检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：范鹏吉林大学

学位级别：博士

CRISPR-Cas系统由于简单且高效的特性已经成为基因编辑的主流技术,尤其是Cas9和Cas12a系统。但因传统核酸酶自身分子量过大,一般需要双AAV载体递送到体内,降低了基因编辑器的体内递送效率。为了解决这一问题,亟需小型Cas核酸酶的开发和... 详细信息

CRISPR-Cas系统由于简单且高效的特性已经成为基因编辑的主流技术,尤其是Cas9和Cas12a系统。但因传统核酸酶自身分子量过大,一般需要双AAV载体递送到体内,降低了基因编辑器的体内递送效率。为了解决这一问题,亟需小型Cas核酸酶的开发和探索。隶属于2类CRISPR-Cas系统中V-F亚型效应蛋白的Cas12f核酸酶,是目前研究发现最紧凑的CRISPR效应核酸酶。其尺寸仅有Sp Cas9核酸酶的三分之一大小,因此在临床治疗应用中具有巨大潜力。其中,来自硫酸氧化酸杆菌(Acidibacillus sulfurooxidans)的紧凑型AsCas12f1蛋白仅由422个氨基酸组成,其可以在RNA引导下通过识别NTTR(其中R代表A或G)的PAM切割双链DNA。但因其在哺乳动物细胞中编辑效率较低,难以广泛应用于基因编辑领域。作为AsCas12f1同家族的Un1Cas12f1和Spa Cas12f1基因编辑系统,均已成功通过sg RNA(tracr RNA-cr RNA)优化显著提升了其在细胞中的编辑效率。在Un1Cas12f1系统中,基于sg RNA结构共设计了五种不同的工程化g RNA策略,成功使Un1Cas12f1系统在哺乳动物细胞中的编辑效率可以媲美Sp Cas9系统。因此,本研究旨在对紧凑型AsCas12f1基因编辑系统的sg RNA进行系统优化,以提高其在细胞及动物胚胎中的编辑效率,并利用AsCas12f1系统构建模拟人类遗传疾病的动物模型。首先,为了验证AsCas12f1系统在细胞上的基因编辑效率,本研究选择符合NTTR PAM(TTTG/TTTA/CTTG/ATTG)要求的15个基因靶位点,并在HEK293T细胞中进行了效率验证。测序结果显示,AsCas12f1系统在上述15个靶位点中,编辑效率均未超过10%,其中插入或删除(Indel)最高的靶位点为PDCD1位点,突变效率为9.31%。这说明AsCas12f1系统的基因编辑效率整体偏低,需进一步优化提升。为了有效提升AsCas12f1系统的编辑效率,本研究对其sg RNA骨架进行如下优化:修饰sg RNA骨架(T4AT6/GGG);调整cr RNA与tracr RNA结合长度(MS);删减g RNA茎环处无序区域(DS)。然后,将上述效率提升方案进行组合,得到T4AT6和MS组合的sg RNA版本(As-v1),并将其与AsCas12f1蛋白结合的新系统命名为AsCas12f1-v1。最后,在HEK293T细胞中,比较了AsCas12f1-v1系统与AsCas12f1系统和Un1Cas12f1系统的基因编辑效率。结果显示,优化后的AsCas12f1-v1系统在HEK293T细胞中的编辑效率显著提升,优于AsCas12f1系统和Un1Cas12f1系统。其次,为了进一步验证AsCas12f1-v1系统的基因编辑能力,本研究对小鼠和家兔胚胎进行了基因编辑。首先,我们在小鼠胚胎上选取了Dctn6、Komp、Tyr、Dmd、Polg 5个靶位点。然后,通过显微注射方式将AsCas12f1的m RNA与相应的sg RNA混合体系注入小鼠胚胎细胞内。最后,待胚胎发育到囊胚期后,收集胚胎细胞并鉴定AsCas12f1系统和AsCas12f1-v1系统的基因编辑效率。小鼠胚胎的结果显示,与AsCas12f1系统相比,AsCas12f1-v1系统成功在小鼠胚胎五个位点上实现了基因编辑,编辑效率为15.62%-62.47%。此外,我们也在家兔胚胎上选取了Hbb、Fgf5、Wrn、Otc、Mstn 5个基因位点进行验证。家兔胚胎的结果显示,与AsCas12f1系统相比,AsCas12f1-v1系统也成功在家兔胚胎上实现了基因编辑,编辑效率为4.75%-16.82%。最后,为了证明AsCas12f1-v1系统也具备在哺乳动物体内实现基因编辑的能力。我们将含有m RNA与Tyr、Dmd、Foxp1位点As-v1 sg RNA的受精卵转移到代孕母鼠中,获得F0代基因编辑小鼠。待小鼠出生7–10天后,对小鼠进行标记并提取基因组进行鉴定。深度测序结果显示,AsCas12f1-v1系统在小鼠体内成功实现了基因编辑,编辑效率分别为:Tyr(38.87%-49.66%),Dmd(33.47%-47.16%),Foxp1(23.41%-37.42%)。此外,我们还分别对Tyr突变,Dmd突变和Foxp1突变小鼠进行了初步的鉴定。结果显示,三个小鼠突变模型均准确模拟出了人类相应疾病的典型症状。综上所述,本研究通过对AsCas12f1系统的sg RNA优化,有效提升了其在细胞及动物胚胎中的编辑效率。并利用优化后的AsCas12f1-v1系统实现了小鼠体内编辑并构建了模拟人类疾病的动物模型。该研

关键词： AsCas12f1 sgRNA优化基因编辑效率胚胎编辑小鼠疾病模型

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DSG2基因突变所致致心律失常性右室心肌病的小鼠疾病模型建立及表型鉴定

DSG2基因突变所致致心律失常性右室心肌病的小鼠疾病模型建立及表...

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作者：廖泓宇四川大学

学位级别：硕士

目的:致心律失常性右室心肌病(ARVC)是心脏疾病中较少见但致死率高的一类,它一种以右室心肌渐进性纤维脂肪化为特征的遗传性心肌病,是年轻人致心律失常性心脏骤停的主要原因之一。ARVC总体发病率约为1/5000,一些欧洲国家的发病率更高。... 详细信息

目的:致心律失常性右室心肌病(ARVC)是心脏疾病中较少见但致死率高的一类,它一种以右室心肌渐进性纤维脂肪化为特征的遗传性心肌病,是年轻人致心律失常性心脏骤停的主要原因之一。ARVC总体发病率约为1/5000,一些欧洲国家的发病率更高。编码桥粒蛋白的基因突变在ARVC发病中发挥关键性作用。最常见的突变基因是PKP2(19%～46%),其次是DSP(1%～16%),DSG2(2%～10%)和DSC2(1-8%)。DSG2编码桥粒芯糖蛋白,是一种单次跨膜糖蛋白,其胞外区可与自身或DSC2形成同源或异源二聚体,通过相互铆合来维持心肌细胞间的连接,胞内段则和PKP2与DSP连接,DSP再与结蛋白、肌丝等细胞骨架蛋白相连维持心肌细胞间连接的完整。其作为桥粒的5种组分蛋白之一,对维持桥粒结构的稳定性及组装有重要作用。而且DSG2基因突变患者总体上临床表现差异较大。构建DSG2基因突变所致致心律失常性右室心肌病的小鼠疾病模型,有助于我们深入解析疾病发生发展分子机制,并在此基础上建立新的诊断方法和防治措施。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9技术作为一种快速且高效的基因编译技术,近年来被广泛应用于各个研究邻域。通过靶向PAM位点(NGG)的sg RNA定位,可以利用Cas9精准的剪切PAM位点上游3-5个碱基的DNA双链结构,在导入互补模板的情况下,机体细胞的HDR修复机制可以依托此导入模板进行切断位点的修复,实现定点的基因突变;通过此方法可达成对小鼠进行定点突变,获得基因突变个体。综上本研究的目的为:1)发现可能致病的DSG2突变位点2)获得DSG2特定位点突变的小鼠个体;2)检测突变小鼠的各种疾病表型,构建成功的疾病模型;材料和方法:1)通过对我院诊断的一例ARVC患者的基因组测序,找到一个DSG2的新的突变位点p.R49H,该突变大概率为致病突变。2)将该突变位点通过同源性比对,确定至小鼠的p.R54H位点。利用CRISPRCas技术,在计划突变的外显子处设计适宜的sg RNA,通过显微注射将修复模板质粒、sg NRA和Cas9蛋白注射到C57BL/6J背景的小鼠受精卵内,取注射后存活的受精卵到假孕的雌鼠体内产仔,构建所发现位点的突变小鼠。3)取突变小鼠合笼培养,取出生幼鼠的耳廓或脚趾组织进行基因型鉴定,将鉴定携带突变基因的小鼠饲养至8周龄观察小鼠存活率。同时以同周龄的WT小鼠作为阴性对照,观察小鼠生存情况,使用小动物高频超声心动图检测小鼠心脏形态和功能;HE染色评估心肌细胞形态大小;分离心肌细胞免疫荧光染色SAA与Caveolin-3,评估细胞面积、心肌细胞肌节与T管的规整度;冰冻切片的免疫荧光染色分析DSG2蛋白、YAP蛋白的表达与分布,电镜观察线粒体状态,RNA-seq分析转录组的改变。结果:通过临床资料的分析与患者血样的基因组测序,我们发现了ARVC患者所携带的DSG2基因p.R49H位点的突变。通过人与鼠的基因同源性比对发现人的p.R49H位点为鼠的p.R54H位点,以此为点作为突变的目标位点,通过CRISPR-Cas基因编辑技术,及受精卵显微注射,成功培育出C57BL/6J背景的p.R54H位点AGG到CAC的突变型小鼠。培育过程中发现该突变纯合致死的可能性较大。与野生型小鼠相比,突变鼠的8周生存状况无异常,心功能明显下降,EF、FS明显低于正常,心室腔明显扩张,心肌细胞增大,T-管与肌节的规整度明显下降。但未观察到心肌细胞的排列紊乱、线粒体行为改变。结论:小鼠DSG2突变的ARVC动物模型被我们初步建立起来,但仍有进一步观察的必要。我们认为该品系小鼠可作为ARVC进一步发病机制研究以及治疗方法探究的可用动物模型。

关键词： DSG2 致右室心律失常型心肌病小鼠疾病模型

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三氯乙烯药疹样皮炎HLA-B*13:01转基因小鼠疾病模型的构建及评价

三氯乙烯药疹样皮炎HLA-B*13:01转基因小鼠疾病模型的构建及评价

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作者：纪玉青中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

三氯乙烯(TCE)能致职业接触者发生三氯乙烯药疹样皮炎(TIHD),该病是以全身性皮肤损害为主、伴多脏器损伤的一类超敏反应综合征。本课题组前期研究发现HLA-B*13:01基因与该病高度相关,本研究尝试利用HLA-B*13:01 C57/BL6转基因小鼠(TG小... 详细信息

三氯乙烯(TCE)能致职业接触者发生三氯乙烯药疹样皮炎(TIHD),该病是以全身性皮肤损害为主、伴多脏器损伤的一类超敏反应综合征。本课题组前期研究发现HLA-B*13:01基因与该病高度相关,本研究尝试利用HLA-B*13:01 C57/BL6转基因小鼠(TG小鼠)构建TIHD疾病模型,为HLA-B类基因在体内功能分析以及疾病发病机制探讨建立研究平台。本研究在课题组前期构建的HLA-B*13:01转基因首建鼠基础上,对TG小鼠脾淋巴细胞表面HLA-B*13:01分子表达情况进行鉴定、利用TG小鼠构建TIHD疾病模型,并对TG小鼠模型进行评价。研究结果如下:一、TG小鼠脾淋巴细胞HLA-B*13:01分子表达测定利用荧光抗体对TG小鼠脾淋巴细胞标记后行流式细胞术检测。结果显示,不同代别、性别TG小鼠HLA-B*13:01分子均表达良好,TG小鼠脾淋巴细胞表达HLA-B*13:01分子表达阳性率为(59.08±16.45)%,而野生型(WT)小鼠只有(2.50±0.57)%,差异有统计学意义(P<0.05);且HLA-B*13:01基因能在后代中稳定表达。二、构建TG小鼠TIHD疾病模型利用TG小鼠62只,随机分为溶剂对照组(8只),TCE染毒组(40只,分为24h、48h、72h、7d组,每组10只,即分别于末次激发后24h、48h、72h、7d进行各项指标检测),过继免疫组(14只);每组雌雄各半。染毒过程:第1天,20%TCE:FCA=1:1混匀后100μl上背部注射,在第5、12、19天分别用100μl50%TCE上背部斑贴,于第26天和28天两次用50μ 30%TCE斑贴下背部,20 μl 30%TCE涂抹左耳耳廓;末次激发后24h根据EASI评分系统对小鼠背部皮肤症状进行评分,评分≥1者为阳性小鼠。溶剂对照组使用溶剂诱导,余同处理组,对照组均于末次激发后24h对各项指标进行检测。68只WT小鼠作为对照,其中过继免疫组20只,余同TG小鼠。除过继免疫组外,各组于处理前24h腹腔注射100μl 5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)溶液[5mg/ml,溶剂:二甲亚砜(DMSO)]用于检测淋巴细胞增殖。结果显示TG小鼠发病率为93.88%,背部评分为(2.28±0.78);WT小鼠发病率仅为37.32%,背部评分为(1.68±0.67);差异均有统计学意义(P<0.05)。三、TG小鼠TIHD疾病模型的评价1)皮肤损伤和引流淋巴结肿大:TG和WT发病小鼠皮肤及耳廓病理可见随着背部症状评分升高淋巴细胞浸润有加重趋势;免疫组化显示:与对照组耳廓CD4+、CD8+T细胞浸润程度[(5.40±1.67)%和(10.60±3.65)%]比较,TCE处理TG发病组[(16.80±5.26)%和(19.20±5.07)%]均增高(P<0.05)。与皮肤对照组CD4+、CD8+T细胞浸润程度[(17.20±4.15)%和(16.60±2.70)%]比较,TCE 处理 TG 发病小鼠[(29.80±7.22)%和(21.00±2.92)%]均增高,且CD4+T细胞浸润程度重于CD8+T细胞(P<0.05)。TG小鼠72h发病组耳后淋巴结脏器系数[(0.0300±0.0141)%]高于对照组[(0.0094±0.013)%],TG小鼠48h和72h发病组耳廓肿胀度(1.1357±0.1306、1.2678±0.1694)均高于对照组(1.04677±0.0979)(P<0.05)。2)肝脏损伤:TG和WT发病小鼠肝脏病理可见肝细胞肿胀、淋巴细胞浸润,TG小鼠肝损伤程度重于WT小鼠;免疫组化显示:与对照组CD4+、CD8+T细胞浸润程度[(11.60±4.39)%和(15.60±7.23)%]比较,TCE 处理 TG 发病组[(28.80±5.36)%和(30.60±6.58)%]CD4+、CD8+T细胞浸润程度均增高(P<0.05)。与对照组血清谷氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)[(49.33±6.77)和(133.14±34.59)U/L]比较,TG 发病小鼠 24h 组[(104.67±32.64)和(272.00±62.25)U/L]均升高(P<0.05)。3)被动超敏反应:分离发病小鼠(供体)血清和淋巴细胞,单独血清或淋巴细胞以及联合两者尾静脉注射到健康小鼠(受体)体内,体外TCE激发;对照是以健康小鼠作为供体的免疫过继;接受发病小鼠免疫过继的称为阳性受体小鼠,接受对照供体小鼠的称为对照受体小鼠。对照受体小鼠均不发病,而联合血清和淋巴细胞免疫过继的WT阳性受体小鼠5只全部发病,发病率为100%,TG阳性受体小鼠5只中有4只发病,发病率为80%;TG受体小鼠血清单独过继7只中无小鼠发病,而单独过继淋巴细胞8只中有4只发病,

关键词：三氯乙烯三氯乙烯药疹样皮炎 HLA-B*13:01 转基因小鼠小鼠疾病模型

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复杂疾病小鼠模型构建新策略：类精子单倍体胚胎干细胞介导的半克隆技术

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实验动物与比较医学 2021年第5期41卷 369-383页

作者：赖梭梅丁一夫李劲松中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)细胞生物学国家重点实验室中国科学院大学

类精子单倍体胚胎干细胞是源自小鼠孤雄囊胚中的一种新型单倍体胚胎干细胞,仅含有父源遗传物质,性染色体为X染色体,能在体外长期自我更新、增殖或诱导分化,并可以利用CRISPR系统进行单基因或多基因的编辑,能替代精子使卵母细胞受精。区... 详细信息

类精子单倍体胚胎干细胞是源自小鼠孤雄囊胚中的一种新型单倍体胚胎干细胞,仅含有父源遗传物质,性染色体为X染色体,能在体外长期自我更新、增殖或诱导分化,并可以利用CRISPR系统进行单基因或多基因的编辑,能替代精子使卵母细胞受精。区别于原核注射、卵胞质内注射获得嵌合体或利用四倍体补偿技术等传统构建基因修饰小鼠模型的方法,通过将基因编辑后的类精子单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞中,可以高效稳定地一步获得基因型确定的半克隆小鼠,不会存在嵌合现象,原代小鼠即可用于研究。基于类精子单倍体胚胎干细胞获得的多基因精准编辑的复杂疾病小鼠模型,可以在生物个体水平上阐述多个基因协同互作的效应,从而更充分地模拟复杂的、可能受多个基因影响的人类疾病的各种病理特征,以挖掘新的诊断和治疗方法。

关键词：单倍体类精子单倍体胚胎干细胞 CRISPR/Cas9 小鼠疾病模型

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类精子干细胞介导的遗传改造与应用

新兴科学和技术趋势

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新兴科学和技术趋势 2024年第1期3卷 1-8页

作者：李劲松上海科技大学生命科学与技术学院中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(原上海生物化学与细胞生物学研究所) 多细胞体系结构与功能重点实验室上海市分子男科学重点实验室

类精子干细胞是源自小鼠孤雄囊胚中的一种新型单倍体胚胎干细胞，仅含父源遗传物质，性染色体为X染色体，能在体外自我更新、增殖和诱导分化。类精子干细胞技术结合CRISPR/Cas9技术，通过卵子注射可高效稳定地获得基因型确定的半克隆小... 详细信息

类精子干细胞是源自小鼠孤雄囊胚中的一种新型单倍体胚胎干细胞，仅含父源遗传物质，性染色体为X染色体，能在体外自我更新、增殖和诱导分化。类精子干细胞技术结合CRISPR/Cas9技术，通过卵子注射可高效稳定地获得基因型确定的半克隆小鼠。类精子干细胞介导的遗传改造具有广泛的应用前景：高效建立动物模型，快速模拟复杂疾病，挖掘新的诊断和治疗方法；实现动物模型个体水平的靶向遗传筛选；推动基因组标签计划的规模化实施。

关键词：类精子干细胞半克隆技术小鼠疾病模型 CRISPR/Cas9 遗传改造基因组标签计划

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改造腺嘌呤脱氨酶TadA-8e开发精准高效的C-to-G碱基编辑器

改造腺嘌呤脱氨酶TadA-8e开发精准高效的C-to-G碱基编辑器

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作者：汝高盟华东师范大学

学位级别：硕士

已知人类遗传疾病中有超过一半的比例是由点突变导致的,因此开发能精确“改写”单碱基的工具对研究和治疗这类遗传疾病至关重要。单碱基编辑器的开发为其带来了希望,它主要由脱氨酶与Cas9缺口酶（nCas9）融合而成,其作用过程中不会直接... 详细信息

已知人类遗传疾病中有超过一半的比例是由点突变导致的,因此开发能精确“改写”单碱基的工具对研究和治疗这类遗传疾病至关重要。单碱基编辑器的开发为其带来了希望,它主要由脱氨酶与Cas9缺口酶（nCas9）融合而成,其作用过程中不会直接导致双链DNA断裂（DSB）,也不依赖于DNA修复模板,相对于同源重组的策略,能更加高效地在基因组DNA特定区域实现碱基转换。通过将天然的胞嘧啶脱氨酶（AID/APOBEC家族）与nCas9融合构建最初版本的CBE,通常会产生大量的C-to-G或C-to-A副产物。主要是因为胞嘧啶脱氨酶对C脱氨形成U,U:G错配会被尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）识别,将U切除形成AP位点,经过TLS聚合酶以及DNA复制过程,在部分基因组DNA位点中主要诱导C-to-G的碱基颠换,从而构建出一类新的碱基编辑器—CGBE。基于天然胞嘧啶脱氨酶开发的CGBEs具有广泛的应用前景,但同时它们会产生较高比率的DSB而导致小片段插入缺失（indels）产物、旁观者编辑以及Cas9非依赖的DNA和RNA水平脱靶编辑。相反,ABE使用一种非天然的腺嘌呤脱氨酶,由大肠杆菌中的TadA进化而来催化单链DNA中的腺嘌呤脱氨,实现高效和高纯度（超过99.9%）的A-to-G碱基转换且引起较少indels的产生。最近的研究表明,ABEs还可以诱导TC*N基序中的胞嘧啶编辑,活性更高的ABE8e显示出增强的胞嘧啶脱氨酶活性,这说明进化后的TadA不仅可以作用双环的腺嘌呤,也可以对单环的胞嘧啶进行脱氨催化。因此我们设想有可能通过对TadA的改造,缩小催化活性口袋,只让更小体积的胞嘧啶进入,从而构建一种全新的非天然胞嘧啶脱氨酶来源的碱基编辑器实现C-to-G的颠换。本课题主要针对活性最高的TadA-8e进行改造。首先,我们在可能影响TadA-8e与底物DNA作用的口袋附近,选取14个潜在氨基酸位点,构建31个候选变体进行测试,在TadA-8e中引入N46L变体可以消除其腺嘌呤脱氨酶活性,并导致TadA-8e衍生的C-to-G碱基编辑器（Td-CGBE）催化C·G-to-G·C颠换。通过大量内源性靶点评价,表征Td-CGBE催化活性与经典的CGBE1相当,最高效率达72.8%,但是产生的indels频率减少了2倍且更加精准靶向C5/C6位（窗口缩窄至1-2nt）。接着,我们基于Cas9-dependent/independent和RNA-seq全面的脱靶评价,与目前经典的CGBEs工具对比,发现Td-CGBE的脱靶均降低至本底水平,为精准基因治疗提供强有力的技术平台支持。最后,我们利用Td-CGBE成功制备白化病小鼠模型,在小鼠Tyr基因S184位点产生提前终止密码子,在21只F0代小鼠中观察到了白化表型,共计14只产生目的位点C-to-G颠换,平均效率为36%,最高效率达到85%。此外,我们还通过在致病性多聚胞嘧啶序列中生成或纠正疾病相关细胞系模型,明确Td-CGBE在精准治疗和其他应用中的可行性。综上所述,本课题提供了一种突破性的碱基编辑工具改造概念,发现影响TadA底物选择的关键变体N46L,破坏其固有的腺嘌呤脱氨酶活性,同时显著提高胞嘧啶的编辑,一定程度上克服了天然脱氨酶的缺陷,创新性地开发了一款不依赖AID/APOBEC脱氨酶家族的新型C-to-G编辑器——Td-CGBE。与经典的CGBEs相比,Td-CGBE产生最少的indels产物、具有精准的编辑窗口、极大降低DNA和RNA水平脱靶编辑,丰富了碱基编辑技术的工具箱,也为蛋白质进化工程提供全新思路。

关键词：腺嘌呤碱基编辑器胞嘧啶碱基编辑器编辑窗口脱靶评估小鼠疾病模型

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自身免疫性视网膜病变小鼠模型的建立及评价

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眼科 2023年第2期32卷 142-147页

作者：刘谦周健武珅张子俊张敬学曾惠阳首都医科大学附属北京同仁医院、北京同仁眼科中心、北京市眼科研究所、眼科学与视觉科学北京市重点实验室 100730

目的诱导自身免疫性视网膜病变(AIR)小鼠模型,对其发生过程、病理及功能特征进行评价。设计实验研究。研究对象18只7~9周鼠龄C57BL/6J小鼠用于诱导AIR发生;同龄同种小鼠6只设立为对照组。方法用完全弗氏佐剂(CFA)乳化的小鼠重组恢复蛋白... 详细信息

目的诱导自身免疫性视网膜病变(AIR)小鼠模型,对其发生过程、病理及功能特征进行评价。设计实验研究。研究对象18只7~9周鼠龄C57BL/6J小鼠用于诱导AIR发生;同龄同种小鼠6只设立为对照组。方法用完全弗氏佐剂(CFA)乳化的小鼠重组恢复蛋白(recoverin)(CFA-recoverin)免疫小鼠作为诱导组,用CFA-PBS注射小鼠作为对照组。在免疫后的第0天和第2天注射百日咳毒素(PTX)破坏血-视网膜屏障。利用蛋白印迹法分析、多模态影像检测及组织病理学方法评价造模指标。主要指标诱导后3、6、8周小鼠血清recoverin抗体的表达、裂隙灯检查、彩色眼底照相、OCT、FFA或视网膜电图(ERG)的表现及视网膜组织学染色特征。结果诱导组小鼠在第3周出现血清recoverin抗体阳性;第6周抗体表达明显增加并开始出现双眼少量视网膜黄白色病灶,OCT示外层视网膜轻度受损;第8周视网膜浸润灶明显扩大,OCT显示外层视网膜连续性明显破坏。第8周FFA显示病灶区视网膜下明显荧光渗漏;ERG示视杆及视锥反应波振幅显著降低。第6周及第8周病理学显示不同程度外层视网膜结构破坏及炎性细胞浸润。结论重组recoverin蛋白皮下注射可成功诱导小鼠AIR发生,其眼部表现及病理学特征与AIR患者大致相似,是进行AIR研究的良好工具。

关键词：自身免疫性视网膜病变小鼠疾病模型抗恢复蛋白抗体抗视网膜抗体

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Y染色体AZFc区段设计合成及功能研究

Y染色体AZFc区段设计合成及功能研究

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作者：崔有志天津大学

学位级别：博士

合成生物学对基因序列的重新设计与合成,有助于以“自下而上”的方法探索DNA序列与人类遗传疾病发生的关系,推动基因组医学的发展。对染色体缺失大片段的功能解析是基因组医学的潜在需求之一。人类Y染色体AZFc区序列长度约3.5 Mb,该区... 详细信息

合成生物学对基因序列的重新设计与合成,有助于以“自下而上”的方法探索DNA序列与人类遗传疾病发生的关系,推动基因组医学的发展。对染色体缺失大片段的功能解析是基因组医学的潜在需求之一。人类Y染色体AZFc区序列长度约3.5 Mb,该区域的缺失被认为是导致男性非梗阻性无精症最常见的病因,其中该区段内DAZ基因的缺失是导致男性不育的关键因子。由于AZFc区相对较长且富含重复和回文序列,难以通过传统克隆技术获得该区段序列,因此针对AZFc区开展的功能研究十分有限。本研究主要对人类Y染色体AZFc区DAZ2基因和两段非编码序列进行设计、合成和功能测试。 DAZ2基因富含重复序列,设计原则设定与序列合成难度较高。本研究采用氨基酸密码子同义替换原则以及基于序列特征的拆分组装策略,对长度约85.2 kb的DAZ2序列进行设计与组装。首先,根据氨基酸密码子同义替换原则,对DAZ2序列内33处碱基进行替换,并作为“人工水印”与天然序列区分。其次,根据DAZ2序列不同区段具有不同组装难度的特征,建立了拆分组装策略:DAZ2序列中富含重复序列的复杂合成区段采用T4连接法和Golden Gate组装法进行组装,而常规序列采用酿酒酵母DNA assembler法进行组装,最后通过DNA assembler法组装全长的DAZ2序列（Synthetic DAZ2,Syn-DAZ2）,组装效率为1/200。最后,经Sanger测序、二代和三代高通量测序确认Syn-DAZ2序列内含子区域存在3处碱基突变和1处碱基缺失。针对验证DAZ家族基因DAZ2能否替换小鼠DAZL功能问题,本研究将Syn-DAZ2转入不同细胞系中验证表达后,进一步构建Syn-DAZ2转基因小鼠模型研究Syn-DAZ2与DAZL的功能保守性。首先,将Syn-DAZ2转入F9细胞和HEK293T细胞中验证表达,结果表明Syn-DAZ2在不同细胞系中均表达DAZ2蛋白,并与传统DAZ2 c DNA质粒表达的DAZ2蛋白存在分子量的差异。然后,采用Syn-DAZ2构建Tg（DAZ2）DAZL-/-小鼠模型研究DAZ2与小鼠DAZL的功能保守性,然而未发现Syn-DAZ2挽救小鼠的无精症表型,未发现Syn-DAZ2代替小鼠DAZL的功能。本研究构建的Syn-DAZ2和DAZ2 c DNA回补的DAZL-/-小鼠模型睾丸组织内均无生殖细胞,与DAZL-/-小鼠表型一致,因此推测DAZ2与小鼠DAZL在生殖细胞分化中可能具有不同的功能。为了研究合成基因组序列与酿酒酵母底盘的相互影响,本研究设计与合成了位于AZFc区长度分别为500 kb和750 kb的非编码序列并采用转录组测序测试了500 kb非编码序列在酿酒酵母中的转录情况。首先,采取序列不变原则使用酿酒酵母DNA assembler法组装了AZFc区长度分别为500 kb和750 kb的非编码序列。其次,进一步构建了转录因子TBP（TATA-binding Protein,TBP）人源化酵母转录底盘,使用RNA-seq和全长转录组测序对长度为500 kb（chr Y:23,542,842-24,041,142,GRCh38.p13）的非编码序列转录进行测试。通过与对照酵母对比发现,合成的500 kb非编码序列在酿酒酵母细胞中存在3,099个转录本,表明人源非编码序列在酵母细胞内进行大量的转录。此外,高效操纵大片段DNA是合成生物学的重要基础,但复杂大片段DNA获取效率低是当前的技术瓶颈。本研究开发了基于噬菌体N15中Tel N/tos系统的大片段DNA组装DATE法（DNA assembly using Tel N/tos system in vitro）和基因组序列克隆技术TAPE（The Tel N/tos-assisted precise targeting of chromosome segments）。由噬菌体N15中Tel N/tos系统启发,采用线性质粒载体进行大片段DNA的组装和基因组序列的克隆。由于线性质粒载体更容易与DNA片段两端连接并避免产生线性和环形DNA串联体,同时不需要DNA环化过程,因此提高了组装和克隆效率。使用DATE法将4个10 kb DNA片段组装至40 kb的酵母基因组序列时,相较于使用传统环形质粒载体,组装效率从44%提升至83%。使用TAPE法靶向克隆基因组序列时,成功一步克隆长达156 kb的大肠杆菌基因组序列,效率为5.5%～11.5%。本研究开发了复杂序列设计拆分、大片段DNA合成组装、基因组序列抓取等合成基因组学关键技术,合成了AZFc区长度为85.2 kb的DAZ2基因和两段长度分别为500 kb和750 kb的基因组序列。并且,本研究对合成的DAZ2开展了基因功能研究,建立了多个

关键词：合成生物学 Y染色体AZFc区 DAZ2 非编码序列小鼠疾病模型大片段DNA组装

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咖啡酸同时防治动脉粥样硬化及阿尔茨海默氏症的功效机制研究

咖啡酸同时防治动脉粥样硬化及阿尔茨海默氏症的功效机制研究

引用

作者：武涛齐鲁工业大学

学位级别：硕士

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）和阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease,AD）是威胁人类健康的两大杀手疾病。尤其随着社会老龄化趋势,前者继发导致的心梗和脑卒中及以后者为主要病因的早老性痴呆,给家庭和社会带来了沉重负担... 详细信息

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）和阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease,AD）是威胁人类健康的两大杀手疾病。尤其随着社会老龄化趋势,前者继发导致的心梗和脑卒中及以后者为主要病因的早老性痴呆,给家庭和社会带来了沉重负担。近年最新研究发现动脉粥样硬化亦是阿尔茨海默氏病的重要病理因素,通过影响脑部脂质代谢平衡和引发慢性炎症助力老年痴呆的发生发展。因此,本论文以此为切入点,结合实验室前期研究基础,通过疾病模型小鼠及生化细胞实验探索了天然多酚类化合物咖啡酸（Caffeic acid,CA）是否能够同时防治动脉粥样硬化症及阿尔茨海默症的发生发展,并对机制进行了较深入的研究。另外,以胆固醇外排等细胞模型实验筛选了包括珍珠透骨草在内的一批中草药,对更多具有脑心同治作用对天然产物进行了初步探索。本论文分为四部分。第一部分首先研究了咖啡酸对动脉粥样硬化的防治作用。采用雌性Apo E-/-小鼠,正常饲料饲养至20周龄后随机分组,以20 mg/kg咖啡酸隔天腹腔注射治疗8周。通过分离完整动脉（En face）苏丹IV染色及制备心脏冰冻切片染色,发现咖啡酸治疗显著抑制了动脉血管壁及心脏动脉弓处的脂质粥样斑块数量和面积,并显著减轻了巨噬细胞的侵润。血液指标分析发现咖啡酸治疗对血液总胆固醇、甘油三酯及血糖无显著影响,但显著增加血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）含量,降低血清促炎性细胞因子MCP-1及IL-6水平,且LDH等肝毒性指标提示治疗无明显毒副作用。第二部分进一步对上述小鼠的老年痴呆症状及咖啡酸的防治作用进行了分析。通过Morris水迷宫和Y迷宫等行为学实验,发现27-28周龄模型小鼠相比同龄野生型小鼠表现出显著的认知记忆衰退,而咖啡酸治疗显著改善了这些衰退症状。进一步对小鼠脑部制备匀浆及冰冻切片,通过免疫组化/荧光和q PCR,发现咖啡酸治疗显著降低了脑海马区的β淀粉样蛋白沉淀聚集,上调了主要促进脂质外排的转运蛋白ABCA1和ABCG1的转录水平。炎症指标方面,与第一部分结果相符,CA治疗抑制了脑部星型胶质细胞的活化,并降低脑组织中IL-6等促炎性细胞因子的转录水平。第三部分,基于上述实验结果,进一步以生化细胞模型验证、解析了咖啡酸的作用机制。发现咖啡酸除具有良好的自由基清除能力,可以抑制低密度脂蛋白氧化从而获得免疫活性外,最关键的是通过抑制细胞脂质内吞、促进脂质外排（efflux）,从而抑制巨噬细胞的泡沫化转变这一动脉粥样硬化的核心病理因素,并保护巨噬细胞、神经细胞、血管内皮细胞,抑制炎症的发生发展。第四部分,作为对实验室脑心疾病共治天然产物药物研究工作的承上启下,以上述研究中关键的胆固醇外流模型作为功效筛选及活性追踪手段,筛选了一批中草药,发现珍珠透骨草的石油醚提取物具有潜在的抗脂质代谢紊乱相关疾病作用,并对其成分进行了初步的分析。综上,本研究从动脉粥样硬化症与阿尔茨海默症存在密切联系这一新方向出发,发现咖啡酸通过调节脂质稳态和抑制炎症发展,发挥同时防治模型小鼠动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病的功效,并对更多具有脑心同治潜力的中草药进行了初步筛选,为后续脑心同治药物研发和脂质代谢异常导致的老年疾病的治疗提供了新的思路和实验基础。

关键词：动脉粥样硬化天然产物阿尔茨海默氏病脂质外排小鼠疾病模型

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TRPV4基因新型突变转基因小鼠的功能分析

TRPV4基因新型突变转基因小鼠的功能分析

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作者：杨炬华大理大学

学位级别：硕士

目的:本研究基于发现有一例携带瞬时感受电位香草酸家族4通道蛋白（Transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV 4）基因新型c.2479 C>G（p.P827A）杂合突变患Kozlowski型脊椎干骺端发育不良（Spondylometaphyseal dysplasia-Kozlowski type,SMD-K）的患儿。本研究采用基因编辑构建转基因小鼠,在动物模型中通过测量生理指标,应用组织病理技术以及Micro-CT等实验方法,进一步验证该突变的致病性,同时探讨该突变致SMD-K的发病机理,为该病的诊治提供新的思路和方法。方法:1、采用CRISPR/Cas9技术,引入TRPV 4基因c.2479 C>G（p.P827A）杂合突变,建立TRPV 4杂合突变型小鼠模型,并通过采用杂合子与杂合子交配的繁殖策略进行繁育,计算野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠的出生率;2、观察和对比野生型、杂合突变型以及纯合突变型出生第1天（Postnatal day1,P 1）小鼠、3月龄小鼠、6月龄小鼠以及9月龄小鼠的外观;3、从1月龄的小鼠开始,每隔1个月测量小鼠的体重和身长,对比野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠的体重和身长;4、通过阿尔新蓝染色观测和对比野生型、杂合突变型以及纯合突变型P 1小鼠骨架和股骨钙化骨长度;通过HE染色和Safranin O染色法分别观测和对比野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠膝关节和脊柱的组织学结构;5、通过Micro-CT扫描重建和分析,观察和对比野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠的脊柱外观以及骨参数。结果:1、纯合突变型P 1小鼠出生时死亡,其出生率（3.7%）远远低于理论出生率（25%）;2、纯合突变型P 1小鼠的骨架均小于野生型和杂合突变型P 1小鼠的骨架,未发现骨骼畸形表现,表现生长发育迟缓;3、杂合突变型小鼠的体重和身长与野生型小鼠的体重和身长比较,只有3月龄杂合突变型雄鼠的体重（23.99±1.22g）大于野生型雄鼠的体重（22.75±1.47g）,差异有统计学意义（P<0.05）;4、与野生型小鼠比较,3月龄、6月龄以及9月龄杂合突变型小鼠的膝关节和脊柱的组织学结构未见明显异常;5、与野生型小鼠比较,3月龄、6月龄以及9月龄杂合突变型小鼠的第13节胸椎和第一腰椎的外观以及第13节胸椎的骨参数未见异常。结论:1、TRPV 4P827A纯合突变小鼠致死,其骨骼系统表现出生长发育迟缓,提示该突变的致病性。2、与野生型小鼠比较,TRPV 4P827A杂合突变小鼠骨骼系统生长发育差异不明显。

关键词：瞬时感受电位香草酸家族4通道蛋白 Kozlowski型脊椎干骺端发育不良小鼠疾病模型致病性

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