定量测定大量的氨基代谢物,具有潜在的应用于临床化学的价值。

关键词：靶标代谢组学氨基代谢物 5-AIQC UHPLC-MS/MS 家蚕血淋巴定量分析

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家蚕血淋巴中结合类胡萝卜素的蛋白

家蚕血淋巴中结合类胡萝卜素的蛋白

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作者：刘虹均江苏科技大学

学位级别：硕士

类胡萝卜素作为一种天然着色剂,是家蚕蚕茧的颜色来源。在家蚕血淋巴中对类胡萝卜素转运机理的研究可以为家蚕体内类胡萝卜素转运机制的相关研究提供参考和借鉴,同时也为家蚕生产发育的研究提供线索。本文经过色谱和质谱的分析技术确定... 详细信息

类胡萝卜素作为一种天然着色剂,是家蚕蚕茧的颜色来源。在家蚕血淋巴中对类胡萝卜素转运机理的研究可以为家蚕体内类胡萝卜素转运机制的相关研究提供参考和借鉴,同时也为家蚕生产发育的研究提供线索。本文经过色谱和质谱的分析技术确定家蚕幼虫血淋巴中具有结合类胡萝卜素能力的可能蛋白质。将家蚕幼虫血淋巴依次运用阴离子交换层析、阳离子交换层析及分子筛三步纯化后进行质谱分析,表明家蚕幼虫血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白质是载脂蛋白II/I。同时对三种家蚕品种的血淋巴进行色谱分析,实验发现不同家蚕品种血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白质含量的存在差异,家蚕品种Kyp22和4001的血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白质相对于家蚕品种P50的血淋巴中的含量较多。色谱层析和质谱层析实验确定了家蚕血淋巴中结合类胡萝卜素的可能蛋白为载脂蛋白II/I,将载脂蛋白II的基因进行分段克隆和原核表达,实验发现分段表达的载脂蛋白II均为可溶性蛋白质,对载脂蛋白II分段原核表达的蛋白质进行色谱层析,发现目的蛋白LP-II-1(Met1-Leu409)结合类胡萝卜素的能力比目的蛋白LP-II-2(Glu300-Tyr687)和LP-II(Met1-Tyr687)结合能力稍强。为了进一步研究家蚕载脂蛋白,通过原核表达系统表达载脂蛋白III其表达量相对较低,为了研究如何提高其表达量,本实验在不同大肠杆菌表达菌株、不同IPTG诱导浓度和不同诱导温度的条件下研究家蚕载脂蛋白III的表达情况。结论如下:选择不同大肠杆菌表达菌株,家蚕载脂蛋白III的表达没有明显差异;随着IPTG诱导浓度的提高,家蚕载脂蛋白III的表达量也随之增加;诱导温度降低有利于家蚕载脂蛋白III可溶部分的表达,包涵体的表达量相对降低。家蚕血淋巴具有结合类胡萝卜素能力的蛋白为载脂蛋白II/I,实验结果进一步完善了家蚕体内类胡萝卜素转运机制,为后续实验提供依据。

关键词：家蚕血淋巴类胡萝卜素结合能力载脂蛋白

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家蚕血淋巴对BmE细胞凋亡的抑制作用

家蚕血淋巴对BmE细胞凋亡的抑制作用

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作者：邓为科西南大学

学位级别：硕士

细胞凋亡也称程序性细胞死亡(Programmed cell death)，是具有特殊形态学和生化改变的生理性细胞死亡形式。家蚕细胞凋亡的研究，对揭示全变态昆虫的发育生物学、遗传调控机制具有重大的理论意义，并且对蚕业科学的应用研究也有非常重... 详细信息

细胞凋亡也称程序性细胞死亡(Programmed cell death)，是具有特殊形态学和生化改变的生理性细胞死亡形式。家蚕细胞凋亡的研究，对揭示全变态昆虫的发育生物学、遗传调控机制具有重大的理论意义，并且对蚕业科学的应用研究也有非常重要的理论指导意义。本研究旨在对放线菌素D诱导家蚕BmE细胞凋亡机制进行初步的研究，并对家蚕血淋巴抑制该凋亡的机制进行初步探讨；分析比较了多种细胞凋亡检测方法，筛选、优化适合检测家蚕细胞凋亡的方法，建立家蚕细胞凋亡的简单模型；为研究家蚕细胞凋亡奠定了初步的细胞学基础。本论文利用形态学观察、分子生物学检测方法以及放线菌素D体外共培养方法，研究了家蚕细胞凋亡特征；在显微镜下，观察细胞核的形态变化特征；利用琼脂糖凝胶电泳法检测了凋亡细胞的DNA降解片段；利用PI单染和Annexin V／PI双染在流式细胞仪上定性定量检测了细胞总凋亡率和早期凋亡率。检测了家蚕蚕血淋巴对NPV中的抗凋亡基因p35基因表达的影响。研究结果如下： 1) 家蚕BmE细胞凋亡过程的变化：当放线菌素D浓度为150ng／ml作用12h，家蚕BmE细胞发生了明显凋亡。在荧光显微镜下观察到细胞核固缩、凝聚和断裂，出现浓染致密的颗粒块；染色质出现边聚现象，即染色质凝聚成块靠近核膜，成半月状；细胞核内出现3个或者3个以上的荧光碎片凋亡小体；在电镜下可见染色质断裂、染色质边缘化、凋亡小体等典型的细胞凋亡现象。在0h，12h，24h，36h的时间范围内，家蚕细胞的凋亡指数随时间的延长而增加，反映了放线菌素D诱导凋亡的时间依赖性效应。在相同的作用时间下，随着药物浓度的增加，DNA梯度条带也随之变得明显。在同一浓度下，拖带现象随放线菌素D作用时间的延长而显著，即在一定范围内呈现剂量依赖性和时间依赖性。家蚕BmE细胞的凋亡峰变化，浓度分别为0、50、100、200 ng／ml的放线菌素D作用12hPI单染流式检测细胞凋亡率分别是1.82+0.57％、1.35±0.76％、2.35±0.98％、8.21±1.86％、13.54±2.52％，剂量不同，诱导的凋亡细胞所占百分率不相同，凋亡百分率随时间延长而增高。然而50ng／ml作用12小时之后，反而凋亡率比对照低，正如以前文献中报道的，低

关键词：细胞凋亡家蚕血淋巴 BmE细胞放线菌素D p35基因

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杆状病毒早期感染对家蚕血淋巴细胞的影响以及宿主细胞的应激反应研究

杆状病毒早期感染对家蚕血淋巴细胞的影响以及宿主细胞的应激反应...

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作者：王冠南京师范大学

学位级别：硕士

本实验以BmNPV-家蚕血淋巴细胞这一系统为研究对象，运用家兔免疫的方法获得病毒粒子的多克隆抗体再辅助二抗标记实现在In vivo的条件下标记病毒粒子，建立一个In vivo的条件下利用激光共聚焦技术实时研究病毒感染的新方法。运用BmNPV... 详细信息

本实验以BmNPV-家蚕血淋巴细胞这一系统为研究对象，运用家兔免疫的方法获得病毒粒子的多克隆抗体再辅助二抗标记实现在In vivo的条件下标记病毒粒子，建立一个In vivo的条件下利用激光共聚焦技术实时研究病毒感染的新方法。运用BmNPV的病毒粒子实时采集的家蚕血淋巴细胞感染吸附后的一个小时计为0时间，激光共聚焦实时跟踪时间为1-3小时。跟踪研究病毒在感染早期对于宿主细胞的钙离子和线粒体的影响。实验通过对正常与病毒感染细胞内以Fluo-3标记钙离子的荧光信号的实施跟踪，采集细胞范围内荧光信号数据，观察其变化过程。发现：在正常情况下家蚕血淋巴细胞内钙离子浓度的变化具有规则的波动性，振幅一致，周期较为恒定约为900s，且相邻的细胞具有相同的波动特征以及良好的同步性；在病毒感染的情况下，钙离子浓度总体上有所增加，且波动周期延长、浓度变化的灵敏度降低。说明病毒感染会影响正常条件下钙离子有规律的释放与聚集的过程，推测感染早期病毒携带的病毒编码的糖蛋白修饰质膜所造成的胞内一些细胞器(内质网、线粒体等)的膜通透性损伤性改变是胞内钙离子浓度增加，是钙离子聚集与释放过程失调的主要原因。病毒依赖细胞骨架的质-核运输过程也是钙离子浓度升高的一个因素。而相邻细胞钙离子浓度变化的一致性体现了通过钙离子而实现的细胞间信号传递过程。实验通过与研究钙离子相同的病毒感染方式对正常与病毒感染细胞内以Rhodamine123标记线粒体的荧光信号的实施跟踪发现：线粒体的膜电位在细胞正常条件下也具有规则的波动性，周期恒定约为500s，但是在波形上与钙离子的波动有着比较大的差别，而在病毒感染的条件下线粒体的活性变化具有三种不同的紊乱形式。说明线粒体的膜电位可以反映线粒体膜上呼吸链的状态，即体现了线粒体功能状态以及活性。而其在病毒感染的条件下的三种不同的紊乱形式，体现了病毒与宿主细胞之间的相互作用的不同结果。推测为宿主细胞死亡、凋亡或为对病毒感染的可承受状态。对于三种状态的选择线粒体起了关键的作用。认为细胞内钙离子浓度的一段时间的升高易造成线粒体膜上钙离子超载，再加上线粒体自身受到的伤害，按照其损伤程度的不同，产生不同的结果，或损伤在可以承受的范围内则维持原有的状态，使得病毒得以持续感染；或损伤使得膜间质中的自由基，和一些凋亡前体肴片邓佬吠，尹2004届柳{全笋夕老戈产次厉毒早筋澎奕刀紧菌恤球巴绷糟劣多瀚以资按金绷脸甜应减反应研泞释放至胞内引发对细胞的伤害以及凋亡的发生;或者损伤严重造成线粒体的活性过低，没有足够的能量引发凋亡，则细胞死亡。不同的结果体现了线粒体在凋亡过程中的重要性，以及病毒与宿主细胞的相互作用。对感染不同时期淋巴细胞中三种保护性酶(CAT、户00、500)活力的测定结果为:病毒感染引起体内一系列保护酶活性的相应升高，而随感染的进行到后期酶活有所降低。说明在感染过程中线粒体受到损伤会产生大量自由基释放至胞内而激活了清除自由基的相关酶。综合以上可认为病毒感染早期就会对宿主细胞的产能系统、信号传导系统、保护酶系统产生一定的影响，造成宿主细胞不同的应激反应。而宿主细胞的这些反应对病毒感染过程亦有一定的反作用。

关键词：杆状病毒家蚕血淋巴激光共聚焦显微术钙离子线粒体

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免疫诱导家蚕血淋巴的抗菌与抗肿瘤活性研究

免疫诱导家蚕血淋巴的抗菌与抗肿瘤活性研究

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作者：龙燕山东农业大学

学位级别：硕士

家蚕,是一种典型经济昆虫。家蚕生命周期由蚕卵、幼虫、蚕蛹、成虫四个阶段组成。家蚕各阶段形态、生理机能完全不同,属于完全变态生物。家蚕按化性可分为一化性、二化性、多化性品种。化性不同,蚕的大小、体质、茧质存在差异,对不良环... 详细信息

家蚕,是一种典型经济昆虫。家蚕生命周期由蚕卵、幼虫、蚕蛹、成虫四个阶段组成。家蚕各阶段形态、生理机能完全不同,属于完全变态生物。家蚕按化性可分为一化性、二化性、多化性品种。化性不同,蚕的大小、体质、茧质存在差异,对不良环境的适应能力由强到弱依次为多化性、二化性、一化性。据商务部办公厅统计,2013年我国桑蚕种发放数量1655万张,桑蚕茧产量65万吨,桑蚕丝产量13.4万吨。家蚕幼虫主要通过食桑摄取、存储食物营养,为吐丝结茧提供蚕丝原材料。除此之外,家蚕幼虫已用于生物反应器、基因工程、医药等方面的研究。其中,感染白僵菌形成的白僵蚕的医药价值早在李时珍的《本草纲目》就有记载:灭诸疮瘢痕、主治小儿惊痫夜啼、瘰疬、头风、风虫齿痛、散风痰结核等。将家蚕幼虫感染虫草孢子获取具有药用价值的蚕虫草也获得了越来越多的关注。家蚕幼虫血淋巴在抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凋亡组分引起的细胞凋亡、凝集作用、可作昆虫细胞培养基等方面已有报道。然而,针对不同化性家蚕经不同外源物质刺激免疫后的血淋巴的生物医学功能研究,目前尚无研究。基于此,本论文以大肠杆菌、肿瘤细胞、生理盐水等刺激不同化性家蚕,收集免疫血淋巴。分析其理化性质并研究它们对细菌、哺乳动物红细胞凝集、肿瘤细胞增殖、小鼠急性毒理的影响,更深入地挖掘家蚕血淋巴潜在的药用功效,探究其在生物医学上的新用途。课题主要由两方面组成:免疫家蚕血淋巴的采集及后处理、理化性质、凝集作用、抗菌、体外抗肿瘤、体内急性毒理性等生物医学活性研究。主要内容包括:(1)首先通过细菌、肿瘤细胞、生理盐水注射到一化性、二化性5龄家蚕血腔中,免疫24 h,不做任何处理的作为空白对照。免疫诱导结束后,大批量收集不同化性家蚕血淋巴,并作离心、热处理及冷冻干燥等工艺处理。(2)其次对后处理的血淋巴进行理化性质包括pH、光谱吸收、质量分数等检测。pH计测其酸碱度值;紫外分光光度计测定7种血淋巴在190-900 nm的吸收光谱;冷冻干燥后,由前后质量差计算它们的质量分数。结果发现,不同化性家蚕经过不同诱导免疫后,血淋巴均呈弱酸性。约250 nm处均有一个吸收峰,吸光度值最小的是二化性的细菌处理组,仅为1.3左右;其次是一化性的正常组,吸光度值约为1.4;其余5种诱导免疫组较大且统一,吸光度值约为1.6。而在430nm处,两种化性的菌免疫组及一化性的细胞免疫组出现一个新的波峰。(3)通过玻片法、96孔板法测定血淋巴与鼠、兔、人、猪等哺乳动物红细胞的体外凝集反应。玻片法测定结果是7种血淋巴对鼠、兔红细胞均有凝集作用,96孔板法检测结果是除了uct-sh没有凝集素活力外,其他6组均具不同程度的凝集素活力。(4)抑菌圈试验、微量稀释法及菌生长曲线试验等分别定性、定量测定家蚕血淋巴对细菌的抑杀效果,测定抑菌圈直径、最小抑菌浓度及菌的生长曲线变化等指标。抑菌圈试验结果表明7种家蚕血淋巴对金黄色葡萄球菌无抑菌作用,只有菌免疫诱导的两种化性家蚕血淋巴具有抑制大肠杆菌活性,且具有热稳定性。50-100℃范围内ubt-sh的mic均小于5.96ng/ml,ubt-sh随着温度升高mic逐渐减小。7种家蚕血淋巴均可降低大肠杆菌***12d31生长曲线。(5)通过静态、动态mtt及流式细胞凋亡试验研究家蚕血淋巴对肿瘤细胞增殖的影响,观察细胞形态、计算细胞增殖抑制率、凋亡率等分析家蚕血淋巴对肿瘤细胞的体外作用,研究结果表明,家蚕血淋巴可改变细胞形态,促使细胞变圆、皱缩,能抑制sw1990和mcf7细胞的生长,各时间及浓度下的uct-sh均表现肿瘤生长抑制作用。(6)通过琼脂培养法体外培养mda-mb-231多细胞肿瘤球体,并绘制肿瘤球体生长曲线。研究7种家蚕血淋巴对mda-mb-231多细胞肿瘤球体成型后的影响,主要观察多细胞肿瘤球体形态及体积的变化趋势。实验结果表明,琼脂培养法可成功构建mda-mb-231多细胞肿瘤球体。mts0-8h缓慢生长、16-20h快速增大、20-38h增长平缓且趋于稳定,平均体积约为1.0mm3。7种家蚕血淋巴可影响mts形态,肿瘤球体边缘呈棉絮状,透亮细胞消失。与对照组相比,7种家蚕血淋巴能减缓mts增幅,ubt-sh和bns-sh组的mts体积增长比率低于1,即这两组血淋巴可减小肿瘤体积。(7)一化性、二化性家蚕血淋巴在6h内分别按剂量15000mg/kg、5001mg/kg灌胃balb/c小鼠,研究这些血淋巴对balb/c小鼠的急性毒理作用。观察小鼠活动状态、称量体重、检测肝肾功能、血常规、解剖尸体并观察各脏器组织等指标。实验结果表明,实验组各指标与阴性对照组比较均无显著性差异,按照化合物经口急性毒性标准可判定家蚕血淋巴无毒。

关键词：家蚕血淋巴免疫诱导化性抗菌活性抗肿瘤活性

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家蚕血淋巴黑化的免疫机制研究

家蚕血淋巴黑化的免疫机制研究

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中国蚕学会第九届青年学术研讨会

作者：李田陈萍西南大学生物技术学院

家蚕及其它昆虫为开放式血液循环,所有组织器官浸浴在血液中,当外源物攻破昆虫体壁这个物理屏障后,首先面对的是血液,血液是它们免疫防卫的重要器官。血淋巴黑化是家蚕病变的重要代表。家蚕血淋巴在空气中会迅速变黑。利用毛细管减少血... 详细信息

家蚕及其它昆虫为开放式血液循环,所有组织器官浸浴在血液中,当外源物攻破昆虫体壁这个物理屏障后,首先面对的是血液,血液是它们免疫防卫的重要器官。血淋巴黑化是家蚕病变的重要代表。家蚕血淋巴在空气中会迅速变黑。利用毛细管减少血淋巴与空气接触面积从而减慢血淋巴黑化的速度来研究黑化与免疫防御的关系,结果发现大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白僵菌及其细胞壁物质脂多糖、肽聚糖和甘露聚糖均能诱导家蚕血淋巴发生黑化反应,而且随食桑生长幼虫血淋巴的黑化速度逐渐变快、对大肠杆菌的抑制作用逐渐增强,表明血淋巴黑化有免疫防御作用,能被相关分子诱导或启动。我们利用qPCR手段比较了体色斑纹色素代谢途径上催化酶基因Bmpah、Bmth、Bmblack、Bmyellow、Bmyellow-f、Bmdat1、Bmebony、Bmtan、Bmpo-1和Bmddc等的m RNA变化,发现黑化病蚕中Bmtan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack,尤其Bmddc表达发生了显著上调,并且DDC酶抑制剂能阻止脂多糖诱导体外血淋巴变黑。通过分离血细胞和血浆发现家蚕幼虫血淋巴黑化主要源于血浆中酚氧化酶(PO)的作用,当血淋巴与大肠杆菌混合后细胞破碎速度减慢,而且才有黑化血细胞发生,说明血淋巴体外黑化包括氧化黑化和免疫黑化两大类型,当免疫原存在时,血细胞优先选择免疫防御作用。用大肠杆菌注射幼虫血腔,观察从感染到完成免疫的细胞特征、细胞数目以及细胞类型的变化过程,发现聚团细胞和黑化细胞是血淋巴循化系统重要的免疫机制;细胞数目变化趋势是血淋巴循化系统免疫黑化过程的生理特征,因幼虫发育阶段不同而异;染色显示血腔中有大量的浆细胞形成去参与细胞聚团和细胞黑化。

关键词：家蚕血淋巴黑化细胞免疫机制

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家蚕血淋巴体外黑化观察及相关黑色素合成催化酶基因

家蚕血淋巴体外黑化观察及相关黑色素合成催化酶基因

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第十二届家（柞）蚕遗传育种暨良种繁育学术研讨会

作者：李田张亮申琦赵威李黎吕银蒋贵兵闫登峰肖俊杰陈萍西南大学生物技术学院重庆市蚕业管理总站

观察不同生长期家蚕幼虫血淋巴在体外的黑化速度和对大肠杆菌生长的影响显示,随食桑生长幼虫血淋巴的黑化速度逐渐变快、对大肠杆菌生长的抑制作用逐渐增强。RT-PCR实验显示,黑色素合成催化酶BmTan、Bm Po-1、BmYellow-f和Bm Ddc等的基... 详细信息

观察不同生长期家蚕幼虫血淋巴在体外的黑化速度和对大肠杆菌生长的影响显示,随食桑生长幼虫血淋巴的黑化速度逐渐变快、对大肠杆菌生长的抑制作用逐渐增强。RT-PCR实验显示,黑色素合成催化酶BmTan、Bm Po-1、BmYellow-f和Bm Ddc等的基因在家蚕5L3d血淋巴中表达量高,BmBlack、BmYellow和BmPah等的基因也有明显表达。qPCR分析显示,黑化病蚕中Bmtan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack,尤其Bmddc表达发生了显著上调。与对照相比,Ddc酶的抑制剂能显著抑制脂多糖对血淋巴的诱导黑化作用。用大肠杆菌注射家蚕幼虫,血淋巴中多巴和多巴胺的含量明显上升。这些表明家蚕幼虫血淋巴黑化与防御免疫有关,Bmddc很可能在幼虫血淋巴的免疫黑化中发挥作用。

关键词：家蚕血淋巴黑化反应黑色素合成催化酶免疫应答

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载脂蛋白Ⅱ/Ⅰ-家蚕血淋巴中的类胡萝卜素结合蛋白质

载脂蛋白Ⅱ/Ⅰ-家蚕血淋巴中的类胡萝卜素结合蛋白质

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全国农业生物化学与分子生物学第十四届学术研讨会

作者：刘虹均汪生鹏江苏科技大学生物技术学院江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室江苏镇江 212018 江苏科技大学生物技术学院江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室江苏镇江 212018 中国农业科学院蚕业研究所农业部蚕桑遗传改良重点实验室江苏镇江 212018

将预处理的家蚕血淋巴以280nm、445nm和485nm为检测条件经阳离子层析柱和分子筛纯化得到类胡萝卜素结合蛋白质.纯化产物通过SDS-PAGE蛋白电泳和LTQ质谱分析,样品蛋白电泳的结果显示有约100 KDa和45 KDa两条主要条带,蛋白电泳的条带的LT... 详细信息

将预处理的家蚕血淋巴以280nm、445nm和485nm为检测条件经阳离子层析柱和分子筛纯化得到类胡萝卜素结合蛋白质.纯化产物通过SDS-PAGE蛋白电泳和LTQ质谱分析,样品蛋白电泳的结果显示有约100 KDa和45 KDa两条主要条带,蛋白电泳的条带的LTQ质谱分析显示100KDa的条带肽段几乎全部覆盖载脂蛋白Ⅰ,而45KDa的条带肽段几乎全部覆盖载脂蛋白Ⅱ,与载脂蛋白的理论相对分子质量比较发现实验中的载脂蛋白降解,因此在自然条件下载脂蛋白不稳定容易降解为小片段的分子.对色谱层析和质谱仪分析的结果综合分析表明家蚕血淋巴中类胡萝卜素结合蛋白质为载脂蛋白Ⅱ/Ⅰ.

关键词：家蚕血淋巴类胡萝卜素载脂蛋白

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基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方法

基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方法

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作者：李春峰孙滨潘国庆周泽扬许晨 400715 重庆市北碚区天生路2号

本发明公开了基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方法，具体方法如下：先饲养家蚕并用家蚕微孢子虫进行感染，饲养直至家蚕上蔟结茧；然后将结茧后的蚕蛹进行表面消毒，取蚕蛹血淋巴，筛选成功感染家蚕微孢子虫的蚕... 详细信息

标准号: CN106047790B

本发明公开了基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方法，具体方法如下：先饲养家蚕并用家蚕微孢子虫进行感染，饲养直至家蚕上蔟结茧；然后将结茧后的蚕蛹进行表面消毒，取蚕蛹血淋巴，筛选成功感染家蚕微孢子虫的蚕蛹血淋巴加入鳞翅目昆虫细胞sf9中培养，即获得感染家蚕微孢子虫的sf9细胞。本发明的方法步骤简单，感染效率高，并且不容易引入杂菌，实现了家蚕微孢子虫对鳞翅目昆虫细胞高效而稳定的侵染，为家蚕微孢子虫功能基因组、遗传操作、侵染机制等方面的研究材料提供了新的制备方法。

关键词：家蚕微孢子虫蚕蛹感染鳞翅目昆虫细胞血淋巴家蚕侵染对鳞翅目昆虫功能基因组家蚕血淋巴饲养表面消毒研究材料遗传操作杂菌制备并用筛选细胞引入成功

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