检索结果-内蒙古大学图书馆

肠毒素大肠杆菌CS3定居因子抗原和融合肠毒素基因在减毒痢疾杆菌中的共表达

Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003年第1期35卷 49-54页

作者：刘陶陶李淑琴张兆山郑继平刘秀丽罗刚黄翠芬北京生物工程研究所 100071 北京生物工程研究所

肠毒素和定居因子抗原 (CFAs)是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)两种主要的致病因素。有效的ETEC疫苗应包括这两种成分。采用基因重组技术 ,将定居因子CFA/II的共有抗原成分CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素基因克隆至以asd基因为选择标记的重组... 详细信息

肠毒素和定居因子抗原 (CFAs)是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)两种主要的致病因素。有效的ETEC疫苗应包括这两种成分。采用基因重组技术 ,将定居因子CFA/II的共有抗原成分CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素基因克隆至以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因剔除的弗氏志贺氏菌Fwl0 1构成了宿主载体平衡致死系统。结果表明 ,在无抗生素条件选择的情况下 ,该重组菌可稳定表达CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素抗原。通过口服和鼻饲方式免疫小鼠 ,可诱生相应的血清IgG抗体 ,同时能够检测到分泌型IgA的产生 ,表明该重组菌可以有效的诱导产生粘膜免疫。

关键词：肠毒素大肠杆菌 CS3菌毛肠毒素弗氏志贺氏菌宿主载体平衡致死系统

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SG97A平衡致死系统的构建及其初步应用

引用

畜牧兽医学报 2015年第12期46卷 2243-2250页

作者：耿士忠陈晓娟潘志明焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

敲除鸡伤寒沙门菌(SG)减毒疫苗株97Aasd基因,构建宿主载体平衡致死系统并表达新城疫病毒(NDV)F蛋白,构建二价活菌苗。PCR扩增两段位于asd基因外侧的序列作为等位基因,以氯霉素抗性(CmR)基因替代asd基因,构建自杀质粒pGMB151Δasd::CmR,... 详细信息

敲除鸡伤寒沙门菌(SG)减毒疫苗株97Aasd基因,构建宿主载体平衡致死系统并表达新城疫病毒(NDV)F蛋白,构建二价活菌苗。PCR扩增两段位于asd基因外侧的序列作为等位基因,以氯霉素抗性(CmR)基因替代asd基因,构建自杀质粒pGMB151Δasd::CmR,通过***χ7213与SG97A固相杂交,将质粒转入SG97A,反向筛选获得SG97AΔasd::CmR,利用质粒pCP20去除CmR后,DAP的依赖菌株命名为SG97AΔasd。将含asd基因的质粒pYA3334转入SG97AΔasd中构建宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白。结果表明,通过等位基因重组方法,成功构建SG97AΔasd及宿主载体平衡致死系统,重组菌能够表达NDV-F蛋白,并能在鸡体内诱导产生特异性抗体。本研究成功构建SG97AΔasd宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白及其诱导宿主产生抗体,为应用该系统构建二价活菌苗的研究奠定了基础。

关键词：鸡伤寒沙门菌 asd基因宿主载体平衡致死系统 NDV-F蛋白

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2拷贝SLT-ⅡvB在猪霍乱沙门氏菌C500crp^-/asd^-缺失株中的表达及小鼠免疫试验

引用

中国畜牧兽医 2010年第7期37卷 70-73页

作者：徐引弟王治方朱文豪郭成留河南省农业科学院畜牧兽医研究所郑州450002

为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗,从pMDSLT-Ⅱ中扩增去信号肽后的SLT-ⅡvB基因,将2拷贝SLT-ⅡvB与pYA3493连接。阳性质粒pYA2B电转化C500crp-/asd-缺失株,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting,重组菌C500crp-/asd-(pYA2B)口服免疫小鼠,腹腔攻10 LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒C78-1和2 LD50的猪水肿大肠杆菌强毒ED3株,计算攻毒保护率。结果显示,2 SLT-ⅡvB在C500crp-/asd-缺失株中获得了表达。C500crp-/asd-(pYA2B)免疫组对ED3的攻击能提供60%保护,而对照组不能提供任何保护。2组对C78-1攻击均提供100%保护,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病二联疫苗及进一步提高免疫效果提供依据。

关键词：猪霍乱沙门氏菌C500crp-/asd-缺失株宿主载体平衡致死系统 2拷贝SLT-ⅡvB 基因表达免疫反应

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减毒鸡伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建及其携带外源基因的表达

减毒鸡伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建及其携带外源基因的表达

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作者：陈晓娟扬州大学

学位级别：硕士

沙门氏菌是一种非常重要的人兽共患病病原菌,主要引起人和动物的发热、肠炎、败血症等多种疾病症状,呈全球性分布。沙门氏菌为胞内侵袭性细菌,能有效呈递抗原,激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液免疫与细胞免疫,并能同时诱导黏... 详细信息

沙门氏菌是一种非常重要的人兽共患病病原菌,主要引起人和动物的发热、肠炎、败血症等多种疾病症状,呈全球性分布。沙门氏菌为胞内侵袭性细菌,能有效呈递抗原,激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液免疫与细胞免疫,并能同时诱导黏膜免疫与全身免疫。近几年,沙门氏菌常通过宿主载体平衡致死系统构建新型疫苗载体。减毒鸡伤寒沙门氏菌疫苗株97A是经转座突变及粗糙变异筛选所获得,本实验室已从安全性、免疫效力和病理组织学等各个方面对97A疫苗株作出评价,研究结果表明,该减毒株具有较好的安全性和免疫效力。本研究旨在研制更加安全的减毒鸡伤寒沙门氏菌97A疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体。以97A为亲本菌,缺失基因组中编码天冬氨酸-β-半乳糖脱氢酶的asd基因,构建asd宿主载体平衡致死系统,用于高效表达外源基因,初步应用该系统表达了红色荧光蛋白基因和新城疫F蛋白基因部分片段,为研制新型载体疫苗奠定了基础。 1.减毒鸡伤寒沙门氏菌97A△a sd缺失株的构建与鉴定为了研制更加安全的鸡伤寒沙门氏菌弱毒株,并使其开发为活疫苗载体,本研究构建了鸡伤寒沙门氏菌97A△asd缺失株,并以此建成宿主载体平衡致死系统。根据鸡伤寒沙门氏菌asd基因已发表的基因序列,设计并合成了2对引物,PCR方法扩增了asd上下游序列。通过氯霉素抗性基因替代asd基因中间片段,构建重组自杀性质粒,与鸡伤寒沙门氏菌野生菌接合转移,两步法筛选△asd缺失株。结果表明,△asd缺失株被成功构建,命名为97A△asd缺失株,其表型、生长特性及生化特征与野生菌保持一致。基因互补试验结果显示,该突变株能稳定表达红色荧光蛋白,即该宿主载体平衡致死系统能高效表达外源基因,为鸡伤寒沙门氏菌载体疫苗的进一步研究奠定了基础。 2.新城疫病毒F基因部分片段在减毒鸡伤寒沙门氏菌97A△a sd缺失株中的表达以重组质粒pVAX1-F为模板扩增594 bp的NDV-F基因部分片段,亚克隆至原核表达质粒pYA3334中,获得X6212(pYA3334-F)。从大肠杆菌X6212提取重组质粒pYA3334-F,并将其电转化沙门氏菌中间宿主X3730进行甲基化处理,最后将甲基化的原核表达质粒pYA3334-F电转化X4550,SDS-PAGE电泳和免疫试验检测到F表达。将验证正确的重组质粒pYA3334-F电转化97A△asd缺失株,SDS-PAGE电泳检测F表达。携带F的重组菌97A(pYA3334-F)及对照菌97A(pYA3334)以1×109 CFU/只肌注免疫雏鸡,结果表明该重组菌是安全的,免疫组产生了针对F蛋白的IgG抗体,二免二周平均抗体效价至1:200,三免二周平均抗体效价至1:400。上述结果为进一步研制新城疫新型疫苗奠定了基础。

关键词：减毒鸡伤寒沙门氏菌 asd基因宿主载体平衡致死系统基因表达

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猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株的构建及其作为疫苗活载体的初步应用

猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株的构建及其作为疫苗活载体的初步应用

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作者：胡娇扬州大学

学位级别：硕士

从上世纪70年代遗传工程技术兴起以来,出现了许多新的疫苗研究策略。减毒沙门菌作为疫苗载体具有安全、高效的特性,已受到医学与兽医学界的广泛重视。减毒沙门菌的主要优点包括它可以经黏膜途径免疫(口服或鼻内),操作方便,对接种宿主刺... 详细信息

从上世纪70年代遗传工程技术兴起以来,出现了许多新的疫苗研究策略。减毒沙门菌作为疫苗载体具有安全、高效的特性,已受到医学与兽医学界的广泛重视。减毒沙门菌的主要优点包括它可以经黏膜途径免疫(口服或鼻内),操作方便,对接种宿主刺激小。此外,沙门菌为兼性胞内寄生细菌,能有效呈递抗原,激发机体抗沙门菌和外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应,并能同时诱导黏膜免疫与全身免疫。为避免在基因工程活菌苗的研制中使用抗生素作为选择压,将减毒沙门菌用于宿主载体平衡致死系统中,使在没有抗生素存在的情况下,重组质粒能稳定存在于宿主体内。这样的疫苗设计为防控重大的动物疫病带来了新的希望。猪霍乱沙门菌减毒株C500 (Salmonella choleraesuis C500 strain)是通过化学致弱用于预防仔猪副伤寒的有效活菌苗,其免疫原性强,安全性好,使用40余年来使我国仔猪副伤寒得到了较好的控制。因此,利用减毒的猪霍乱沙门菌C500构建宿主载体平衡致死系统用于运送重要疾病病原基因疫苗很有实际应用价值。新城疫(Newcastle disease, ND)是由副粘病毒科禽腮腺炎病毒属中的新城疫病毒(Newcastle disease viruses, NDV)引起多种禽类发生感染和高度死亡的一种急性、接触性传染病,常给养禽业造成重大经济损失。在许多国家对该病的防控主要靠疫苗的免疫接种。NDV的融合蛋白F介导病毒与宿主细胞膜的融合,是病毒入侵细胞的重要分子。本研究构建了以猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株为运送载体的NDV F基因工程菌,以小鼠和鸡为动物模型,评价了其免疫特性,初步探索了猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株做为活疫苗载体的可行性。 1猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株宿主载体平衡致死系统的构建与鉴定根据GenBank中已发表的猪霍乱沙门菌asd基因的序列,设计两对引物分别扩增asd基因的上下游片段,然后构建含缺失1,107 bp的asd基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与猪霍乱沙门菌C500接合转移,两步法筛选无抗性的△asd缺失株,用PCR证实基因组asd基因的缺失突变。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株与其亲本株猪霍乱沙门菌C500的表型、生长特性基本一致,而其毒力有了进一步的下降。将携带asd基因的红色荧光蛋白质粒转化猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株后,在体外传至100代后仍可高效表达红色荧光蛋白,说明该缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株作为疫苗载体奠定了基础。 2新城疫病毒F蛋白在猪霍乱沙门菌C500△add缺失株中的表达及部分免疫特性分析复苏本实验室保存的重组菌X4550(pYA3334-F),进行PCR和SDS-PAGE鉴定,阳性菌提取重组质粒(pYA3334-F)电转化猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株,普通LB平板筛选阳性克隆,命名为猪霍乱沙门菌C500△asd(pYA3334-F).SDS-PAGE电泳检测到F蛋白的表达。动物免疫实验结果表明,重组菌猪霍乱沙门菌C500△asd(pYA3334-F能在小鼠和鸡体内诱导产生针对F蛋白的特异性抗体,显示本研究构建的以猪霍乱沙门菌C500△asd缺失株运送的外源抗原具有良好的免疫原性,能够激发有效的免疫应答,初步证明该系统做为活疫苗载体的可行性。

关键词：猪霍乱沙门菌C500 asd基因宿主载体平衡致死系统新城疫病毒 F

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