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生理学报 2002年第1期54卷 1-6页

作者：陈丽新王立伟 Tim JACOB3 广东医学院细胞生物学研究室广东医学院生理教研室湛江524023 Cardiff School of Biosciences

用膜片钳、反义寡核苷酸、免疫荧光及激光共聚焦显微镜等技术 ,研究MDR1基因在牛睫状体色素上皮(pigmentedciliaryepithelial,PCE)细胞容积激活性氯电流中的作用。PCE细胞表达MDR1基因产物 P糖蛋白 (P gp)。反义MDR1寡核苷酸抑制MDR1基... 详细信息

用膜片钳、反义寡核苷酸、免疫荧光及激光共聚焦显微镜等技术 ,研究MDR1基因在牛睫状体色素上皮(pigmentedciliaryepithelial,PCE)细胞容积激活性氯电流中的作用。PCE细胞表达MDR1基因产物 P糖蛋白 (P gp)。反义MDR1寡核苷酸抑制MDR1基因的表达 (P gp免疫荧光减少 93 % ) ,延缓容积激活性氯电流的出现 (潜伏期延长10 9% ) ,并导致激活率降低 62 %及电流峰值减小 5 6%。而核酸转染剂阳离子脂质体和非配对性的寡核苷酸对电流没有显著性影响。上述观察结果表明。

关键词：睫状体色素上皮细胞氯通道寡核苷酸反义基因表达 MDR1 容积激活性氯电流

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过表达氯离子通道蛋白3对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚的预防作用与机制

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第二军医大学学报 2021年第2期42卷 189-196页

作者：汪帅孙宇陈梦青唐敬卢群李春梅广东药科大学生命科学与生物制药学院生物化学与分子生物学系广州510006 中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所深圳440305 北京润美康医药有限公司北京101312

目的探讨氯离子通道蛋白3(ClC-3)基因过表达对异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥厚的预防作用及机制。方法运用腺相关病毒9(AAV9)感染方法构建ClC-3过表达小鼠模型和原代心肌细胞模型,采用蛋白质印迹法与qRT-PCR检测小鼠心脏组织和原... 详细信息

目的探讨氯离子通道蛋白3(ClC-3)基因过表达对异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥厚的预防作用及机制。方法运用腺相关病毒9(AAV9)感染方法构建ClC-3过表达小鼠模型和原代心肌细胞模型,采用蛋白质印迹法与qRT-PCR检测小鼠心脏组织和原代心肌细胞中ClC-3的表达以确定模型是否建立成功。32只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组8只。对照组连续7 d腹腔注射生理盐水,ISO组连续7 d腹腔注射ISO 7.5 mg•kg^-1•d^-1,AAV9-bv+ISO组用空白载体AAV9病毒颗粒感染小鼠4周后连续7 d腹腔注射ISO 7.5 mg•kg^-1•d^-1,AAV9-ClC-3+ISO组用携带ClC-3基因的AAV9病毒颗粒感染小鼠4周后连续7 d腹腔注射ISO 7.5 mg•kg^-1•d^-1。采用心脏超声检查小鼠心功能变化,计算心脏体重指数,采用qRT-PCR检测心肌组织中心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)的mRNA表达水平,H-E染色观察左心室形态学变化,苦味酸-天狼星红(PSR)染色观察心脏组织胶原纤维变化。取乳鼠摘出心脏,体外培养原代心肌细胞并分为4组,对照组未予任何干预,ISO组用0.1μmol/L ISO干预48 h,AAV9-ClC-3组用携带ClC-3基因的AAV9病毒颗粒感染细胞48 h,AAV9-ClC-3+ISO组用携带ClC-3基因的AAV9病毒颗粒和0.1μmol/L ISO共同干预48 h。采用芯片膜片钳技术检测小鼠原代心肌细胞的容积激活性氯电流(ICl,vol)。结果蛋白质印迹法和qRT-PCR检测结果均表明ClC-3过表达小鼠和原代心肌细胞模型成功建立。AAV9介导的ClC-3过表达能缓解ISO诱导的小鼠心脏体重指数、收缩末期室间隔厚度、收缩期左室后壁厚度和舒张期左室后壁厚度的增加,改善心脏组织形态学异常和心脏纤维化,减少心脏组织中ANP、BNP mRNA表达的增加,并能体外抑制ISO导致的心肌细胞ICl,vol降低。结论ClC-3过表达可预防ISO诱导的小鼠心肌肥厚,其机制可能与心肌细胞ICl,vol激活有关。

关键词：氯离子通道蛋白3 异丙肾上腺素肥厚型心肌病容积激活性氯电流

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CLC-3调节表皮干细胞迁移修复皮肤创面作用的研究

CLC-3调节表皮干细胞迁移修复皮肤创面作用的研究

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作者：郭锐第三军医大学

学位级别：博士

背景和目的:当创伤发生时,如果组织的完整和内部平衡重建,体内多种细胞内和细胞间的路径会被激活并相互协调(1)。研究发现表皮干细胞ESCs能够从表皮或表皮与皮脂腺间毛囊处漏斗管迁移参与表皮修复(1-5)。然而对此创面愈合复杂生理过程... 详细信息

背景和目的:当创伤发生时,如果组织的完整和内部平衡重建,体内多种细胞内和细胞间的路径会被激活并相互协调(1)。研究发现表皮干细胞ESCs能够从表皮或表皮与皮脂腺间毛囊处漏斗管迁移参与表皮修复(1-5)。然而对此创面愈合复杂生理过程的影响因素仍知之甚少。因为缺乏对控制表皮干细胞体积和创伤后迁移运动影响因素的进一步研究,这方面的研究知识很少。有研究报道在肿瘤发育和侵袭中,膜离子通道在肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡中起重要作用(6)。电压门控性钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道在乳腺癌(7)、黑色素瘤(8)、纤维肉瘤(9)的肿瘤侵袭和细胞迁移中起作用。氯离子通道是体内最重要的阴离子通道,基于它的门控机制,氯离子通道可以被分成五个亚型,其中之一是容积激活性氯离子通道(VACC)(10)。容积激活性氯离子通道(VACC)对因受渗透性的细胞肿胀刺激产生的容积激活性氯离子电流变化(ICl,vol)负有责任。通过VACC的氯离子和钾离子外流同钾离子通道一起导致被称为调节性体积减小(RVD)的细胞体积变小(11,12)。VACC变化已经确定在神经胶质瘤细胞迁移中起重要作用(13,14)。尽管目前对于主要负责提供容积激活性氯离子电流(ICl,vol)的通道蛋白仍然不确定,CLC-3,作为电压门控性氯离子通道CLC家族中的一员,是重要分子候选蛋白之一(15-17)。CLC-3是激活和调节容积激活性氯离子电流(ICl,vol)的分子成分(18,19)。在很多肿瘤细胞中它的蛋白表达得到确定,包括前列腺癌上皮细胞(20)、神经胶质瘤细胞(21)、PC12细胞(22)和CNE-2Z细胞(23)。大量研究重点放在了氯离子通道的表达及其在细胞迁移和侵袭中发挥作用上。问题是表皮干细胞上是否有CLC-3氯通道蛋白表达,如果有,CLC-3氯通道蛋白是否通过容积激活性氯离子电流(ICl,vol)或调节性体积减小(RVD)来调节表皮干细胞的细胞体积变化。创面修复过程中表皮干细胞迁移时CLC-3氯通道蛋白作用也没有在皮肤切除模型中研究过。因此,我们对表皮干细胞上CLC-3氯通道蛋白表达及容积激活性氯离子通道(VACC)功能作用进行了研究,使用RNA干扰抑制CLC-3氯通道蛋白表达来评估CLC-3氯通道蛋白在表皮干细胞迁移中的作用。本课题主要就表皮干细胞迁移的“内在动力”作为切入点,对clc-3氯通道蛋白在表皮干细胞迁移运动中的作用进行初步研究。我们对表皮干细胞迁移运动中clc-3氯通道蛋白所起调节作用的研究,将有助于寻找介入表皮干细胞迁移的靶点和挖掘有效促进创面愈合治疗措施。方法:1在体外培养的正常大鼠表皮干细胞中提取总rna,并用rt-pcr方法检测clc-3氯通道mrna在正常大鼠表皮干细胞上的表达。2westernblotting方法检测clc-3蛋白在正常大鼠表皮干细胞上的表达。3在体外培养的正常大鼠表皮干细胞上经过免疫荧光方法观察clc-3氯通道蛋白是否表达。4免疫荧光方法检测正常sd大鼠皮肤表皮干细胞分布情况及clc-3氯通道蛋白表达情况。免疫荧光双标染色观察正常大鼠急性皮肤伤切除模型创面愈合过程中创缘表皮干细胞分布情况及clc-3氯通道蛋白表达情况。5clc-3过表达及抑制表达载体构建、转染表皮干细胞及对表皮干细胞clc-3的影响。6clc-3过表达及抑制表达载体转染的表皮干细胞容积敏感性氯电流变化情况。7clc-3过表达及抑制表达载体转染表皮干细胞对表皮干细胞迁移运动能力的影响。8活细胞工作站技术动态观察clc-3过表达及抑制表达载体转染表皮干细胞后对表皮干细胞瞬时速度和运动轨迹长度的影响。结果:1在体外培养的正常大鼠表皮干细胞中提取总rna,并用rt-pcr方法检测发现clc-3氯通道mrna在正常大鼠表皮干细胞上表达。经1%琼脂糖凝胶电泳发现,阴性对照组无条带,而表皮干细胞在电泳结果上出现一条特异扩增条带,位置为200bp,表明clc-3氯通道mrna在正常大鼠表皮干细胞上表达。2westernblotting方法检测发现clc-3蛋白在正常大鼠表皮干细胞上表达。检测到一条分子量为92kda的clc-3蛋白在正常大鼠表皮干细胞上的表达。3在体外培养的正常大鼠表皮干细胞经过免疫荧光方法观察发现clc-3氯通道蛋白在正常大鼠表皮干细胞上表达。可以看到胞膜、胞浆有红色荧光的阳性表达,表明正常大鼠表皮干细胞上有clc-3氯通道蛋白表达,定位于胞膜、胞浆。4免疫荧光方法检测正常sd大鼠皮肤clc-3氯通道蛋白情况,我们选用一直被研究者公认并采用的标记物β1整合素作为escs的阳性筛选标记(绿色荧光),与clc-3氯通道蛋白共定位,结果显示可见表皮基底层细胞排列规则,整齐,表皮基底层细胞体积正常,细胞浆荧光强度弱,胞膜、胞浆有红色荧光的阳性表达。表明正常大鼠皮肤表皮上有

关键词：表皮干细胞 CLC-3氯通道蛋白迁移离子通道容积激活性氯电流创面愈合

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容积激活性氯离子通道蛋白ClC-3表达下调促进H9c2心肌细胞肥大及其机制研究

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安徽医科大学学报 2021年第7期56卷 1075-1081页

作者：孙宇陈梦青汪帅李艳文喻阳李咏琪李春梅广东药科大学生命科学与生物制药学院广州510006 中国科学院深圳先进技术研究院深圳440305

目的探讨容积激活性氯离子通道蛋白ClC-3表达下调对H9c2心肌细胞的影响及其机制。方法用siRNA转染H9c2心肌细胞构建ClC-3表达下调的细胞模型;免疫荧光染色观察H9c2细胞表面积;qRT-PCR检测H9c2细胞心房利钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)和β-肌... 详细信息

目的探讨容积激活性氯离子通道蛋白ClC-3表达下调对H9c2心肌细胞的影响及其机制。方法用siRNA转染H9c2心肌细胞构建ClC-3表达下调的细胞模型;免疫荧光染色观察H9c2细胞表面积;qRT-PCR检测H9c2细胞心房利钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)和β-肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA表达水平;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位(MMP)水平,图像分析系统研究H9c2心肌细胞的调节性体积回缩能力(RVD);全细胞膜片钳技术检测H9c2细胞膜上氯电流的变化。结果与空白组相比,siRNA转染H9c2细胞72 h能降低ClC-3 mRNA和蛋白的表达水平;而ClC-3下调与异丙肾上腺素相似,都增加H9c2心肌细胞表面积和心肌肥大标志性因子mRNA的表达,同时降低H9c2细胞的MMP和容积调节能力,抑制容积激活性氯离子电流的激活。结论ClC-3表达的下调能诱导H9c2心肌细胞肥大,其机制可能与其损伤线粒体功能、降低细胞容积调节能力和抑制容积激活性氯离子电流的激活有关。

关键词： ClC-3 H9c2细胞心肌细胞肥大线粒体膜电位容积激活性氯电流

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