检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：李彦朝中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：博士

心血管疾病是威胁人类健康的第一大疾病,全球每年有730万人死于缺血性心脏病,列各病之首。冠状动脉旁路移植术、血液透析或外周血管闭塞治疗等使小口径TEBV(TEBVs<6mm)的临床需求日益增大。但目前还未见小口径TEBV应用于临床产品的报... 详细信息

心血管疾病是威胁人类健康的第一大疾病,全球每年有730万人死于缺血性心脏病,列各病之首。冠状动脉旁路移植术、血液透析或外周血管闭塞治疗等使小口径TEBV(TEBVs<6mm)的临床需求日益增大。但目前还未见小口径TEBV应用于临床产品的报道,究其原因主要是因为小口径TEBV移植后容易发生5方面问题:急性血栓形成、吻合口内膜增生、动脉瘤形成、感染、动脉粥样硬化进展和钙化;因此构建保持长期通畅小口径TEBV仍是领域内难题和全球性挑战。小口径TEBV在植入体内后引发的急慢性炎症反应是引起小口径TEBV血栓和内膜增生的重要诱因,目前公认的解决办法是促进TEBV的早期内皮化。内皮祖细胞(EPCs)作为促进TEBV实现在体内皮化的靶细胞,诱导其归巢并分化为内皮细胞是小口径TEBV在体构建的策略。研究表明急性炎症反应可以促进组织再生发生和骨髓EPC的动员,而炎症的及时消退对归巢干细胞的存活又十分必要,因此及时促进炎症消退对TEBV在体内皮化和保持长期通畅可能有重要作用。有研究发现神经轴突导向因子1(netrin-1)在天然血管的内皮细胞中有表达,其可作用于UNC5B和DCC受体促进血管生成,并具有抗炎作用。本研究采用层层自组装的方式构建壳聚糖纳米颗粒包裹netrin-1修饰的小口径TEBV,通过大量体内和体外实验研究其在调控巨噬细胞(MΦ)表型转化和小口径TEBV炎症消退及内皮化中的作用和机制。本研究构建的netrin-1修饰小口径TEBV植入后及时促炎症消退并顺利完成内皮化,最终在正常大鼠体内可保持14个月的通畅。但是在植入糖尿病大鼠后,由于机体脂质代谢紊乱,动脉粥样硬化易发,TEBV发生钙化的比例却极高,直接影响移植血管的通畅和功能。小口径TEBV移植是治疗糖尿病中小血管病变的重要手段,因此,如何在高糖下防止TEBV钙化、促进远期通畅,是TEBV移植治疗糖尿病血管病变需解决的关键问题。自体环境中人体除毛细血管外几乎所有血管都受交感缩血管纤维的神经支配,我们前期研究发现TEBV神经长入与平滑肌正常重建呈正相关,但其机制尚不清楚,所以深入研究神经重建对于小口径TEBV的作用具有重要意义。因此,围绕上述科学问题,我们从四个方面深入研究炎症消退和神经重建在构建抗血栓和抗高糖钙化的可保持长期通畅的TEBV中的重要作用:一、netrin-1调控小口径TEBV炎症消退及其机制研究本实验通过层层自主装方式将netrin-1包裹于壳聚糖纳米颗粒中并交联于TEBV表面,使TEBV具有良好的力学强度和长时间稳定缓释功能分子的能力以解决炎症和血栓形成问题。在体外通过流式、免疫荧光等方式检测了netrin-1对MΦ表型转化的作用,并进一步检测其上清炎症因子来验证转化效率,体内通过免疫荧光方式检测TEBV原位MΦ的浸润以及netrin-1对于炎症消退的作用。结果发现netrin-1可作用于A2b受体激活MΦ内PPARγ信号通路从而将其重编程为强表达CD163的抗炎型。在将netrin-1修饰的TEBV移植入大鼠体内后,发现netrin-1可促进在血管植入后3-7 d时原位浸润的MΦ转化为抗炎型,之后在14 d时已流出内膜表面,从而实现小口径TEBV的早期炎症消退,为归巢入的干细胞提供良好的再生微环境。二、炎症消退对小口径TEBV内皮化意义及其机制研究本部分我们研究在炎症消退中起关键作用的MΦ对EPCs增殖,迁移和血管生成能力的影响。此基础上在大鼠体内研究了小口径TEBV炎症消退和内皮化关系并探究其作用机制。首先,通过大量对比研究实验找到了提取MΦ外泌体时间、经济成本低且获得纯度高的超高速离心结合蔗糖垫方法,之后提取了不同表型MΦ的外泌体与EPCs共培养,观察其对EPCs功能的影响。结果发现促炎型MΦ外泌体可促进EPCs迁移,但长期存在不利于其增殖,而抗炎型MΦ外泌体则可明显提升EPCs的增殖和基质胶成管能力。Netrin-1修饰的小口径TEBV在植入体内后发现,其内皮化进程与炎症消退息息相关,炎症消退组的TEBV在30 d时完成早期内皮化并保持较长时间通畅,证实了及时促进TEBV炎症消退是其实现早期内皮化的必要条件。在临床血管移植中,炎症总是血栓形成和阻塞血管移植物的重要诱因,本研究将为血管移植物在宿主中的长期存活提供新的视角,也可能为其他炎症性疾病提供有效治疗方法。三、糖尿病下神经元外泌体对血管平滑肌细胞钙化作用及其机制研究本部分研究发现神经外泌体对抑制高糖条件下血管平滑肌细胞(SMC)表型转化和氧化应激具有显著作用,进一步对神经外泌体做质谱分析,发现其中含有大量的抑制氧化应激蛋白prdx-1。电镜和BCA蛋白浓度测定发现高糖状态下神经分泌外泌体的数量锐减,免疫荧光结果显示是这是由于负责囊泡运输的Rab35激活受到抑制。本研究通过外源性递送DENND1A,发现神

关键词：小口径组织工程血管炎症消退内皮祖细胞巨噬细胞重编程糖尿病血管钙化神经元外泌体平滑肌表型转化神经重建二级响应系统

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神经支配的小口径组织工程血管体内构建

神经支配的小口径组织工程血管体内构建

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作者：曾文第三军医大学

学位级别：博士

心血管疾病严重威胁着人类的健康，每年有17.3千万人死于心血管疾病。使得血管移植物的临床需求在全球范围内日益增大。外周血管闭塞或损伤替代、冠状动脉旁路移植、血液透析动静脉造瘘等都需要小口径血管移植物。现在肝、肾、肺等复杂... 详细信息

心血管疾病严重威胁着人类的健康，每年有17.3千万人死于心血管疾病。使得血管移植物的临床需求在全球范围内日益增大。外周血管闭塞或损伤替代、冠状动脉旁路移植、血液透析动静脉造瘘等都需要小口径血管移植物。现在肝、肾、肺等复杂器官构建以及大段骨缺损修复等都需要血管化，移植后血管的再通往往是影响构建器官能否存活并宿主化的关键，因而小口径血管的移植和构建也是复杂器官构建的关键科学问题之一。构建不需要体外种植内皮细胞的“现用型”组织工程血管是未来发展的方向。但是小口径组织工程血管（＜6mm）移植后由于早期血栓形成、中远期内膜增生、钙化等问题一直制约着其进一步的临床运用。因此，构建能够长期保持通畅的小口径工程血管仍是世界性的挑战。针对小口径组织工程血管血栓形成和内膜增生的难题，从仿生学入手深入研究血管植入物和血管周围环境的交互作用，能为构建长期通畅的小口径工程血管带来新的突破。工程血管体内植入后首先接触的是流动的血液。血液中有着大量的细胞，其中内皮祖细胞(EPCs)是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞，血液中内皮祖细胞含量增高时能直接修复损伤的血管，进而减少内膜增生和血栓形成，降低血管的再狭窄率。组织工程血管迅速内皮化是克服小口径血管血栓形成和内膜增生，提高血管通畅率的有效方法。因此如何促进工程血管内皮化，成为倍受关注的难点和热点。而诱导内皮祖细胞归巢于组织工程血管为其内皮化带来了新的机遇。从解剖生理上看，血管和神经常常形成血管神经束相伴前行，血管和神经的生长方式非常相似，它们循着相同的迁移路线，相互依赖，血管的活动和营养受神经调节。从发育生物学看，血管和神经更是息息相关，血管的发生和轴突的生长可以使用共同信号。轴突的生长可能对血管生物学行为产生重要影响。但是神经因素对工程血管的体内构建是否产生影响尚不清楚（科学问题之一）。尽管内皮化具有重要作用，但小口径PTFE人造血管在内皮化后仍然导致血栓形成，长期移植通畅率不高，是否与其不能降解因而缺乏与周围环境中的神经因素相互作用尚不清楚。那么，神经重建是不是组织工程血管长期通畅的充要条件，是可有可无还是不可或缺（科学问题之二）。冠脉搭桥等需要小口径工程血管，而冠状动脉和颈内外动脉都要受第十对脑神经迷走神经分支的支配，迷走神经起始部位——延髓橄榄后沟富含脑源性神经营养因子（BDNF）。已有研究发现BDNF不仅对神经生长和突触的可塑性有重要作用，而且在整个围血管形成期作用于心脏、骨骼肌和大动脉等特定器官组织。BDNF对于心血管和中心动脉有着比较特异的作用，而冠状动脉、颈动脉等正属于心血管和中央动脉。但BDNF对于用于冠脉搭桥等的工程血管构建有无影响，目前尚不清楚，值得深入研究。在此基础上，要回答神经调控对于工程血管是可有可无，还是不可或缺还必须构建一个神经支配的工程血管，并通过阻断神经支配来进行研究。选择一个同时具有血管效应和神经效应，并且存在各自独立受体的分子非常必要。而BDNF没有独立的血管效应和神经效应的受体，并不适合作为模式分子。筛选轴突生长诱导分子家族Ephrins、Semaphorins、Slits、Netrins，发现前三者主要功能是抑制，而Netrins的功能是吸引轴突生长。而且Netrins家族在血管和神经轴突的发育过程中都扮演着重要的角色。尤其是Netrin-1不仅诱导神经轴突的生长而且能够促进血管的萌芽和新生。A2b作为腺苷的一个受体也被确认为Netrin-1的受体在改善缺血和抗炎方面发挥作用。DCC作为神经效应受体介导Netrin-1诱导轴突的发育。因此，Netrin-1可以作为一个很好的工具便于我们研究神经调控对工程血管远期通畅的影响及分子机制。围绕这两个重要的科学问题，基于以上研究背景我们展开了以下四个方面的深入研究：一、组织工程血管支架构建及表面修饰选择具有良好力学强度和生物相容性的支架材料是组织工程血管构建的首要要求。我们选择大鼠颈动脉，采用独特的脱细胞技术，保留血管原有的胶原纤维和弹力纤维，用RNA酶，DNA酶、脂肪酶去除核酸和脂肪，得到直径达到1mm，具有良好力学强度，和生物相容性的血管脱细胞基质材料。胶原和壳聚糖都是天然高分子可降解材料，我们利用胶原包裹BDNF孵育已经制备好的血管基质材料，之后通过EDC对孵育了胶原的血管基质材料进行交联。进而在通过SPDP偶联蛋白的方法将BDNF再一次偶联于工程血管内表面，进而构建出BDNF修饰的小口径组织工程血管。扫描电镜发现胶原均匀覆盖血管内表面，进一步检测BDNF已经成功偶联于工程血管内表面。在此基础上为了达到更好的长时程缓释目的，我们将壳聚糖纳米颗粒包裹Netrin-1交联于已经制备好的血管基质材料，再交联胶原。之后通过SPDP

关键词：小口径组织工程血管内皮祖细胞神经营养因子家族脑源性神经营养因子(BDNF) 神经突起导向分子(Netrin-1) 神经支配

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双维度仿生血管基底膜的构建及其在小口径组织工程血管中的应用

双维度仿生血管基底膜的构建及其在小口径组织工程血管中的应用

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作者：于成龙东华大学

学位级别：博士

原位血管组织工程是治疗小口径血管疾病、促进损伤小口径血管原位再生的理想策略。然而,远期通畅率不佳制约了小口径组织工程血管（Ф<6 mm）的临床应用转化。促进小口径组织工程血管内表面的原位内皮化是解决该问题的一种潜在途径... 详细信息

原位血管组织工程是治疗小口径血管疾病、促进损伤小口径血管原位再生的理想策略。然而,远期通畅率不佳制约了小口径组织工程血管（Ф<6 mm）的临床应用转化。促进小口径组织工程血管内表面的原位内皮化是解决该问题的一种潜在途径。鉴于天然血管内皮层附着在血管基底膜（VBMs）上,本研究以静电纺纤维为研究平台,分别探究了纤维尺度、纤维取向、天然VBMs化学成分等因素对血管组织细胞行为的影响,围绕拓扑结构和化学成分双维度构建仿生VBMs,以期促进原位内皮化。受天然血管解剖结构启发,本研究最终设计并制备了基于仿生VBMs的静电纺纤维基三层结构小口径组织工程血管。主要研究内容与所取得的成果如下:（1）Ⅳ型胶原修饰无规纳米纤维膜对血管内皮细胞（ECs）行为的影响。制备纤维直径分别为54.77 nm（PCL-54）和544.64 nm（PCL-544）的PCL纤维膜,PCL平膜作为对照试样。细胞实验结果表明,相较于PCL-544和PCL平膜,PCL-54可以有效仿生天然VBMs的拓扑结构,有利于猪髂动脉内皮细胞（PIECs）的粘附和增殖,同时诱导PIECs充分铺展,并展现出更高的弹性模量和粘附力值。在此基础上,进一步引入Ⅳ型胶原至PCL-54,制备PCL-COLⅣ以仿生天然VBMs的拓扑结构和化学成分。结果表明,相较于PCL-54,PIECs在PCL-COL Ⅳ上的活性、增殖、铺展、细胞模量和粘附力进一步提升,证实表界面的拓扑结构和化学成分对ECs行为均有显著影响。（2）取向纤维尺度对血管ECs和巨噬细胞行为的调控。分别制备纤维直径为73 nm、582 nm、1456 nm、2036 nm、2738 nm和3442 nm的取向PCL静电纺纤维,评价纤维尺度对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）行为的影响,选用人源血管ECs更符合实验设计初衷。结果表明,纤维尺度对HUVECs的粘附和一氧化氮（NO）释放影响有限。当纤维直径大于1456 nm时,HUVECs可以渗入试样孔隙并向内部生长迁移,不利于单层HUVECs的形成。73 nm取向纤维对HUVECs形貌无明显影响,同时未观察到HUVECs的取向排列生长现象。即当纤维尺度较小时,纤维取向对HUVECs的形貌和取向生长无明显的接触引导作用。随着纤维直径的增大,HUVECs形貌的伸长程度先升高后下降,在2738 nm取向纤维上受到最强的接触引导作用,取向伸长程度达到峰值。对于巨噬细胞（RAW 264.7）,其在1456 nm纤维膜上的活性和TNF-α释放量均较低,表明1456nm取向纤维膜具有较优的抗炎性能。（3）Ⅳ型胶原/层粘连蛋白修饰取向微/纳混合纤维膜对血管ECs行为的影响。制备一种兼具取向纳米纤维和取向微米纤维对HUVECs的接触引导作用的微/纳混合纤维膜,其中直径为73 nm的取向PCL纳米纤维与天然VBMs的纤维尺度相近,直径为2.7μm的取向PCL微米纤维的存在则可以有效引导HUVECs形貌伸长。研究结果表明,取向微/纳混合纤维膜和取向微米纤维膜（2.7μm）允许HUVECs渗入迁移,这会导致HUVECs的多层生长,不利于完整平滑的HUVECs单层形成。相较而言,纳米尺度纤维更适合用于血管移植物内膜层的设计与制备。后续将天然VBMs的主要化学成分接枝引入微/纳混合纤维膜,包括单因素Ⅳ型胶原或层粘连蛋白,以及双因素Ⅳ型胶原和层粘连蛋白。相较于单因素化学成分,双因素Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的共同引入可以进一步优化HUVECs行为,表明更多天然VBMs化学成分的引入可能有利于促进内皮化。（4）肝素修饰细胞外基质（ECMs）材料对血管组织细胞行为的影响。以聚四氟乙烯（PTFE）为基底材料,经过聚多巴胺/聚乙烯亚胺（PDA/PEI）共沉积修饰后,利用HUVECs/人脐动脉平滑肌细胞（HUASMCs）共培养-脱细胞方法制备ECMs对其进行进一步化学修饰。实验结果表明,ECMs的引入对HUVECs和HUASMCs的生长均展现出明显的促进作用,而SMCs的过度增殖可能引起内膜增生。鉴于此,后续引入肝素改性ECMs,旨在实现选择性调控HUVECs和HUASMCs行为。肝素接枝密度分别为4.89±1.02μg/cm2、7.24±1.56μg/cm2、15.63±2.45μg/cm2和26.59±3.48μg/cm2。结果表明,低肝素接枝密度（4.89±1.02μg/cm2）试样的抗血小板粘附性能不佳,而高肝素接枝密度（26.59±3.48μg/cm2）会抑制HUVECs生长而促进HUASMCs增殖。综合分析,7.24±1.56μg/cm2为最优肝素接枝密度,此时试样的血液相容性优异,同时有望实现促进内皮化的同时抑制内膜增生。本研究提出的肝素修饰ECMs可以用于血管移植物材料的功能化修饰。（5）在以上研究的基础上,设计了

关键词：原位内皮化血管基底膜静电纺丝拓扑结构化学修饰细胞外基质小口径组织工程血管

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纤维蛋白凝胶管状支架在小口径组织工程血管培养中的应用研究

纤维蛋白凝胶管状支架在小口径组织工程血管培养中的应用研究

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作者：刘鹏华南理工大学

学位级别：硕士

利用组织工程的方法获取血管移植材料来解决小口径（<6mm）血管移植物临床供给不足的缺陷是目前血管界和材料界的研究热点之一,合适的支架材料是小口径组织工程血管体外成功构建的关键。天然纤维蛋白水凝胶管状支架对比其它合成高分... 详细信息

利用组织工程的方法获取血管移植材料来解决小口径（<6mm）血管移植物临床供给不足的缺陷是目前血管界和材料界的研究热点之一,合适的支架材料是小口径组织工程血管体外成功构建的关键。天然纤维蛋白水凝胶管状支架对比其它合成高分子支架材料具有独特的自身优势,但应用纤维蛋白凝胶支架时需要使用氨基己酸（ACA）来维持其稳定性的方法不利于细胞的长时间培养。本研究将探究氯化钠（Na Cl）替代氨基己酸来获取适合小口径组织工程血管培养的纤维蛋白凝胶管状支架的可行性,并对其性能进行评估。本研究首先使用纤维蛋白原、凝血酶以及氯化钙作为基础原料,采取温度控制等技术步骤获得纤维蛋白凝胶材料,并对材料进行性能表征以及微观结构观察;其次利用特定的管状模具制备纤维蛋白凝胶管状支架,并使用支架材料包埋人血管外膜来源的成纤维细胞进行培养,从而评估其细胞相容性。然后将不同浓度的Na Cl添加剂替代ACA来获取纤维蛋白凝胶管状支架,并与相同条件下添加了ACA的管状支架进行性能比对,并检测了支架在包埋人成纤维细胞后对细胞的增殖与分泌细胞外基质的影响;最后采用体外生物反应器对改良后的纤维蛋白凝胶管状支架进行三维组织工程血管构建的短期效果评价。结果显示,该制备方法获得的纤维蛋白凝胶整体外观呈现为乳白色,外表光滑、厚度均匀;测得凝胶平均成胶时间为（172.0±4.7）s,吸水率为（34.50±1.87）%,完全降解时间为7d,杨氏模量为（2624±295）Pa,凝胶整体结构具有一定稳定性;微观结构呈现为多孔隙网状纤维,纤维直径为（0.41±0.03）μm,网状纤维平均孔隙大小为（47.87±9.60）μm2,内部含水量高;包埋人成纤维细胞后,细胞在凝胶中形态完整、分布均匀,存活情况良好。此外,在纤维蛋白凝胶前体溶液中添加不同浓度（0.9%、1.8%、2.7%、3.6%、4.5%w/v）Na Cl可以调控凝胶的微观结构和力学性能,与添加0.3%（w/v）ACA的凝胶相比,添加Na Cl使凝胶透明度显著增加,凝胶成胶时间显著减少,纤维直径显著减小,纤维孔隙显著增大,并且在1.8%（w/v）Na Cl浓度时凝胶力学稳定性显著提升,此时凝胶表现为疏松多孔、纤维粗细均匀。利用不同浓度Na Cl制得的凝胶管状支架包埋细胞培养2周,显示添加一定浓度Na Cl与添加0.3%（w/v）ACA制备的凝胶在包埋细胞活性和增殖细胞比例上有显著差异,其中添加1.8%（w/v）Na Cl组凝胶包埋的细胞与添加0.3%（w/v）ACA的对照组相比活性显著更高,细胞增值速度显著更快;将其转移至灌流式生物反应器在力学刺激条件下培养2周时间,可见细胞分泌的细胞外基质厚度显著更厚,细胞数目显著增加。纤维蛋白凝胶支架是一种理想的高含水性多孔隙生物支架材料,细胞相容性好;1.8%（w/v）Na Cl溶液作为纤维蛋白凝胶最适浓度的添加剂,可完全实现在组织三维培养过程中对ACA替代,并在血管培养生物反应器上得到了初步应用,这将为小口径组织工程血管移植物的构建提供一种极有前景的天然生物支架材料,并为定制开发各种组织工程生物支架提供了依据。

关键词：小口径组织工程血管纤维蛋白凝胶管状支架氯化钠氨基己酸

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脐动脉在搏动流作用下脱细胞制备小口径组织工程血管支架的研究

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北京生物医学工程 2010年第5期29卷 511-516页

作者：陈圣杰刘硕李京倖赵莉敏汪川张帆董培青首都医科大学附属北京安贞医院北京100029 北京市心肺血管疾病研究所北京100029

探索利用搏动流对小口径血管进行脱细胞的方法。首先将脐动脉连接到搏动流管道中进行灌注,结合0.25%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸混合溶液的共同作用,以1%十二烷基硫酸钠为脱细胞试剂对脐动脉洗脱3h。洗脱3h后的病理切片显示脐动脉细胞... 详细信息

探索利用搏动流对小口径血管进行脱细胞的方法。首先将脐动脉连接到搏动流管道中进行灌注,结合0.25%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸混合溶液的共同作用,以1%十二烷基硫酸钠为脱细胞试剂对脐动脉洗脱3h。洗脱3h后的病理切片显示脐动脉细胞被全部脱去;拉伸实验测定脐动脉脱细胞前极限应力为(3.55±0.42)N,脱细胞后其极限应力为(3.50±0.43)N(P>0.05);在300mmHg压强作用下,脐动脉脱细胞前后两组(各30根血管)均有2根破裂,28根保持完好(P>0.05)。此结果预示,脐动脉在脱细胞前后的力学特性无显著差异。成纤维细胞静态培养显示,成纤维细胞能在脱细胞脐动脉支架表面良好生长。研究结果表明利用搏动流将小口径血管脱细胞是一种简便、快速、有效的方法。

关键词：脉动流洗脱细胞小口径组织工程血管脐动脉

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流动剪切力促小口径组织工程血管内皮化

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中国组织工程研究 2017年第16期21卷 2515-2520页

作者：张伟宋爱晶冠昊生物科技股份有限公司再生型医用植入器械国家工程实验室广东省广州市510530 广东省体育科学研究所广东省广州市510663

背景:细胞内皮化的流动剪切力大小和作用方式是小口径组织工程血管的构建中的关键问题。小口径组织工程血管构建后的抗血流冲击能力是决定移植成功的关键因素之一,较多人把研究重点集中在如何制作移植血管支架材料,如何提高宿主细胞种... 详细信息

背景:细胞内皮化的流动剪切力大小和作用方式是小口径组织工程血管的构建中的关键问题。小口径组织工程血管构建后的抗血流冲击能力是决定移植成功的关键因素之一,较多人把研究重点集中在如何制作移植血管支架材料,如何提高宿主细胞种植后其血管内壁的抗凝效果,而对细胞内皮层的力学驯化则关注较少,该方法有可能是提高组织工程血管移植成功率的有效手段之一。目的:比较单一水平和成梯度增加的流动剪切力对组织工程血管内皮化的影响,获得适用于组织工程血管内皮化的剪切力大小和加载方式。方法:采用血管铺片硝酸银染色法和内皮细胞肌动蛋白荧光标记法,观察组织工程血管内壁上内皮细胞的数量、形状和黏附性能等变化情况。结果与结论:经2.5和3.0 N/m^2剪切力作用2 h后,血管内壁上的内皮细胞几乎全部脱落;而经0.5-3.0 N/m^2,每2 h增加0.2 N/m^2的成梯度增加的剪切力作用后,血管内皮细胞层保持较完整,细胞形态成明显的轴向排列,且能诱导内皮细胞中应力纤维的出现。说明成梯度增加的流动剪切力这种"驯化"方式,能较好地促进小口径组织工程血管的内皮化。

关键词：内皮细胞生物力学组织工程组织构建流动剪切力小口径组织工程血管内皮化单一水平成梯度增加黏附性能应力纤维

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不同静电纺丝膜上骨髓间充质干细胞的黏附、增殖与成血管平滑肌分化

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中国组织工程研究 2025年第4期29卷 661-669页

作者：孙现娟王秋花张锦艺杨杨杨王文双张晓晴滨州医学院基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室生物材料与组织再生国际合作联合实验室山东省烟台市264003 烟台毓璜顶医院妇科山东省烟台市264000

背景:临床上迫切需要小口径人工血管来治疗冠状动脉和外周动脉疾病,目前,血管组织工程已成为制备小口径人工血管的主要方法,选择合适的生物材料和细胞来源是小口径组织工程血管构建成功的关键因素。目的:观察4种静电纺丝膜材料对骨髓间... 详细信息

背景:临床上迫切需要小口径人工血管来治疗冠状动脉和外周动脉疾病,目前,血管组织工程已成为制备小口径人工血管的主要方法,选择合适的生物材料和细胞来源是小口径组织工程血管构建成功的关键因素。目的:观察4种静电纺丝膜材料对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化为血管平滑肌细胞的影响。方法:分离提取SD大鼠骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞分别接种于聚己内酯(PCL)、聚己内酯-透明质酸(PCL-HA)、聚己内酯-丝素蛋白(PCL-SF)、聚己内酯-明胶(PCL-GEL)静电纺丝膜材料上,培养1,3,7 d后,扫描电镜下观察材料上的细胞排布,鬼笔环肽染色观察材料上的细胞增殖与黏附,qRT-PCR检测材料上细胞分泌的CD90、Meflin、转化生长因子βmRNA表达;向血管平滑肌细胞诱导分化7 d后,qRT-PCR检测材料上细胞ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达。结果与结论:①扫描电镜下可见骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上均沿着静电纺丝膜的纤维走向排列;②鬼笔环肽染色显示,骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上分布规律,均沿着纤维走向呈现平行分布,并且PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL静电纺丝膜较PCL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附,PCL-SF静电纺丝膜相较于PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附;③qRT-PCR检测显示,4种静电纺丝膜材料均可维持骨髓间充质干细胞CD90和Meflin的mRNA表达,组间比较差异无显著性意义(P>0.05);PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL组培养1,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL组(P<0.05),PCL-SF组培养3,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组培养7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL-GEL组(P<0.05);④qRT-PCR检测显示,PCL-SF组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于PCL组(P<0.05);⑤结果表明:相较于PCL、PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜,PCL-SF静电纺丝膜与骨髓间充质干细胞结合更适合制备小口径组织工程血管。

关键词：骨髓间充质干细胞小口径组织工程血管静电纺丝聚己内酯聚己内酯-透明质酸聚己内酯-丝素蛋白聚己内酯-明胶

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胚胎干细胞衍生的内皮细胞联合MCC950构建功能性组织工程血管

胚胎干细胞衍生的内皮细胞联合MCC950构建功能性组织工程血管

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作者：杨冠渊中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

21世纪初,全球约1700万人死于心脑血管疾病,预计到2025年死亡人数将达到3000万人[1]。其中,急性心肌梗死的致死率最高,针对心梗后心肌细胞的损伤及其主要病因动脉粥样硬化,科学家们提出不同的解决方案,取得了显著成效。但最终,血管移植... 详细信息

21世纪初,全球约1700万人死于心脑血管疾病,预计到2025年死亡人数将达到3000万人[1]。其中,急性心肌梗死的致死率最高,针对心梗后心肌细胞的损伤及其主要病因动脉粥样硬化,科学家们提出不同的解决方案,取得了显著成效。但最终,血管移植仍然是解决这一难题不可或缺的有效手段。据统计,每年全球大约超过60万人需要进行血管外科手术,血管移植是临床治疗血管疾病（如动脉粥样硬化、动脉瘤、先天性血管畸形）及外伤性血管损伤等的主要手段[2]。自体动脉和自体静脉是较理想的动脉移植物,但人体自身可供移植的非必需血管的来源、长度和直径范围都极为有限。异体血管移植存在的免疫排斥反应和其他术后并发症等问题尚未解决[3]。小口径组织工程血管有着广泛的临床需求。内皮细胞作为血管的主要功能细胞,可以合成和分泌多种血管活性因子,调节凝血和抗凝,改变血管的通透性,促进营养物质交换和代谢,并且,可以调控平滑肌细胞的功能,维持血管的舒缩平衡[4,5]。已有研究表明,血管内腔内皮细胞层的存在,形成了血管壁屏障,是抑制血栓形成和内膜增生的关键因素。人体自身的内皮细胞功能完善,没有免疫原性,但是原代细胞提取、培养、扩增的问题都难以解决[6]。而胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的潜能[7],理论上,可以产生足够数量的血管细胞（血管内皮细胞、平滑肌细胞）满足临床和科研的需求。所以,胚胎干细胞作为内皮细胞的来源,具有广阔的应用前景[8]。血栓和内膜增生发生的另一个重要原因就是炎症反应。小口径组织工程血管植入体内后,引发急性炎症反应,加速了血栓的发生和发展。并且,炎症刺激平滑肌细胞异常迁移和增殖,级联反应募集了更多的炎性细胞,导致组织工程血管出现内膜增生[9,10]。炎症反应是一把双刃剑,适当的炎症可以促进组织工程血管体内重建[11],但是不可控的炎症反应却极大的影响了组织工程血管的长期通畅。NLRP3炎症小体的激活是炎症反应的关键阶段,因此,我们想通过小分子抑制剂MCC950抑制炎性小体[12],调节炎症反应,改善局部微环境,实现小口径组织工程血管的在体重建和长期通畅。我们将胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞,通过体外种植技术,实现组织工程血管的内皮化。接着,通过自组装技术,将小分子抑制剂MCC950修饰于血管外膜,发挥抗炎功能。体内移植后,内皮细胞分泌活性因子,抑制血栓形成和内膜增生。小分子抑制剂调控炎症反应,改善局部微环境,促进组织工程血管重建,最终实现组织工程血管的长期通畅。方法:1、靶向递送小分子抑制剂MCC950首先,我们以最常见也是最严重的心血管疾病,急性心肌梗塞作为动物模型,研究小分子抑制剂MCC950的炎症调控功能,并观察是否对心血管功能恢复产生影响。为避免局部注射的二次损伤,我们采用靶向递送的方式。设计靶向递送系统,装载MCC950。粒径分析及透视电镜对材料进行表征,缓释及酶响应实验测定递送系统的效率。活体荧光成像观察药物递送系统的靶向能力。通过超声、Masson染色、HE染色观察心梗治疗后心功能的恢复情况。2、胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞培养胚胎干细胞,并进行稳定扩增。免疫荧光染色观察ESC多能性因子的表达情况。采用改善的诱导分化方案,将ESC分化为血管内皮细胞。免疫荧光染色,Weston blot,RT-q PCR,检测内皮特异性marker的表达情况。流式细胞分析术检测诱导分化效率。小管形成实验验证诱导内皮细胞的生物学功能。3、构建MCC950修饰的内皮化小口径组织工程血管并进行体内移植运用自组装技术,将MCC950修饰于脱细胞血管基质的外膜,通过扫描电子显微镜进行表征。诱导内皮细胞种植于血管内腔后,通过扫描电镜、HE染色观察种植情况。功能化小口径组织工程血管体内移植后,通过超声、CTA、HE染色、免疫荧光染色,观察血管移植物的通畅情况、炎性细胞浸润情况以及血管重构情况。结果:1、TEM和粒径分析表明,药物递送系统构建成功,大小均一、形态一致。缓释及酶响应实验表明,MCC950装载稳定,酶响应情况良好。活体荧光成像显示MCC950高效递送到心梗区域。超声、masson染色、HE染色结果表明,MCC950可以抑制炎症小体的功能,保护心肌细胞免受进一步损伤,恢复心脏功能。2、胚胎干细胞可以高效分化为血管内皮细胞。免疫荧光,免疫蛋白印迹及q PCR结果显示,诱导内皮细胞表达CD31/CD144/v WF等内皮细胞特异性标志。流式细胞分析结果显示,CD31/CD144双阳性细胞达到90.5%。诱导内皮细胞具有稳定成小管的能力。3、TEM及HE检测显示,体外成功实现了组织工程血管的内皮化,并将MCC950修饰到了血管外膜表面。体内移植1个月后,MCC950修饰的内皮化小口径组织工程血管通畅良好,对照组出现了狭窄和堵塞。免疫荧光染色及HE染色显示,实验组炎症

关键词：急性心肌梗死 NLRP3炎性体胚胎干细胞内皮化小口径组织工程血管

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一种具有原位血管再生潜能的小口径肝素化血管移植物的制备

一种具有原位血管再生潜能的小口径肝素化血管移植物的制备

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作者：王莉吉林大学

学位级别：硕士

心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是世界上发病率和死亡率最高的疾病之一，严重影响人类的健康。近年来随着我国人口的老龄化和居民饮食结构的改变，心血管疾病的发病率更是呈逐年上升趋势。血管移植术是目前有效治疗心血管... 详细信息

心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是世界上发病率和死亡率最高的疾病之一，严重影响人类的健康。近年来随着我国人口的老龄化和居民饮食结构的改变，心血管疾病的发病率更是呈逐年上升趋势。血管移植术是目前有效治疗心血管疾病的手段，临床上应用的血管移植物主要有二个来源：自体血管和人工组织工程血管。虽然自体血管是最理想的血管移植物，但是常由于患者自身病变以及来源有限等不能满足临床需求，商品化的人工血管口径较大（＞6mm），且易形成血栓，不能满足冠状动脉以及周围动脉小口径血管的要求。因此寻求一种机械性能和生物性能俱佳的血管支架材料日益成为研究者关注的热点。为此本研究利用人新生儿脐动脉为原材料，通过酶-去污剂去细胞技术进行去细胞处理，制备去细胞血管支架。然后通过交联剂EDC和NHS，将肝素共价结合在去细胞血管支架上，制备出生物力学和血液相容性俱佳的肝素化血管支架。方法：1.以新生儿脐动脉为血管材料，通过酶-去污剂去细胞技术，制备去细胞血管支架。通过HE染色、Hoechst染色观察去细胞血管支架细胞的形态学结构。2.通过交联剂EDC和NHS，将肝素以共价键的形式结合在去细胞血管支架上，制备肝素化血管支架。并通过甲苯胺蓝染色和傅里叶变换衰减全反射红外光谱分析（ATR-FTIR）来评价肝素化血管支架的肝素负载情况。3.通过HE染色、Masson三色染色和VG染色观察天然脐动脉、去细胞血管支架和肝素化血管支架的形态学结构变化；通过扫描电镜检测三种血管支架的内腔表面的超微结构形态；通过对胶原蛋白和蛋白多糖含量的测定来评价肝素化血管支架对血管基质的保留情况；通过对生物力学的测定来评价三种血管支架机械强度和顺应性的变化。4.分别通过血小板黏附试验和动静脉分流试验（AV-shunt），观察肝素化血管支架分别在体外和体内情况下的血液相容性。结果：1. HE染色、Hoechst染色发现，去细胞血管支架，不仅完全将血管中的细胞成分去除，而且血管基质结构保留完整，形态保持良好。2.甲苯胺蓝染色结果发现肝素沿着ECM中的纤维走向分布，表明肝素结合在血管支架基质纤维的表面；肝素化血管支架ATR-FTIR图谱中出现了肝素分子的特征性吸收峰，并且酰胺键的吸收峰值变强，表明肝素已成功以共价键的形式固定在了血管支架上。3. HE染色、Masson三色染色和VG染色结果表明肝素化血管支架胶原纤维和弹力纤维均得到很好的保留；扫描电镜检测发现，去细胞血管支架经肝素化处理以后，内腔表面由多孔样结构重新变得光滑；在对胶原蛋白和蛋白多糖含量的测定结果发现肝素化血管支架较好地保留了天然血管ECM的主要成分胶原蛋白和蛋白多糖；通过对三种血管支架爆破强度和拉伸曲线的检测，发现肝素化血管支架生物力学性能相比去细胞血管支架得到很大程度的优化。4.在血小板黏附试验中，肝素化血管支架相比去细胞血管支架能显著地降低表面血小板的黏附和活化；在动静脉分流活体实验中得到与血小板黏附试验相一致的结果，并且对动静脉分流后血管支架血栓面积的统计表明，肝素化血管支架的血栓面积百分比远远低于去细胞血管支架，更能直观地说明肝素化血管支架在活体实验情况下能有效地抑制血栓形成。结论：1.通过酶-去污剂去细胞方法，成功制备去细胞血管支架，血管基质形态和结构保留完整。2.成功制备出以共价键结合的肝素化血管支架。3.肝素化血管支架，保留了天然血管基质的复杂的三维结构和胞外基质成分，并且其生物力学性能相比去细胞血管支架得到很大程度的优化，满足血管移植物的要求。4.肝素化血管支架在体外实验和活体实验均能抑制血栓的形成，具有良好的血液相容性，为临床应用提供实验依据。

关键词：血管移植小口径组织工程血管去细胞血管支架肝素化血管支架抗血栓形成

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