检索结果-内蒙古大学图书馆

中国病原生物学杂志 2022年第5期17卷 520-525,531页

作者：杨雨阳祁晶晶吕洁齐新伟马秀敏单骄宇新疆医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室新疆乌鲁木齐830017 新疆医科大学第一附属医院省部共建中亚高发病因与防治国家重点实验室新疆地方病分子生物学重点实验室新疆医科大学第五附属医院检验科新疆医科大学第三附属医院检验科

目的探究在包虫囊液干预过程中IFITM3与Foxp3之间的相互影响。方法小鼠细粒棘球蚴病造模后收集肝脏组织,通过HE染色、免疫组织化学方法检测肝脏组织中IFITM3和Foxp3的表达状况。采用Western blot和荧光定量PCR(Real-time PCR)测定未加... 详细信息

目的探究在包虫囊液干预过程中IFITM3与Foxp3之间的相互影响。方法小鼠细粒棘球蚴病造模后收集肝脏组织,通过HE染色、免疫组织化学方法检测肝脏组织中IFITM3和Foxp3的表达状况。采用Western blot和荧光定量PCR(Real-time PCR)测定未加囊液浓度(阴性组)、1∶10、1∶100和1∶1000共4组不同囊液浓度比例干预HEK293T细胞后IFITM3和Foxp3的蛋白表达量和mRNA相对表达量。用Spearman进行IFITM3和Foxp3相关性分析。结果HE染色后,可见CE肝脏组织的病灶;免疫组化结果显示随着细粒棘球蚴感染时间的延长,IFITM3在肝脏的表达量逐渐降低,Foxp3的表达量逐渐升高。在感染第2 d IFITM3的表达最高而Foxp3的表达量最低高,感染300 d IFITM3的表达量最低,Foxp3的表达量最高。Western blot显示,在4组囊液浓度比例干预下,IFITM3的灰度值分别是(1.421±0.162)、(0.798±0.091)、(0.936±0.118)、(1.269±0.101);Foxp3的灰度值分别是(0.614±0.034)、(0.761±0.020)、(0.919±0.019)、(1.115±0.177),说明IFITM3和Foxp3随着囊液干预浓度的降低表达量逐渐升高。Real-time PCR结果显示,在4组囊液浓度比例干预后IFITM3 mRNA相对表达水平分别是(1.00±0.322)、(0.605±0.321)、(0.736±0.113)、(2.384±0.049);Foxp3 mRNA相对表达水平分别是(1.000±0.153)、(1.321±0.316)、(1.675±0.376)、(3.848±1.645),说明随着囊液干预浓度的降低,IFITM3和Foxp3mRNA的相对表达量逐渐升高。Spearman相关分析结果显示,不同浓度囊液干预后,细胞中的IFITM3与Foxp3在mRNA相对表达和蛋白表达均成正相关。结论在细粒棘球蚴感染过程中,低浓度的囊液刺激会使IFITM3和Foxp3的表达量增高,并且IFITM3与Foxp3呈正相关性,说明宿主限制性因子IFITM3通过与核转录因子Foxp3存在关联,从而与获得性免疫发生联系。

关键词：细粒棘球蚴感染宿主限制性因子干扰素诱导的跨膜蛋白3 核转录因子Foxp3

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利用人全基因组CRISPR SAM激活文库筛选禽流感病毒宿主限制性因子

利用人全基因组CRISPR SAM激活文库筛选禽流感病毒宿主限制性因子

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作者：王玉鑫华中农业大学

学位级别：硕士

禽流感病毒(Aivan influenza virus,AIV)宿主广泛,不仅可以感染禽类造成养殖业经济损失,还能感染人、猪、犬等哺乳动物,导致严重的公共卫生安全问题。在长期进化过程中病毒的毒力不断增强,适应性突变也不断增多并稳定遗传,这都无疑是一... 详细信息

禽流感病毒(Aivan influenza virus,AIV)宿主广泛,不仅可以感染禽类造成养殖业经济损失,还能感染人、猪、犬等哺乳动物,导致严重的公共卫生安全问题。在长期进化过程中病毒的毒力不断增强,适应性突变也不断增多并稳定遗传,这都无疑是一种警示,禽流感病毒仍然是潜在的大流行病原。禽流感病毒的易突变性和高重组率为其跨种传播和免疫逃逸提供了基础,而宿主因子在防范病毒突破种间屏障中起重要作用。因此,通过挖掘决定禽流感病毒宿主谱的关键宿主因子并探究其机制,能够建立起宿主因子限制病毒感染的作用模式。全基因组筛选技术为我们提供了新的思路,本研究便是基于CRISPR SAM(CRISPR synergistic activation mediator)激活系统对人全基因组中禽流感病毒的宿主限制因子进行了筛选,并鉴定到多个新的抗病毒因子。主要研究内容如下: 1.A549-SAM文库细胞系的构建首先利用慢病毒包装人全基因组sgRNA文库质粒,并测定包装后的慢病毒滴度。接着将sgRNA文库慢病毒以MOI=0.3转导A549-MPH-d Cas9-VP64多克隆细胞,通过抗性药物对阳性细胞进行筛选,构建出了A549-SAM文库细胞。该SAM激活文库靶向人全基因组中23,728个基因,包含70,297条sgRNA序列。高通量测序(Next generation sequencing,NGS)显示构建好的文库细胞mapping率达74%,去重后的sgRNA数为70,204条,可覆盖文库99.87%sgRNA,表明该A549-SAM文库细胞构建成功,且具有良好的均一性和覆盖率,符合筛选要求。 2.禽流感病毒感染A549-SAM文库细胞筛选宿主限制因子将禽流感病毒A/Quail/Hong Kong/G1/97(G1/H9N2)毒株以MOI=1.0分别感染A549-SAM文库细胞和A549-MPH-d Cas9-VP64对照组细胞,至对照组细胞完全死亡后,收集感染后存活的文库细胞扩大培养并再次感染相同剂量病毒,以此重复感染5轮,并设置有三批平行样本。在每一轮感染中,三批A549-SAM细胞上清血凝价均较对照组细胞低,且血凝价差距随着感染轮次增加而加大。基因和sgRNA数量随着感染轮次大幅减少至第4轮进入平台期,且基因富集趋势逐渐显著,基因之间激活倍数拉开差距。Venn图分析显示三批平行样本间重复性良好,同时通过基因本体论分析(Gene ontology analysis,GO analysis)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析表明筛选到的基因参与了多种生物学进程、分子功能等。 3.候选靶基因对禽流感病毒的增殖影响对于富集程度靠前的12个基因,本研究构建了其开放阅读框(Open reading frame,ORF)过表达质粒,将各基因过表达质粒以不同剂量转染A549细胞后,感染表达荧光蛋白的禽流感病毒H9N2-G1-NA-EGFP并利用流式细胞术分析荧光率。其中转录翻译相关因子EEF、E2F;膜蛋白C1o、DER、STE;泛素连接酶RNF146和RNA结合蛋白PSP过表达后均对病毒产生不同程度的抑制效果。 4.靶基因RNF146抑制流感病毒复制在探究候选基因对病毒增殖影响的试验中,RNF146抑制效果较佳,因此对其进行进一步研究。为了确定RNF146对病毒增殖的抑制是否具有亚型特异性,在过表达或敲除RNF146的情况下,感染G1/H9N2和人流感病毒A/Puerto Rico/8-SV14-1934(PR8/H1N1)。通过噬斑试验和Western blot检测发现RNF146可抑制上述两种A型流感病毒(influenza A virus,IAV)复制。进一步探究发现,RNF146剂量依赖性地促进仙台病毒(Sendai virus,Sev)刺激下干扰素β(Interferonβ,IFN-β)、干扰素刺激反应原件(Interferon stimulated response element,ISRE)启动子活性,并显著提高IFN-β的转录水平。同时,在RNF146敲除情况下干扰素刺激基因(IFN-stimulated gene,ISG)IFIT1、ISG15、OAS3、OASL、MX1的转录水平均显著降低,表明RNF146是通过干扰素途径调控病毒复制。综上,本研究通过人全基因组CRISPR SAM激活文库对禽流感病毒G1/H9N2宿主限制性因子进行了筛选,并鉴定到EEF、C1o、RNF146等多个宿主抗病毒因子。在对RNF146进行进一步探究时,发现RNF146可通过天然免疫途径抑制流感病毒的增殖。本研究旨在为后续预防病毒跨种感染、宿主

关键词：流感病毒 CRISPR SAM 激活筛选宿主限制性因子 RNF146

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泡球蚴感染过程中宿主限制性因子IFITM3对TRIF/IRF3通路的影响研究

泡球蚴感染过程中宿主限制性因子IFITM3对TRIF/IRF3通路的影响研究

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作者：屈晴新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨泡球蚴感染过程中宿主限制性因子IFITM3对TRIF/IRF3通路的影响。方法:(1)利用STRING数据库分析TRIF、IRF3、IFNB1、IFITM3和Foxp3基因之间存在的潜在关联。(2)体内小鼠实验,共分为两组。(1)第一组小鼠实验共36只C57BL/6J雌性小... 详细信息

目的:探讨泡球蚴感染过程中宿主限制性因子IFITM3对TRIF/IRF3通路的影响。方法:(1)利用STRING数据库分析TRIF、IRF3、IFNB1、IFITM3和Foxp3基因之间存在的潜在关联。(2)体内小鼠实验,共分为两组。(1)第一组小鼠实验共36只C57BL/6J雌性小鼠,随机分为实验组(8d、30d、60d、90d、180d)和对照组,其中实验组小鼠经腹腔感染泡球蚴。通过大体观察小鼠腹部病灶和肝脏表面病灶的大小。病理组织切片观察小鼠肝脏病理变化,免疫组织化学检测小鼠肝脏IFITM3和Foxp3的变化。Western blotting和实时荧光定量PCR检测TRIF/IRF3通路相关分子及IFITM3的蛋白及基因的表达。激光共聚焦实验检测小鼠肝脏IFITM3和Foxp3的共定位情况。(2)第二组小鼠实验,共24只C57BL/6J雌性小鼠并随机分为4组(每组6只),即腹腔注射PBS组、腹腔注射TCP组,泡球蚴感染后腹腔注射PBS组、泡球蚴感染后腹腔注射TCP组。腹腔注射PBS组和泡球蚴感染后腹腔注射PBS组小鼠经腹腔注射PBS(100μL/kg)每日一次;腹腔注射TCP组和泡球蚴感染后腹腔注射TCP组小鼠经腹腔注射TCP(5mg/kg)每日一次。PBS和TCP干预30d,同时处理4组小鼠。动态监测小鼠体重变化,通过HE染色观察每组小鼠肝脏情况。评估TCP对小鼠肝脏TRIF/IRF3通路和IFITM3蛋白及基因表达的影响。(3)体外细胞实验。分别通过不同浓度、不同时间、LSD1抑制剂(TCP)进行(1)剂量依赖实验:采用阴性对照组、囊液浓度(1:10、1:100、1:1000)共四组刺激L02肝细胞,Western blotting和实时荧光定量PCR检测TRIF/IRF3通路及IFITM3相关因子蛋白的表达量。(2)时间依赖实验:采用囊液浓度1:1000干预L02肝细胞0h、24h、48h和72h后检测TRIF/IRF3通路及IFITM3相关因子蛋白的表达量。(3)TCP干预实验(共五组),即阴性对照组、IFN-γ组、TCP+囊液组、囊液(1:1000)组和TCP组刺激L02肝细胞24h,检测TRIF/IRF3通路及IFITM3相关因子蛋白的表达量。根据相关结果,利用Spearman分析TRIF/IRF3通路蛋白的相关性。结果:(1)通过生物信息分析得到TRIF、IRF3、IFNB1、IFITM3和Foxp3五个基因的互作图。(2)小鼠实验中,(1)HE染色显示泡球蚴感染小鼠30d肝脏病灶周围大量炎性细胞浸润,Masson染色显示泡球蚴感染小鼠30d肝脏胶原纤维表达。免疫组织化学染色结果显示,随着泡球蚴感染时间延长,IFITM3表达量先增加后下降,而Foxp3的表达逐渐增加。随着感染时间延长,TRIF/IRF3及IFITM3蛋白及基因表达量先增加后下降,感染90d表达量开始下降,而Foxp3蛋白及基因表达量逐渐增加,在感染晚期180d表达量最高;在泡球蚴感染60d时,发现小鼠肝脏IFITM3和Foxp3发生共定位。(2)检测LSD1抑制剂(TCP)对泡球蚴感染小鼠肝脏TRIF/IRF3通路及IFITM3的影响,Western blotting和real-time PCR结果显示,TCP能够显著降低小鼠肝脏TRIF/IRF3通路及IFITM3相关因子蛋白的表达水平,同时小鼠肝脏Foxp3蛋白表达增加。(3)体外细胞实验显示(1)随着囊液浓度降低,TRIF/IRF3通路及IFITM3表达增加。TRIF蛋白表达量是(0.45±0.09)、(0.54±0.05)、(1.08±0.24)、(1.75±0.31);IFITM3蛋白表达量是(1.02±0.41)、(1.00±0.16)、(1.24±0.12)、(1.84±0.20)。(2)1:1000的囊液干预L02细胞后,随着时间延长,TRIF、TBK1、IRF3、IFNB1、IFITM3和LSD1的表达逐渐下降,而Foxp3和IL-4的表达逐渐增高。(3)LSD1抑制剂(TCP)+囊液处理组的L02细胞TRIF、TBK1、IRF3、IFNB1、IFITM3和LSD1的表达水平下降,而Foxp3和IL-4表达增加。(4)相关性分析显示,随着囊液浓度降低,IFITM3与TRIF、IRF3、IFNB1之间存在正相关性。囊液浓度(1:1000)干预时间增加,IFITM3与TRIF、IRF3、IFNB1之间的正相关性依然显著,而IFITM3蛋白与Foxp3蛋白具有负相关性。结论:晚期泡球蚴感染时,小鼠肝脏的TRIF/IRF3通路相关分子及IFITM3表达下调,干扰天然免疫的抗病原体功能,进而抑制宿主发挥抗病原体的作用;当应用LSD1抑制剂(TCP)后,TRIF/IRF3通

关键词：泡球蚴宿主限制性因子干扰素诱导的跨膜蛋白3 TRIF/IRF3通路

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宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究

宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究

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作者：刘悦吉林大学

学位级别：博士

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是严重的公共卫生健康问题,是导致肝硬化及原发性肝细胞癌的主要原因。世界范围内有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒,我国形势尤其严峻,有超过8000万成年人为HBV携带者,控制HBV感染的要求十分迫切... 详细信息

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是严重的公共卫生健康问题,是导致肝硬化及原发性肝细胞癌的主要原因。世界范围内有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒,我国形势尤其严峻,有超过8000万成年人为HBV携带者,控制HBV感染的要求十分迫切。目前抗HBV的药物主要为干扰素类药物及核苷酸类似物,虽能取得一定疗效,但由于其治愈率仍旧较低,以及各种副作用(如骨髓抑制、神经精神症状加重等)和耐药性的产生,使得大多数患者需要接受无限期的治疗。因此,进一步研究HBV感染与人体相互作用机制,寻找新的治疗靶点,具有重要的临床意义和价值。乙型肝炎病毒是一种具有包膜的嗜肝性病毒,是最小的通过逆转录进行复制的部分双链环状DNA病毒,基因组长度约3.2kb。在HBV病毒感染细胞过程中,其疏松的环状DNA(rc DNA)进入细胞核修复成高度稳定的共价闭合环状DNA(ccc DNA),之后以ccc DNA为模板转录出各种HBV病毒的RNA,包括前基因组RNA(pg RNA)。HBV的包膜蛋白包括大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)、小蛋白(SHBs)三种形式,在HBV的生活周期中起到重要的作用。病毒与宿主间复杂的相互作用关系,提示我们深入地研究病毒与宿主之间相互作用机制,通过机制揭示,可以为开发针对HBV的创新型药物提供更多的新的药物作用靶点。在对人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的研究中,人们发现了人体内一系列能够拮抗HIV的宿主蛋白,称为宿主限制性因子。作为科学家们竞相研究的前沿热点科学问题,宿主限制性因子主要包括APOBEC3家族,TRIM5α,BST-2,SAMHD1,Mx2,GBP5等。宿主限制性因子能够干扰包括病毒脱衣壳、核酸进入、基因组复制、病毒粒子释放及融合等在内的病毒复制各个阶段,并且其抗病毒能力往往具有广谱性。2015年,科学家发现了一种新的限制性因子—丝氨酸整合因子5(serine incorporator 5,SERINC5)对HIV病毒感染的抑制作用。证明了HIV辅助蛋白Nef缺失的情况下,分布在细胞膜上的SERINC5会在HIV子代病毒释放过程中整合入病毒粒子包膜,使其在进入下一个靶细胞时受阻,从而降低HIV的感染性,抑制HIV病毒的复制。而Nef则通过将SERINC5限制在核周的囊泡阻止其包装入子代病毒包膜,帮助病毒逃避SERINC5的限制。鉴于宿主限制性因子抗病毒的广谱性,结合SERINC5是通过影响HIV包膜蛋白的组成结构从而降低HIV感染性的机制,那么SERINC5对其它具有包膜的病毒粒子是否具有类似影响?本研究将SERINC5应用于同样具有包膜的HBV,探讨SERINC5对HBV复制的调控作用,得出了以下实验结果及结论:***5能够抑制HBV的分泌;本研究在Hep G2细胞中转染HBV感染性克隆质粒,同时呈剂量梯度分别共转SERINC5、SERINC3和SERINC1质粒,用ELISA方法检测上清中HBV表面抗原(HBs Ag)的含量。与对照组相比,SERINC5组细胞上清中HBV HBs Ag明显减少,而SERINC3组及SERINC1组无此现象。同时,本研究用免疫共沉淀的方法提纯上清中HBV完整病毒粒子,并使用实时定量PCR检测病毒粒子DNA水平,发现SERINC5组上清中HBV完整病毒粒子明显减少。那么,SERINC5是在HBV复制的哪一个阶段发挥了抑制作用呢?本研究使用Southern blot及Northern blot技术分别检测发现细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA的含量均未受到影响。这说明,SERINC5抑制了HBV完整病毒粒子及表面抗原的分泌。本研究同时使用RNA干扰技术,在Hep G2细胞中下调SERINC5的表达,发现上清中HBs Ag及HBV完整病毒粒子的含量均有所增加,而细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA含量均无变化。在Hep G2.2.15细胞中过表达SERINC5,得到与Hep G2细胞中相同的结果。本研究同时建立了感染体系,在Hep G2-NTCP细胞中过表达SERINC5,并用Hep AD38产生的HBV病毒进行感染,同样得到SERINC5抑制HBs Ag及HBV完整病毒粒子分泌的结果。以上结果说明,SERINC5能够抑制HBV的分泌。***5影响HBV包膜蛋白包括大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)、小蛋白(SHBs)的糖基化修饰;为了探究SERINC5抑制HBV分泌的机制,本研究考察了SERINC5对HBV各种功能蛋白的影响。发现SERINC5能够影响HBV包膜蛋白包括LHBs、MHBs、SHBs的糖基化修饰,使其糖基化形式减少,而非糖基化形式增加。***5通过影响HBV包膜

关键词：宿主限制性因子 SERINC5 乙型肝炎病毒病毒分泌

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宿主限制性因子MOV10对HBV复制的作用机制研究

宿主限制性因子MOV10对HBV复制的作用机制研究

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作者：周星重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:乙型肝炎病毒是以逆转录方式进行复制的嗜肝DNA病毒。MOV10是宿主细胞重要的抗病毒因子,MOV10不仅抑制多种病毒复制,包括人类免疫缺陷病毒1型,丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和水疱性口炎病毒,还限制了反转录转座子LINE-1,Alu,SVA的... 详细信息

目的:乙型肝炎病毒是以逆转录方式进行复制的嗜肝DNA病毒。MOV10是宿主细胞重要的抗病毒因子,MOV10不仅抑制多种病毒复制,包括人类免疫缺陷病毒1型,丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和水疱性口炎病毒,还限制了反转录转座子LINE-1,Alu,SVA的活性。然而MOV10是否可以抑制HBV复制及相关机制尚未报道。因此,本文重点研究宿主限制性因子MOV10对HBV复制的调控作用,初步阐明MOV10抑制HBV的机制。方法:(1)MOV10抑制HBV复制的表型研究:我们在慢乙肝患者的临床样本和HBV复制的细胞中检测了MOV10表达与HBV复制的关系:比较健康人和慢性乙肝感染患者外周血单个核细胞中MOV10的表达差异,在HBV稳定表达细胞HepAD38检测MOV10蛋白表达与病毒复制的关系,探讨MOV10和HBV复制的相关性;Huh7和HepG2-NTCP细胞通过siRNA干扰内源性MOV10,提取胞质中的病毒RNA和病毒核心颗粒的DNA,通过Southern blot,q-PCR、Northern blot检测病毒复制水平的变化,通过native gel检测病毒核心颗粒的变化;在Huh7和HepG2-NTCP中过表达MOV10,提取病毒颗粒DNA和RNA,通过Southern blot、Northern blot检测病毒复制水平的变化。(2)MOV10抑制HBV复制的机制研究:检测MOV10是否通过HBV启动子发挥抑制作用;IFN-α和IFN-γ刺激Huh7细胞,提取细胞RNA和蛋白检测MOV10的表达水平,探讨MOV10是否作为干扰素诱导基因发挥抗病毒作用;在Huh7中通过siRNA干扰干扰素上游基因IRF3和干扰素下游基因STAT1,共转染HBV和MOV10,荧光定量PCR分析病毒DNA水平的变化,探讨MOV10是否通过调控干扰素应答通路发挥抗病毒作用;构建MOV10解旋酶的保守结构域Ⅱ的酶活突变体(D645A、E646Q和G648A),检测酶活突变后对MOV10抗病毒作用的影响;探讨MOV10是否通过与病毒蛋白或病毒RNAs结合发挥抗病毒作用:HEK293细胞中共转染HBV复制质粒和MOV10表达质粒,免疫共沉淀试验检测MOV10是否和病毒核心蛋白HBc相互作用;在HEK293细胞中共转染HBV复制质粒和MOV10表达质粒,通过RNA-IP研究MOV10与HBV RNA的结合,探讨MOV10是否通过与病毒RNAs发挥抗病毒作用。结果:慢性乙肝感染患者外周血单个核细胞中MOV10表达水平低于健康人外周血MOV10水平;在HBV稳定复制的细胞系HepAD38中,去除四环素启动病毒复制后,MOV10蛋白水平下降,说明MOV10与HBV复制相关;Huh7中干扰内源性MOV10后,HBV DNA复制水平升高1.5倍,而病毒RNA和病毒Capsid无明显变化,在基于HepG2-NTCP的HBV感染模型中,干扰后病毒DNA水平增加1.5倍;Huh7细胞中过表达外源性的MOV10,显著抑制了HBV DNA的复制,而病毒RNA无明显变化,表明MOV10抑制病毒复制主要发生在DNA复制环节,同样在HepG2-NTCP的HBV感染模型中,过表达外源性的MOV10显著抑制病毒DNA的复制;在机制解析方面:MOV10不通过HBV启动子发挥作用;在肝癌细胞中,MOV10不受IFN-α和IFN-γ诱导发挥抗病毒作用;同样在肝癌细胞中,干扰干扰素通路上游基因IRF3和干扰素下游基因STAT1,MOV10的抗病毒作用没有显著消失,表明MOV10不通过干扰素通路发挥抗病毒作用;MOV10结构域Ⅱ突变体同样显著抑制HBV的复制,表明MOV10不依赖其解旋酶活性抑制HBV复制;通过RNA-IP实验,初步表明MOV10可以与HBV RNAs结合,进一步通过多重RT-PCR证明MOV10与3.5kb的pgRNA结合,这种结合可能是MOV10发挥抗病毒作用的关键。结论:在肝癌细胞中,宿主限制性因子MOV10的表达与HBV复制相关,其抑制HBV复制不通过作用于病毒的启动子,不依赖于其解旋酶活性,也不是作为干扰素诱导基因或促进干扰素通路发挥抗病毒作用来抑制病毒复制,其机制可能与HBV RNA结合有关。

关键词：宿主限制性因子 MOV10 解旋酶乙型肝炎病毒抑制

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RNA-Seq技术筛选抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的宿主限制性因子及其抗病毒作用验证

RNA-Seq技术筛选抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的宿主限制性因子及其...

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作者：马改妮中国农业科学院

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种急性、高度传染的病毒性传染病,对世界养猪业造成巨大的经济损失。2006年,我国出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV),具有很强的感染力和致病性,给我国养猪业带来更大的危害。猪肺泡巨噬细胞(Porcine pulmonary alveolar macrophages,PAMs)是HP-PRRSV的主要靶细胞。I型干扰素(Interferon,IFN)具有抑制PRRSV复制的能力,而IFN发挥抗病毒作用主要是依靠干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs)编码的宿主限制性因子。寻找抑制HP-PRRSV复制的宿主限制性因子已经成为近年来研究的热点,但IFN刺激产生的限制性因子数量众多,筛选工作量巨大。RNA-Seq技术是新一代测序技术,具有高通量、效率高、灵敏度好的优势。本试验中,利用RNA-Seq技术对IFN处理的PAMs中抗HPPRRSV限制性因子进行高通量筛选。将抗PRRSV的限制性因子ISG15作为指示因子,根据感染PRRSV的PAMs中ISG15的表达变化,选择接毒后12小时作为收样时间。本实验设置了4个不同处理组,分别为IFN、IFN+PRRSV、PRRSV和C(空白对照组)组。用猪IFN-α处理PAMs诱导细胞产生抗病毒状态,再感染HP-PRRSV,进而用RNA-Seq技术检测IFN预处理的PAMs对HP-PRRSV的应答变化。IFN-α处理细胞共检测到346个上调的差异性表达基因(DEGs),其中有93个DEGs在HPPRRSV感染细胞中表达水平显著下降。富集分析这93个下降表达的DEGs,主要分布在免疫应答相关的通路,如“RIG-I样受体信号通路”、“病毒应答”、“刺激应答”。在表达差异的16个抗病毒DGEs中,包括IRG6(RSAD2)、IFI44、ISG20、PKR、LOC100738990(TRIM5)、BST2、OAS1、IFIT1(ISG56)、IRF7、IFIT2、ISG15、LOC100627004(IFITM1)、ISG12(A)(IFI27)、IFITM3、IFIT5,其中15个的表达可以被HP-PRRSV抑制。为了验证以上16个抗病毒DGEs是否具有抑制HP-PRRSV复制的作用,采用siRNA干扰技术下调其表达,然后感染HP-PRRSV,分析病毒复制水平。结果发现PKR、OAS1、IFIT1(ISG56)、ISG15、IFI44、ISG20、BST2、IRF7、IFIT2、LOC100627004(IFITM1)、IFITM3、IFIT5和GBP1均能显著抑制PRRSV的复制。谷氧还蛋白1(glutaredoxin 1,GLRX1)是一种具有抗氧化、信号转导、抗凋亡等多功能的蛋白。RNA-Seq检测结果显示IFN可以显著上调GLRX1的表达,但HP-PRRSV感染能显著抑制其表达。siRNA干扰下调PAMs中GLRX1的表达,HP-PRRSV复制显著增加,说明GLRX1能够抑制HP-PRRSV的增殖。比较感染PRRSV猪和健康猪的各组织中的GLRX1表达差异,发现感染PRRSV猪腹股沟淋巴结、心脏、肺门淋巴结中的GLRX1表达量显著下降,而小肠、肺脏和肌肉中的GLRX1表达量显著上升。上述结果表明PRRSV能够影响猪不同组织的GLRX1的表达。本研究采用RNA-Seq技术筛选了抑制HP-PRRSV复制的宿主限制性因子,并验证了其抗HP-PRRSV复制的作用,为研究HP-PRRSV免疫应答和免疫逃逸提供了基础数据。

关键词：猪呼吸与繁殖综合征 RNA-Seq 宿主限制性因子抗病毒作用

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基肯孔雅病毒宿主因子和限制性因子的研究

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病毒学报 2018年第3期34卷 430-435页

作者：殷瀚张磊亮中国医学科学院北京协和医学院病原生物研究所卫生部病原系统生物学重点实验室

基肯孔雅病毒（The chikungunya virus,CHIKV）是近年来重新暴发的甲病毒,主要由埃及伊蚊叮咬传播,可引起基肯孔雅热。由于对该病毒的研究尚不完全,目前缺少针对性的预防和治疗方法。CHIKV具有全球暴发的可能性,是公众健康的潜在威胁。... 详细信息

基肯孔雅病毒（The chikungunya virus,CHIKV）是近年来重新暴发的甲病毒,主要由埃及伊蚊叮咬传播,可引起基肯孔雅热。由于对该病毒的研究尚不完全,目前缺少针对性的预防和治疗方法。CHIKV具有全球暴发的可能性,是公众健康的潜在威胁。近期的研究已经发现许多CHIKV的宿主因子和限制性因子,本文通过总结这些因子,为今后进一步研究CHIKV与宿主细胞的相互作用以及探索其致病机制提供思路。

关键词：基肯孔雅病毒(CHIKV) 宿主因子宿主限制性因子

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禽TRIM14调控坦布苏病毒复制的分子机制

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中国兽医科学 2025年

作者：罗锐《中国兽医科学》编辑部

坦布苏病毒（TMUV）对我国水禽养殖业造成了巨大的经济损失。深入挖掘关键宿主抗病毒因子并解析其作用机制，将为TMUV的防控提供新的思路。2025年5月28日，华中农业大学罗锐团队在国际学术期刊PLoS Pathogens在线发表了题为“TRIM14 res... 详细信息

坦布苏病毒（TMUV）对我国水禽养殖业造成了巨大的经济损失。深入挖掘关键宿主抗病毒因子并解析其作用机制，将为TMUV的防控提供新的思路。2025年5月28日，华中农业大学罗锐团队在国际学术期刊PLoS Pathogens在线发表了题为“TRIM14 restricts Tembusu virus infection through degrading viral NS1 protein and activating typeⅠinterferon signaling”的研究论文，首次系统揭示了禽TRIM14蛋白通过介导病毒NS1蛋白降解和激活Ⅰ型干扰素信号通路两种机制，协同调控TMUV复制，为深入理解禽类抗病毒的分子机制提供了新的视角。

关键词：坦布苏病毒 TRIM14 NS1蛋白 Ⅰ型干扰素宿主限制性因子

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Ⅰ系PRRSV致仔猪小肠病变的特征分析

Ⅰ系PRRSV致仔猪小肠病变的特征分析

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作者：赵勇新西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的传染病,临床上常以感染猪繁殖障碍和呼吸道症状为主要特征。前期研究发现XM-2020(1.8亚系,NADC30-Like PRRSV)能引起仔猪小肠出血性损伤。为了探究PRRSV感染导致小肠出血性损伤的机制,本文比较了Ⅰ系PRRSV XM-2020和YC-2020(1.5亚系,NADC34-Like PRRSV毒株)毒株与高致病性PRRSV JXA1(8系,HP-PRRSV毒株)毒株对仔猪小肠致病性的差异,进一步通过对仔猪小肠样本的转录组测序结果分析,揭示小肠损伤相关通路的转录特性,并筛选具有抑制PRRSV增殖功能的宿主限制性因子,利用CRISPR/Cas9系统构建在三基因毒力缺失PRV载体中,评估重组PRV在抑制PRRSV增殖的作用。获得结果如下: 1.Ⅰ系PRRSV感染导致仔猪小肠损伤与JXA1相比较,Ⅰ系PRRSV XM-2020和YC-2020的病毒血症持续时间更久,抗体产生更慢且免疫器官的病毒含量更高,造成胸腺萎缩程度更明显;而JXA1表现出更强的肺组织嗜性,肺脏组织载毒量更高,间质性肺炎更明显。Ⅰ系PRRSV对小肠致病性更明显,在小肠多个节段都检测到Ⅰ系PRRSV的存在,并伴有出血性损伤;JXA1感染组只能在小肠末端-回肠检测到阳性信号,未发现肉眼可见的病理损伤。 2.Ⅰ系PRRSV感染导致仔猪小肠补体与凝血级联系统负向富集 RNA-Seq结果显示:PRRSV感染能干扰仔猪小肠的代谢分解和酶活性,促进氧化和炎症反应,导致小肠功能障碍。其中,JXA1不仅引起炎症相关通路的正向富集和抑制氧化反应及细胞凋亡相关通路的负向富集,而且在小肠诱导了更强的免疫反应。与JXA1感染组相比,Ⅰ系PRRSV感染诱导的免疫反应相关术语和通路呈负向富集,且补体激活和补体与凝血级联系统只在Ⅰ系PRRSV感染组呈负向富集,增加了小肠的出血风险。 3.宿主限制性因子IFIT2和GLRX1对PRRSV增殖的影响利用PRRSV感染仔猪小肠作为筛选宿主限制性因子的平台,筛选目的基因,发现GPX2,GLRX1,IFIT2,HEBP1和GSTA1均表现出抑制PRRSV增殖的效果,其中GLRX1和IFIT2抑制效果最为明显。将GLRX1和IFIT2分别构建在三基因毒力缺失PRV载体上,成功拯救并纯化出了重组病毒PRV SX-10-2015-GLRX1-m Cherry-△g I/g E-△TK和PRV SX-10-2015-IFIT2-e GFP-△TK-△g I/g E。PAMs细胞接毒试验表明,两个重组PRV毒株都表现出了抑制PRRSV增殖的能力。综上所述,本研究首次发现Ⅰ系PRRSV感染造成小肠出血性损伤与免疫抑制和补体与凝血级联系统的关联,并利用重组PRV表达宿主限制性因子GLRX1和IFIT2在细胞上有效抑制了PRRSV的增殖。以上结果深化了对I系PRRSV致病机制的研究,对我国PRRSV的防控具有积极作用。

关键词： Ⅰ系PRRSV 致病性比较转录组宿主限制性因子

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传染性法氏囊病病毒感染时宿主蛋白FKBP12的应答检测及其抗病毒作用

传染性法氏囊病病毒感染时宿主蛋白FKBP12的应答检测及其抗病毒作...

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作者：吴甜甜中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的禽免疫抑制病。IBDV靶向攻击鸡的中枢免疫器官法氏囊,破坏核心免疫细胞B淋巴细胞,不仅直接造成鸡只死亡,耐过鸡... 详细信息

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的禽免疫抑制病。IBDV靶向攻击鸡的中枢免疫器官法氏囊,破坏核心免疫细胞B淋巴细胞,不仅直接造成鸡只死亡,耐过鸡还呈现严重免疫抑制,降低机体免疫力,引起严重的并发和继发感染,严重危害养禽业的健康发展。IBDV是一种具有双节段双链RNA基因组(A节段和B节段)的二十面体病毒。B节段编码具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的VP1蛋白。A节段包含两个部分重叠的开放阅读框(Open reading frame,ORF),小ORF编码VP5,大ORF编码一个多聚蛋白(Polyprotein,PP)前体pVP2-VP4-VP3,该蛋白可被VP4反式酶解而释放出pVP2和VP3,pVP2进一步成熟为VP2。IBDV感染过程中,宿主天然免疫发挥重要的调控作用。FK506结合蛋白12(FK506 binding protein 12,FKBP12)是FKBPs家族的重要成员,具有肽基脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-proly cis-trans isomerases,PPIase)活性等多种生理功能,也参与几种人源病毒的感染调控。本实验室前期的iTRAQ检测数据提示,宿主FKBP12在IBDV感染时有明显调动。本研究建立了宿主FKBP12荧光定量RT-PCR检测方法,利用不同毒力的多种IBDV参考毒株,以SPF鸡、DT40细胞为感染模型,从体内、外两个层面研究IBDV感染时宿主FKBP12的应答性变化。体、内外检测结果均表明,FKBP12在IBDV强毒感染时下调,弱毒感染时上调。这提示,FKBP12在IBDV感染过程中可能发挥重要调控作用。为证实这一推测,本研究分别运用过表达和siRNA干扰技术上调和下调FKBP12表达,从基因转录水平、蛋白表达水平以及病毒滴度三个层面评估FKBP12对IBDV复制的影响。结果表明,FKBP12上调表达抑制IBDV复制,下调表达促进病毒复制。这证明,FKBP12是IBDV感染的一个宿主限制性因子。为探索宿主FKBP12作为IBDV宿主限制性因子的作用分子细节,本研究进一步通过GST pull down和激光共聚焦试验证实了鸡源FKBP12与IBDV VP4蛋白存在相互作用。鉴于这两个互作蛋白分别具有PPIase活性和丝氨酸蛋白酶活性,我们推测,FKBP12可能会通过影响VP4酶活性进而抑制IBDV的复制。基于IBDV多聚蛋白(PP)被VP4反式酶解的研究模型,研究发现,FKBP12过表达会抑制IBDV VP4蛋白对病毒PP蛋白的反式酶解,具体体现在源自PP酶解的VP2和VP3的下调。这说明,宿主FKBP12对IBDV的VP4反式酶解活性具有抑制作用。本研究从基因转录、蛋白表达、病毒滴度三个层面检测了宿主蛋白FKBP12对IBDV复制的影响,鉴定了FKBP12是IBDV的一个新的宿主限制性因子。建立了宿主FKBP12荧光定量RT-PCR检测方法,检测了FKBP12在IBDV感染时的应答变化:IBDV弱毒感染时,宿主限制性因子FKBP12被(宿主)上调;IBDV强毒感染时,宿主限制性因子FKBP12被(病毒)下调。证明了宿主FKBP12与IBDV VP4蛋白存在相互作用,初步揭示了FKBP12通过抑制VP4反式酶解病毒多聚蛋白的蛋白酶活性进而发挥宿主限制因子的作用。本研究对于探索IBD防控新制剂和新策略具有重要意义。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) FK506结合蛋白12(FKBP12) 宿主限制性因子检测防控

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