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分子植物育种 2018年第23期16卷 7689-7694页

作者：赵美皮磊郑文博刘艳潇周而勋舒灿伟华南农业大学农学院华南农业大学群体微生物研究中心广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室

寄主诱导基因沉默(host induced gene silencing,HIGS)技术是基于RNAi而发展起来的新技术,它既可以从反向遗传学的方向鉴定植物病原真菌的基因功能,又可以通过在寄主植物中表达沉默病原物特定基因的HIGS载体,以达到控制病原菌扩展,提高... 详细信息

寄主诱导基因沉默(host induced gene silencing,HIGS)技术是基于RNAi而发展起来的新技术,它既可以从反向遗传学的方向鉴定植物病原真菌的基因功能,又可以通过在寄主植物中表达沉默病原物特定基因的HIGS载体,以达到控制病原菌扩展,提高作物抗病性的目的。因此HIGS在研究植物病原真菌的致病机理和作物的抗病育种中极具应用前景。HIGS技术从报道以来在植物保护领域得到了广泛的运用,其适用范围广,可以在多种病原真菌中进行应用,特别对于难培养和难以进行遗传转化的真菌。并可以在植物抗病育种中发挥更大空间,为病害的防治提供可靠的策略。本综述总结概括了HIGS技术的原理和它在植物病原丝状真菌研究的最新进展,为该技术在更多植物病原真菌的使用提供参考依据。

关键词：寄主诱导基因沉默丝状真菌致病基因抗病育种

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利用寄主诱导沉默核盘菌ABC转运蛋白(ABCT)基因SsBMR1增强植物的菌核病抗性

利用寄主诱导沉默核盘菌ABC转运蛋白(ABCT)基因SsBMR1增强植物的...

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中国作物学会油料作物专业委员会第八次会员代表大会暨学术年会

作者：柴亚茹丁一娟申浩晶杨文静远俊虎毛毅钱伟西南大学农学与生物科技学院

由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病严重影响了油菜产量和品质。大量研究表明small RNA参与了植物与病原菌的互作,寄主诱导的基因沉默(HIGS)是改良植物抗性的重要方法。真菌ABC转运蛋白(ABCT)具有转运次生代谢产物和参与... 详细信息

由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病严重影响了油菜产量和品质。大量研究表明small RNA参与了植物与病原菌的互作,寄主诱导的基因沉默(HIGS)是改良植物抗性的重要方法。真菌ABC转运蛋白(ABCT)具有转运次生代谢产物和参与胁迫反应等方面功能。我们克隆了核盘菌的ABCT基因SsBMR1,发现其为PDR型的全分子转运蛋白,并且与一条核盘菌侵染垫形成相关的EST序列高度同源。在核盘菌中沉默该基因后,与野生型菌株1980相比,沉默转化子的生长速度变慢、致病力减弱,形成的菌核数量减少,表明SsBMR1在核盘菌的致病过程中起着重要的作用。同时我们根据SsBMR1的基因序列构建了寄主诱导的基因沉默(HIGS)载体,并转化拟南芥,核盘菌接种发现HIGS转基因拟南芥的菌斑面积与野生型材料相比显著减小,核盘菌SsBMR1基因的表达也被显著抑制。我们的结果表明通过寄主诱导沉默核盘菌致病相关基因可以有效提高寄主的菌核病抗性,也为进一步利用HIGS改良油菜的菌核病抗性,拓宽油菜抗病资源提供了新思路。

关键词：核盘菌寄主诱导基因沉默抗病

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核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）Ssebp基因功能分析

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）Ssebp基因功能分析

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作者：杨文静西南大学

学位级别：硕士

核盘菌是一种植物病原真菌,在世界范围内均能引起多种重要农作物,如油菜等油料作物的产量及品质下降,造成严重的经济损失。由于缺少油菜的抗病种质资源,使得针对油菜菌核病抗性基因的发掘和鉴定研究进展缓慢,因此,控制核盘菌的侵染循环... 详细信息

核盘菌是一种植物病原真菌,在世界范围内均能引起多种重要农作物,如油菜等油料作物的产量及品质下降,造成严重的经济损失。由于缺少油菜的抗病种质资源,使得针对油菜菌核病抗性基因的发掘和鉴定研究进展缓慢,因此,控制核盘菌的侵染循环为培育有效的抗病油菜品种提供了新的思路。本研究前期通过转录组分析发现与编码IgE-binding同源蛋白的核盘菌基因SS1G＿08110（Ssebp）在侵染甘蓝后高度表达,推测该基因可能与核盘菌致病过程相关,因此本研究以该基因作为候选基因进行功能分析,同时探究其在抗病育种中的应用潜力。主要研究结果如下:（1）生物信息学分析:Ssebp基因组序列全长为619 bp,CDS序列长为567bp,共编码189个氨基酸,有信号肽结构,无跨膜结构域,推测该基因编码的蛋白可能是一个分泌蛋白。（2）基因表达特性分析:通过qRT-PCR分析Ssebp基因在菌丝生长的不同时间点及不同侵染条件下的表达情况,结果观察到在PDA上生长2 d时,即在菌丝生长期,基因表达量最高;在接种油菜12 h后,基因表达量显著升高。实验结果表明Ssebp基因可能与菌丝生长及侵染有关。（3）转化子筛选及表型分析:通过构建Ssebp基因沉默表达及超表达载体,利用PEG介导的原生质体转化野生型核盘菌1980,在含潮霉素的PDA平板上进行筛选,成功筛选出6个阳性沉默转化子和2个阳性超表达转化子。qRT-PCR分析发现6个Ssebp基因沉默转化子的表达量相对野生型菌株均有所下降,两个超表达转化子的表达量相对野生型菌株上升。表型分析发现,沉默转化子菌丝生长速度显著减慢,形成侵染垫以及致病能力显著减弱。超表达转化子菌丝生长相比野生型显著加快,致病能力增强。（4）转基因拟南芥表型分析:构建Ssebp基因的HIGS载体,同时构建Ssebp基因的植物超表达载体,转化拟南芥Col-0,利用红光表达载体盒进行纯合株系的筛选。经过世代筛选后,接种核盘菌并分析转基因株系的菌核病抗性。结果发现T3代纯合转基因株系中,HIGS转基因叶片病斑大小显著小于野生型拟南芥,Ssebp超表达转基因拟南芥的菌斑显著大于野生型拟南芥。该结果说明在拟南芥中表达靶向核盘菌Ssebp基因的ds RNA,能显著增强转基因植株的抗病性,而在植物中表达Ssebp能显著降低植物的菌核病抗性。（5）转录组分析:通过对不同菌株接种不同植物后的转录组数据分析,发现拟南芥的差异基因在对毒素的代谢过程、对伤害的反应及对茉莉酸反应的信号途径方面富集显著。推测核盘菌Ssebp基因可能通过影响植物PTI过程,参与核盘菌的致病过程。

关键词：核盘菌寄主诱导基因沉默超表达 Ssebp

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基因沉默方法在禾谷丝核菌基因功能研究中的应用

基因沉默方法在禾谷丝核菌基因功能研究中的应用

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作者：成永杰长江大学

学位级别：硕士

小麦作为我国四大主粮作物之一,在农业生产中的地位不可或缺。由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的小麦纹枯病(wheat sharp eyespots)是世界性土传小麦病害,严重时可造成小麦减产40%。目前生产中缺乏抗或耐受纹枯病的小麦品种,因... 详细信息

小麦作为我国四大主粮作物之一,在农业生产中的地位不可或缺。由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的小麦纹枯病(wheat sharp eyespots)是世界性土传小麦病害,严重时可造成小麦减产40%。目前生产中缺乏抗或耐受纹枯病的小麦品种,因此防治小麦纹枯病的主要策略是化学和生物防治。化学防治易造成环境的污染和病原菌的抗药性,生物防治对使用环境的要求较高,抗病品种的选育需较高的技术手段且耗时较长。因此有必要针对小麦纹枯病进行多样化的防治策略,充分了解病原菌禾谷丝核菌的致病机制是前提条件。然而,由于缺少稳定的遗传转化体系,禾谷丝核菌致病相关基因的功能研究受到严重限制。近年来,随着基因干扰(RNAi)或基因沉默技术在基因功能研究上的应用,开始有研究者采用基因沉默的方法来研究丝核菌致病相关基因的功能。本研究以常用杀菌剂戊唑醇和噻呋酰胺的靶标CYP51和Sdh为目标基因,从禾谷丝核菌基因组中搜索到CYP51的三个同源基因和Sdh的B、C、D亚基序列,以其为靶标基因,进行基因沉默的研究,研究结果如下:1、体外合成这些药剂靶标的ds RNA,使用喷雾诱导基因沉默的方法对大麦叶片和PDA平板上的禾谷丝核菌菌株R0301进行处理。结果表明药剂靶标ds RNA对R0301的生长和侵染能力具有抑制作用。在被侵染的大麦叶片上,外源ds RNA能够显著抑制病菌中对应基因的表达。其中防治效果最好的靶标基因是Rc CYP51-2和Rc CYP51-3。100 ng/μl浓度的Rc CYP51-3-ds RNA在大麦叶片上抑菌效果较为显著,且可以同时抑制3个Rc CYP51同源基因的表达。2、构建大麦条纹花叶病毒组分γ::target gene载体,体外转录大麦条纹花叶病毒各组分,将其混合涂抹到小麦叶片上。待病毒在小麦体内成功侵染转录后,在小麦叶片上转接R0301菌碟并保湿处理。结果表明在小麦体内转录的靶标基因ds RNA对R0301的侵染具有抑制作用。其中病斑最小的是Rc CYP51-1和Sdh C两个基因ds RNA处理后的叶片。3、上述研究证明了杀菌剂靶标基因的ds RNA可以有效抑制禾谷丝核菌的生长,具有防治小麦纹枯病的潜力。但是使用试剂盒合成的ds RNA成本较高,不适合大范围应用。因此本研究构建了L4440::Rc CYP51-2载体,转化至工程菌——大肠杆菌HT115中,经IPTG诱导,摇培扩繁生成大量的药剂靶标基因ds RNA。同时合成效率可达每毫升培养液中含有2.1μg ds RNA,与试剂盒合成效率相当,大大降低了成本。综上所述,本研究进一步明确了戊唑醇和噻呋酰胺两种杀菌剂在禾谷丝核菌中的靶标基因,探索了两种抑制禾谷丝核菌基因表达的方法,为使用喷雾诱导基因沉默(SIGS)方法以及寄主诱导基因沉默(HIGS)研究丝核菌基因功能奠定了基础。同时可以将本文研究的药剂靶标的ds RNA通过原核表达的方法低成本且高效地合成,为大田应用防治小麦纹枯病奠定基础。

关键词：小麦纹枯病禾谷丝核菌喷雾诱导基因沉默寄主诱导基因沉默甾醇14α-去甲基化酶琥珀酸脱氢酶

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寄主与病原物互作中小RNA转运机制及应用

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南京农业大学学报 2019年第1期42卷 1-5页

作者：乔露露赵弘巍牛冬冬南京农业大学植物保护学院江苏南京210095

灰霉病菌与拟南芥互作中会分泌小RNA进入植物细胞,通过与拟南芥Argonaute 1(AGO1)蛋白相结合,利用寄主的RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制沉默寄主的免疫相关基因,从而抑制拟南芥的免疫反应。相反,寄主也会将小RNA转移到病原菌中,从... 详细信息

灰霉病菌与拟南芥互作中会分泌小RNA进入植物细胞,通过与拟南芥Argonaute 1(AGO1)蛋白相结合,利用寄主的RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制沉默寄主的免疫相关基因,从而抑制拟南芥的免疫反应。相反,寄主也会将小RNA转移到病原菌中,从而抑制病原菌的致病力。最近研究发现拟南芥可以通过类似于外泌体的胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)将小RNA分泌到真菌细胞中。这些含有寄主小RNA的胞外囊泡在侵染部位积累并被真菌细胞吸收,并转运寄主小RNA诱导沉默真菌关键的致病因子,降低灰霉病菌的致病力。因此,在与病原菌的相互进化中,拟南芥通过外泌体介导的跨界RNA干扰抑制病原菌的侵染。本综述回顾了在多种植物-病原物互作体系中开展的小RNA穿梭转运研究,总结了可能的转运机制,讨论了以跨界RNA干扰技术为基础研发的新型环境友好型"RNA杀菌剂"的可靠性和局限性,对于读者了解新型作物病害防治技术具有重要意义。

关键词：灰霉病菌拟南芥免疫反应胞外囊泡小RNA 寄主诱导基因沉默

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水稻纹枯病菌与水稻互作基因的筛选和表达分析

水稻纹枯病菌与水稻互作基因的筛选和表达分析

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中国植物病理学会2017年学术年会

作者：赵美周而勋舒灿伟华南农业大学农学院植物病理学系

水稻纹枯病(rice sheath blight)是水稻的重要病害之一,对水稻的生产造成严重的影响。据最新的病害预测,2016年我国水稻纹枯病菌发病面积达2.6亿亩,发病面积远高于稻瘟病。其病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是重要的土传真菌,除... 详细信息

水稻纹枯病(rice sheath blight)是水稻的重要病害之一,对水稻的生产造成严重的影响。据最新的病害预测,2016年我国水稻纹枯病菌发病面积达2.6亿亩,发病面积远高于稻瘟病。其病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)是重要的土传真菌,除了为害水稻病害外,还可以侵染多达260种植物。由于缺乏可靠稳定的遗传转化系统,目前对该菌致病机理的研究还比较少。因此,本研究拟通过建立寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)技术体系研究水稻纹枯病菌关键致病基因的功能。首先利用水稻纹枯病菌基因组数据库RSIADB中的基因序列进行生物信息学分析,包括基因筛选、功能富集(GO和KOG)和表达趋势分析(short time-series expression miner,STEM),筛选出水稻纹枯病菌与水稻互作的候选基因;再利用水稻纹枯病菌强致病力菌株GD-118(其全基因组序列已经公布)活体接种水稻9311品种,分别在6个时间段(10h,18h,24h,32h,48h和72h)收集水稻叶片,利用荧光定量PCR技术验证、筛选基因的表达模式。最后选择在侵染初期高度上调表达的基因,构建HIGS表达载体,再通过根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)方法转化水稻,获得了转基因的水稻植株。根据RSIADB中的分泌蛋白、病原菌与寄主互作数据库(PHI)、碳水化合物活性酶数据库(CAZy)信息和转录组测序结果,利用Venn分析最后筛选出15个高FPKM值的候选基因,GO分析发现这些候选基因主要参与水解酶活性、碳氧裂解酶活性和转移酶活性等生物学功能,KOG分析发现这些基因与细胞壁生物合成、细胞骨架和碳水化合物转运和代谢有关,STEM分析把这15个基因归类为5个不同的表达趋势。荧光定量PCR结果发现5个候选基因(AG1IA0256,AG1IA9356,AG1IA6529,AG1IA6159和AG1LA3930)的表达量在侵染早期(10h和18h)高度上调,与转录组测序的结果基本一致,因此将其选为HIGS体系的候选基因。根据这5个候选基因的序列,利用pBDL03构建沉默载体后通过ATMT方法转化水稻,获得了稳定的转基因后代植株。本研究通过生物信息学和荧光定量PCR分析,获得了5个在侵染水稻早期上调表达的基因,建立了HIGS技术体系,并获得了转基因水稻植株,为进一步阐明这些基因的致病过程和机理奠定基础。

关键词：水稻纹枯病菌互作基因寄主诱导基因沉默分泌蛋白荧光定量PCR

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核盘菌GPI锚定蛋白SsGSSP1的功能分析

核盘菌GPI锚定蛋白SsGSSP1的功能分析

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作者：廖洪梅西南大学

学位级别：硕士

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）作为一类分布广泛的坏死性丝状病原真菌,其引起的菌核病严重危害油菜等作物的产量和品质。但目前,油菜中匮乏抗菌核病资源,抗病育种进程缓慢。GPI锚定蛋白在植物病原真菌感染中发挥一定重要作用,影... 详细信息

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）作为一类分布广泛的坏死性丝状病原真菌,其引起的菌核病严重危害油菜等作物的产量和品质。但目前,油菜中匮乏抗菌核病资源,抗病育种进程缓慢。GPI锚定蛋白在植物病原真菌感染中发挥一定重要作用,影响菌株的营养发育,细胞壁完整性以及致病性等。因此鉴定并研究核盘菌GPI锚定蛋白的功能不仅能进一步解析核盘菌的致病机理,也能为菌核病的防治提供理论基础。本研究前期通过转录组分析鉴定到7个编码GPI锚定蛋白的核盘菌差异表达基因,其中SS1G＿03230（SsGSSP1）在侵染寄主过程中表达量最高,推测其可能参与核盘菌的致病过程,因此本研究以SsGSSP1作为候选基因,对其进行功能分析,同时探究其在抗菌核病作物育种中的应用潜力。主要研究结果有:（1）生物信息学分析:SsGSSP1（Sclerotinia sclerotiorum GPI-anchored small secreted protein 1）基因全长为780 bp,编码区为639 bp,编码212个氨基酸,其中N端17个氨基酸为信号肽,无跨膜结构域,属于GPI锚定的富含丝/苏氨酸膜蛋白家族。预测其GPI的结合位点G-ω在C-31位,亚细胞定位预测发现SsGSSP1蛋白定位在胞外,包括细胞壁。因此,推测该基因编码的蛋白可能是一种GPI锚定分泌蛋白。（2）基因表达模式分析:通过q RT-PCR分析SsGSSP1基因在侵染植物过程中的表达情况,结果发现SsGSSP1基因在接种油菜叶片后的早期阶段其表达量不明显,但在48 h显著升高,是PDA培养基上生长时的9倍。因此,推测SsGSSP1基因可能参与核盘菌的致病过程。（3）蛋白分泌性验证:为验证SsGSSP1基因编码的蛋白具有分泌活性,利用一个蔗糖酶缺陷型的酵母分泌系统,构建了SsGSSP1蛋白的信号肽融合表达载体p SUC2-GSSP1SP,并转入YTK12酵母菌株,结果发现携带有表达p SUC2-GSSP1SP和阳性对照p SUC2-Avr1b的菌株在含有棉子糖的YPRAA培养基上均能生长,表明SsGSSP1基因编码的蛋白信号肽具有分泌活性。（4）敲除菌株筛选与表型分析:通过构建SsGSSP1基因敲除载体,利用PEG介导的原生质体转化野生型核盘菌1980,在含潮霉素的PDA培养基上进行筛选,成功筛选出5个阳性转化子。与野生型菌株相比,半定量PCR及q RT-PCR分析发现5个转化子中SsGSSP1几乎不表达。通过表型分析发现,与野生型菌株1980相比,SsGSSP1基因敲除菌株的菌丝生长速度与侵染垫形成均无明显差异,但对高渗、高盐和高氧及细胞壁抑制剂更加敏感。在接种离体野生型拟南芥、烟草、油菜以及活体拟南芥后,SsGSSP1基因敲除菌株的致病性均显著下降,表明SsGSSP1基因参与核盘菌的致病过程。（5）SsGSSP1转基因拟南芥抗病性分析:构建SsGSSP1基因的HIGS及植物超表达载体,转化野生型拟南芥,获得转基因拟南芥T3代稳定表达株系。菌核病抗性鉴定发现,相比野生型拟南芥,HIGS转基因株系HIGS-SsGSSP1的病斑面积显著减小,且SsGSSP1基因在HIGS-SsGSSP1转基因株系接种12 h后的表达量显著降低,表明在植物中表达靶向核盘菌SsGSSP1基因的ds RNA,能够显著提高转基因拟南芥的菌核病抗性。而SsGSSP1基因的超表达拟南芥植株病斑面积也显著减小,菌核病抗性增强,推测SsGSSP1基因可能影响寄主植物的免疫反应。（6）转录组分析:利用RNA-seq对野生型菌株1980（W）与SsGSSP1基因敲除菌株（KO）的转录组差异进行分析,结果发现,KO中下调的核盘菌差异表达基因显著富集在氧化应激、热休克反应及对化学剂的耐性,表明SsGSSP1基因可能参与核盘菌的胁迫压力响应。对W和KO接种野生型拟南芥后寄主的转录组差异进行分析,结果发现下调的拟南芥差异表达基因显著富集在木质素生物合成以及植物-病原菌互作途径,表明SsGSSP1基因可能通过影响植物免疫防御反应,参与寄主与核盘菌的互作。

关键词：核盘菌 GPI锚定蛋白致病机理寄主诱导基因沉默

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基于RNA干扰的外源双链RNA对立枯丝核菌的抗性研究

基于RNA干扰的外源双链RNA对立枯丝核菌的抗性研究

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中国植物病理学会2024年学术年会

作者：王妍郭依刘鹤安梦楠吴元华沈阳农业大学植物保护学院

烟草靶斑病是一种由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn,***)引起的真菌病害,在世界范围内造成巨大的损失。目前,烟草靶斑病的抗性品种和有效防治策略仍然非常有限。寄主诱导基因沉默(HIGS)技术被用于抑制植物病害并揭示参与真菌... 详细信息

烟草靶斑病是一种由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn,***)引起的真菌病害,在世界范围内造成巨大的损失。目前,烟草靶斑病的抗性品种和有效防治策略仍然非常有限。寄主诱导基因沉默(HIGS)技术被用于抑制植物病害并揭示参与真菌生长和致病机制的关键基因的功能。本研究以*** YC-9菌株的内切多聚半乳糖醛酸酶(endoPGs)和致病性MAP激酶为作用靶点,采用基于烟草脆裂病毒(TRV)的HIGS沉默寄主植物中的endoPGs和RPMK1,显著抑制了本生烟上的烟草靶斑病病斑面积。为安全有效地防控烟草靶斑病,采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,设计并合成dsRNA-endoPGs和dsRNA-RPMK1以及dsRNA-PGMK (部分endoPGs和RPMK1序列的融合片段)。采用含有Cy3萤光素标记dsRNA的PDA液体培养基培养***,在12 hpi、24 hpi、48 hpi和72 hpi时,***菌丝中均能观察到红色荧光信号,表明***能够有效吸收环境中的外源dsRNA。此外,采用喷施外源dsRNA的方法,发现dsRNA-endoPGs、dsRNA-RPMK1和dsRNA-PGMK有效抑制了*** YC-9菌丝生长,并减轻了***对烟草叶片的侵害,实时荧光定量PCR结果表明,dsRNA的应用显著降低了endoPGs和RPMK1的表达水平。本研究结果为利用RNAi技术防治由***引起的病害提供了理论依据和新的研究方向。

关键词： RNA干扰双链RNA 寄主诱导基因沉默立枯丝核菌烟草靶斑病

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