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脂多糖通过Galectin-9/Tim-3信号通路调控小鼠巨噬细胞M1/M2表型极化

中华危重病急救医学 2018年第9期30卷 836-841页

作者：张望章云涛方强浙江大学医学院附属第一医院重症医学科浙江杭州310003

目的探讨半乳糖凝集素- /T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（Galectin-/Tim-3）信号通路在脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞M/2表型极化中的意义及分子机制。方法体外培养小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7，待细胞生长至80%~90%时用于实验。①将细胞以无... 详细信息

目的探讨半乳糖凝集素- /T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（Galectin-/Tim-3）信号通路在脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞M/2表型极化中的意义及分子机制。方法体外培养小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7，待细胞生长至80%~90%时用于实验。①将细胞以无血清DMEM培养基培养，并分别以0（空白对照）、0.01、0.1、1、10、100 m/的LPS刺激24 h。采用荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）或蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测巨噬细胞M1型标志物白细胞介素- 6（IL-6）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和M2型标志物精氨酸酶-1（Arg-1）、白细胞分化抗原206（CD206）以及细胞内Tim-3、Galectin-9的表达。②另取小鼠腹腔巨噬细胞，并分为空白对照组（用无血清DMEM培养基培养24 h）、LPS处理组（用含0.1 m/的LPS无血清DMEM刺激24 h）和α-乳糖预处理组（在LPS刺激前1 h用含40 μmo/ Galectin-9信号拮抗剂α-乳糖的无血清DMEM进行预处理），通过封闭Galectin-9信号以验证Galectin-9在巨噬细胞M/2表型极化中的作用。结果①低浓度LPS（0.01 m/、0.1 m/）刺激24 h后，巨噬细胞M1型标志物的表达仅轻度上调（iNOS mRNA）或无明显变化（IL-6 mRNA）；而M2型标志物Arg-1 mRNA和CD206 mRNA表达则明显升高，并分别于0.1 m/和0.01 m/的LPS浓度下达到峰值〔与空白对照组比较：Arg-1 mRNA（2-ΔΔCt）为1.85±0.07比1.00±0.02，CD206 mRNA（2-ΔΔCt）为2.03±0.11比1.00±0.05，均P〈0.01〕；随LPS浓度升高，IL-6 mRNA和iNOS mRNA表达持续升高，而Arg-1 mRNA和CD206 mRNA表达则逐渐降低，巨噬细胞M/2表型极化状态发生改变。同时，经LPS刺激后，巨噬细胞内Tim-3蛋白表达在0.01 m/的LPS刺激后即较空白对照组明显上调（Tim-/APDH：0.84±0.04比0.69±0.02，P〈0.01），并在0.1 m/浓度下达峰值，之后随LPS浓度升高而逐渐下降；细胞内Galectin-9及上清中分泌型Galectin-9（s-Galectin-9）蛋白表达在低浓度LPS（0.01 m/、0.1 m/）刺激后无明显变化，之后随LPS浓度升高而逐渐降低。②与空白对照组相比，LPS处理组M1型标志物iNOS和M2型标志物Arg-1、CD206的mRNA表达均明显升高，而IL-6 mRNA表达无明显变化。使用α-乳糖预处理后，IL-6 mRNA和iNOS mRNA表达较LPS处理组进一步升高〔IL-6 mRNA（2-ΔΔCt）：1.44±0.02比1.14±0.11，iNOS mRNA（2-ΔΔCt）：2.45±0.04比2.01±0.08，均P〈0.01〕，而Arg-1 mRNA和CD206 mRNA表达明显下降〔Arg-1 mRNA（2-ΔΔCt）：0.75±0.01比1.85±0.02，CD206 mRNA（2-ΔΔCt）：0.58±0.02比2.03±0.14，均P〈0.01〕。同时，Galectin-9信号封闭也可减少Galectin-9胞外分泌〔与LPS处理组比较：s-Galectin-/APDH为0.10±0.01比0.23±0.02，P〈0.01〕，下调胞内Tim-3和Galectin-9的蛋白表达（Tim-/APDH：0.28±0.01比0.43±0.01，Galectin-/APDH：0.21±0.01比0.43±0.01，均P〈0.01）。结论LPS通过Galectin-/Tim-3信号通路调控巨噬细胞M/2表型极化，低浓度LPS可通过调节Galectin-9表达及分泌使巨噬细胞向M2表型极化，从而限制炎症发展；高浓度LPS通过下调Galectin-9的表达和分泌使巨噬细胞向M1表型极化，从而促进炎症发展。

关键词：半乳糖凝集素-9 T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3 脂多糖巨噬细胞表型极化

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芪参益气滴丸联合间充质干细胞外泌体改善心肌缺血能量代谢及炎性环境的相关研究

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辽宁中医杂志 2025年

作者：秦伟彬刘善萍詹玲君林琳苏运玉黎燕王萌宋惠杨斐斐唐伟智何贵新广西中医药大学第一附属医院广西中医药大学

目的：芪参益气滴丸联合间充质干细胞外泌体改善急性心肌梗死后心肌缺血能量代谢及炎性环境的机制研究。方法：C57BL/6小鼠随机分为5组：假手术组（sham)、模型组(I/R）、模型+Exosome组（I/R+Exo）、模型+中药组（I/R+QSYQ）、模型+中... 详细信息

目的：芪参益气滴丸联合间充质干细胞外泌体改善急性心肌梗死后心肌缺血能量代谢及炎性环境的机制研究。方法：C57BL/6小鼠随机分为5组：假手术组（sham)、模型组(I/R）、模型+Exosome组（I/R+Exo）、模型+中药组（I/R+QSYQ）、模型+中药+ Exosome组（I/R+QSYQ+Exo），并采用结扎冠状动脉前降支（LAD）的方法构建小鼠急性心肌梗死后心肌缺血模型。进行骨髓间充质干细胞外泌体提取和鉴定，实验小鼠按照不同组别进行骨髓间充质干细胞外泌体及芪参益气滴丸的干预，持续干预2周。实验过程中主要采用EVan's Blue染色评估心肌缺血程度、TTC染色评估心肌梗死面积、TUNEL染色评估心肌细胞的凋亡，生化试剂盒检测心肌组织中的ATP、ADP、NADH和NAD+4个指标估心肌细胞能量代谢水平，免疫荧光染色评估巨噬细胞表型，采用q-PCR检测各组心肌组织中的TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6等炎症指标水平。结果：运用外泌体处理、芪参益气滴丸处理、芪参益气滴丸与外泌体联用三组均能促使小鼠心肌缺血组织血流恢复，芪参益气滴丸与外泌体联用处理组改善心肌梗死面积疗效显著，且外泌体和芪参益气滴丸处理后，心肌细胞凋亡明显减少。外泌体、芪参益气滴丸中药均显著抑制心肌组织中的M1型巨噬细胞，促进M2型巨噬细胞。在使用外泌体、芪参益气滴丸处理后，心肌细胞能量代谢得到一定程度的恢复，芪参益气滴丸联合外泌体组能更进一步促进了IL-1β、IL-6的表达，TNF-α在外泌体组、芪参益气滴丸+外泌体联用组均可见升高。对于抑炎因子IL-10，外泌体和芪参益气滴丸+外泌体联用组显著促进了IL-10的表达。结论：在心肌急性缺血后，芪参益气滴丸联合外泌体能显著抑制心肌组织中的M1型巨噬细胞，促进M2型巨噬细胞，促进抑炎因子表达，最终恢复心肌细胞能量代谢，促使小鼠心肌缺血组织血流恢复、改善心肌梗死面积疗、减少心肌细胞凋亡。

关键词：间充质干细胞外泌体巨噬细胞表型芪参益气滴丸能量代谢炎性环境

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小檗碱促进巨噬细胞系RAW264.7由M1促炎表型向M2抗炎表型极化

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基础医学与临床 2019年第5期39卷 646-651页

作者：王青竹石婧刘琴杨黎星郭磊叶菜英张德昌中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院药理系北京100005

目的探讨小檗碱(BBR)对巨噬细胞系RAW264.7极化分型的影响。方法将RAW264.7细胞分为对照组、高脂和炎性反应模型组(以100μg/L脂多糖和100μg/L聚合型低密度脂蛋白刺激)和小檗碱低、中、高浓度(5、10、20μmol/L)处理组。用ELISA和流式... 详细信息

目的探讨小檗碱(BBR)对巨噬细胞系RAW264.7极化分型的影响。方法将RAW264.7细胞分为对照组、高脂和炎性反应模型组(以100μg/L脂多糖和100μg/L聚合型低密度脂蛋白刺激)和小檗碱低、中、高浓度(5、10、20μmol/L)处理组。用ELISA和流式细胞计量术检测RAW264.7两种极化分型(M1型和M2型)相关标志物TNF-α、MCP-1、CD86、IL-4、IL-13、TGF-β1和CD206的表达,以观察细胞极化。用Western blot和RT-qPCR检测载脂蛋白E(apoE)、极低密度脂蛋白受体(VLDLR)或载脂蛋白E受体2(apoER2)的表达。结果 BBR引起M1型巨噬细胞相应标志物TNF-α、MCP-1和CD86表达减少(P<0.05); M2型巨噬细胞相应标志物IL-4、TGF-β1和CD206表达增加。同时也能够促进RAW264.7细胞内apoE的蛋白表达和VLDLR的mRNA表达(P<0.001)。结论 BBR可能促进apoE与VLDLR的结合,进而诱导RAW264.7从M1促炎表型向M2抗炎表型极化。

关键词：小檗碱巨噬细胞表型炎性反应载脂蛋白

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丙戊酸和氢气对缺氧小胶质细胞表型的影响

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中国医科大学学报 2017年第1期46卷 36-40页

作者：吴曦子曾仁庆赵洋子常盼盼范晨玲王红崇巍中国医科大学附属第一医院急诊科沈阳110001 中国医科大学附属第一医院神经外科沈阳110001 中国医科大学附属第一医院内分泌科沈阳110001

目的研究丙戊酸(VPA)和氢气(H2)对缺氧小胶质细胞表型的影响。方法对缺氧BV2小胶质细胞分别给予VPA和H2处理后,收集上清和细胞团,应用ELISA、流式细胞术和实时PCR技术检测表型标志物。结果与对照组相比,缺氧增加BV2细胞M1型表型标志物m ... 详细信息

目的研究丙戊酸(VPA)和氢气(H2)对缺氧小胶质细胞表型的影响。方法对缺氧BV2小胶质细胞分别给予VPA和H2处理后,收集上清和细胞团,应用ELISA、流式细胞术和实时PCR技术检测表型标志物。结果与对照组相比,缺氧增加BV2细胞M1型表型标志物m RNA(i NOS)的表达,降低M2型表型标志物m RNA(CD206、TGF-β)的表达,使M1型和M2型表型标志物m RNA的比值(CD16∶CD206、i NOS∶CD206、i NOS∶TGF-β)升高(P<0.05)。与缺氧组相比,VPA降低缺氧BV2的M1型表型标志物蛋白(CD16/32)和m RNA(i NOS)的表达,使M1型和M2型表型标志物m RNA的比值(CD16∶CD206、CD32∶CD206、i NOS∶CD206、i NOS∶TGF-β)降低(P<0.05)。与缺氧组相比,H2降低缺氧BV2的M1型表型标志物蛋白(TNF-α、CD16/32、i NOS)和m RNA(i NOS)的表达,升高M2型表型标志物蛋白(IL-10)和m RNA(CD206、TGF-β)的表达,使M1型和M2型表型标志物m RNA的比值(CD16∶CD206、i NOS∶CD206、i NOS∶TGF-β)降低(P<0.05)。结论缺氧使小胶质细胞向促炎表型转化;VPA和H2均可抑制缺氧对小胶质细胞的促炎作用。

关键词：缺氧小胶质细胞氢气丙戊酸巨噬细胞表型

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脱细胞软骨基质对巨噬细胞极化的调控

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中国组织工程研究 2021年第22期25卷 3545-3550页

作者：田广招杨振查康康孙志强李旭眭翔黄靖香郭全义刘舒云解放军医学院北京市100853 中国人民解放军第一医学中心骨科研究所骨科再生医学北京市重点实验室全军骨科战创伤重点实验室北京市100853 南开大学医学院天津市300071

背景:细胞外基质来源的生物材料在组织工程再生领域应用广泛,近年来生物材料对巨噬细胞表型极化作用受到极大关注。目的:探究脱细胞软骨基质(decellularized cartilage extracellular matrix,DCM)及胃蛋白酶处理脱细胞软骨基质(pepsin t... 详细信息

背景:细胞外基质来源的生物材料在组织工程再生领域应用广泛,近年来生物材料对巨噬细胞表型极化作用受到极大关注。目的:探究脱细胞软骨基质(decellularized cartilage extracellular matrix,DCM)及胃蛋白酶处理脱细胞软骨基质(pepsin treated decellularized cartilage extracellular matrix,PDCM)对巨噬细胞表型极化的调控作用。方法:采用物理粉碎、反复冻融及差速离心方法制备猪关节软骨脱细胞软骨基质(DCM),溶解于胃蛋白酶溶液内得到其生物降解产物(PDCM)。将小鼠巨噬细胞系RAW264.7分5组培养:对照组加入巨噬细胞完全培养基,M1型阳性对照组加入含脂多糖+干扰素γ的完全培养基,M2型阳性对照组加入含白细胞介素4的完全培养基,PDCM组加入含PDCM的完全培养基,胃蛋白酶组加入含胃蛋白酶的完全培养基,培养18 h后进行CD86(M1型巨噬细胞)、CD206(M2型巨噬细胞)免疫荧光染色鉴定。另外将小鼠巨噬细胞系RAW264.7分6组培养:对照组、M1型阳性对照组、M2型阳性对照组、胃蛋白酶组、DCM涂布组与PDCM涂布组,培养24 h后进行CD86、CD206流式细胞术检测。结果与结论:①免疫荧光结果显示,PDCM组诱导巨噬细胞CD86表达阳性比约为0.13,诱导巨噬细胞CD206表达阳性比约为0.5;②流式细胞术检测结果显示,DCM诱导巨噬细胞表达CD86(20.1%)及CD206(28.8%),PDCM只诱导巨噬细胞表达CD206(23.2%);③结果表明,DCM及其生物降解产物PDCM具有促进巨噬细胞M2型极化的作用。

关键词：软骨材料组织工程脱细胞软骨基质巨噬细胞极化巨噬细胞表型

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内皮高表达脂多糖相关因子1抑制巨噬细胞炎症反应

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免疫学杂志 2022年第6期38卷 530-534页

作者：冷蔚玲雷小添张星潘航陈刘梁自文陆军军医大学第一附属医院内分泌科重庆400038

目的本实验旨在观察内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)对巨噬细胞炎症反应的影响及可能机制。方法培养小鼠巨噬细胞,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激激活炎症信号通路,检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和EOLA1转录水平变化,采用化学阻断剂在不同位点阻断炎症反应信号通路,再检测TNF-α、IL-6和EOLA1转录变化。巨噬细胞过表达mEOLA1,RT-qPCR检测细胞M1、M2极化类型标志基因mRNA水平,以流式细胞术检测巨噬细胞表型改变,Western blot检测M1型巨噬细胞标记物iNOS表达。结果LPS刺激后巨噬细胞释放炎症因子TNF-α、IL-6增加,而EOLA1表达下调;不同位点阻断炎症反应信号通路后炎症介质的表达明显受抑制,而EOLA1的表达上升;在巨噬细胞中高表达EOLA1,再行LPS刺激,检测到TNF-α、IL-6增加并不明显,流式细胞检测显示高表达EOLA1的巨噬细胞在LPS刺激后仍保持非炎症极化的M2型,细胞表达iNOS下降。结论EOLA1具有负调节巨噬细胞炎症相关通路活化的作用,其表达增加可以促进巨噬细胞从促炎症的M1型向促愈合的M2型转变,减少局部炎症程度。

关键词： EOLA1 巨噬细胞表型炎症反应信号通路

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缓释Ⅵ型胶原诱导巨噬细胞极化促进大鼠坐骨神经缺损再生的应用研究

缓释Ⅵ型胶原诱导巨噬细胞极化促进大鼠坐骨神经缺损再生的应用研...

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作者：吕丹天津医科大学

学位级别：博士

目的:（1）Fmoc固相合成法合成RADA16-I自组装多肽,质谱鉴定并对其理化性质进行表征。静电纺丝制备PCL神经导管及对其力学性能进行测定。（2）采用RADA16-I自组装水凝胶包裹缓释Ⅵ型胶原,观察其在体外的释放曲线。采用Ⅵ型胶原诱导极化... 详细信息

目的:（1）Fmoc固相合成法合成RADA16-I自组装多肽,质谱鉴定并对其理化性质进行表征。静电纺丝制备PCL神经导管及对其力学性能进行测定。（2）采用RADA16-I自组装水凝胶包裹缓释Ⅵ型胶原,观察其在体外的释放曲线。采用Ⅵ型胶原诱导极化巨噬细胞,观察其体外极化巨噬细胞的效果。采用共培养模型,研究极化后的巨噬细胞对雪旺细胞增殖及功能的影响。（3）探讨RADA16-I自组装水凝胶包裹缓释Ⅵ型胶原填充PCL神经导管修复长节段大鼠坐骨神经缺损的效果。方法:（1）采用Fmoc固相合成法合成RADA16-I自组装多肽。采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对合成的多肽进行纯化。采用1H NMR核磁共振对合成及纯化后的小分子化合物RADA16-I进行表征。红外光谱检测化合物的红外吸收。透射电镜观察水凝胶纤维形貌。自组装水凝胶的流变性质采用流变仪进行检测。静电纺丝制备PCL神经导管,扫描电镜对PCL导管进行观察及测量纤维丝平均直径,改良比重法测量孔隙率并用小量程力学拉伸测量仪对其应力-应变曲线进行测定,计算杨氏模量、最大应力、最大载荷和最大断裂张力。（2）制备含有0.1%Ⅵ型胶原与1%RADA16-I混合液,室温静置以后制得混合水凝胶。取25ul的水凝胶填充于PCL支架中,置入PBS中,于0.5、1、2、3、4、5、6、7、14、28、56天时间点分别收集培养孔的上清液。采用ELISA法检测Ⅵ型胶原累积释放比率。分离、纯化、鉴定雪旺细胞。将大鼠RAW264.7巨噬细胞接种在24孔板中,每孔加入含0.1%Ⅵ型胶原的RPMI1640低糖培养基,培养及干预72小时后,采用CD68、CCR7、iNOS、CD206和CD163鉴定巨噬细胞相关表型。将Ⅵ型胶原诱导巨噬细胞极化后的培养液与新鲜的DMEM/F12培养基以1:1的比例混合,进行雪旺细胞的培养,建立不同极化状态巨噬细胞与雪旺细胞共培养模型,干预5天后用CCK-8检测雪旺细胞增殖。采用RT-PCR检测共培养条件下对雪旺细胞GDNF、NGF、NT3和MBP mRNA的表达。（3）制备含有0.1%Ⅵ型胶原与1%RADA16-I的混合水凝胶,填充17mm PCL神经导管并桥接大鼠坐骨神经15mm长节段缺损。采用单纯RADA16-I水凝胶填充PCL导管和自体神经移植作为参照。术后第3、14天时,免疫荧光染色显示巨噬细胞分化情况。在术后4、8、12周时,采用坐骨神经指数、电生理检测、免疫荧光、再生神经及肌肉形态学分析评估大鼠神经再生效果。结果:（1）RADA16-I的出品率为85.6%,RADA16-I自组装多肽形成水凝胶后,红外光谱峰值发生位移,以离子键互补的方式形成水凝胶。RADA16-I浓度的提高,其成胶的温度上升。RADA16-I浓度提高,成胶pH值有所上升。（2）Ⅵ型胶原释放的周期很长,长达56天。但在前6天时其释放比率较大,0.5 days:32.3±3.1%;1 days:38.2±4.1%;2 days:43.1±3.8%;3 days:47.8±5.7%;4 days:52.5±6.1%;5 days:56.0±5.2%;6 days:62.2±4.5%。在第6天到第56天之间,其释放逐渐放缓,7 days:65.1±5.3%;14 days:71.6±5.0%;28 days:78.8±4.1%;56days:98.7±0.8%。S100和Sox10荧光双标染色鉴定雪旺细胞纯度高达96.3%。经过VI型胶原72h的诱导极化后,M2型巨噬细胞所占CD68+细胞比例高达55.2%。Ⅵ型胶原极化组共培养模型下的雪旺细胞增殖在培养第3、5天时均显著高于对照组（P<0.05）。极化后的巨噬细胞培养液能够显著的促进雪旺细胞高表达GDNF、NGF、NT3和MBP mRNA,均显著高于对照组（P<0.05）。（3）支架植入术后3天和14天PCL组的M1巨噬细胞的比例（CCR7+/CD68+or iNOS+/CD68+）明显高于PCL/CollagenⅥ组（P<0.05）。支架植入术后3天和14天PCL/CollagenⅥ组M2巨噬细胞的显示比例（CD206+/CD68+or CD163+/CD68+）明显高于PCL组（P<0.05）。PCL/Collagen VI组的再生轴突面积、有髓轴突数量、髓鞘直径、G-ratio及髓鞘厚度在3个时间点均显著优于PCL组（P<0.05）。在12周时,有髓轴突数量和G-ratio在自体神经组和PCL/Collagen VI组之间无显著差异（P>0.05）。免疫荧光显示PCL/Collagen VI组的神经纤维及雪旺细胞较为有序的排列生长,可见雪旺细胞沿着轴突生长方向包裹,其也显示了较好的再生效果。PCL/Collagen VI组和自体神经组感觉及运动神经元数

关键词：轴突再生 Ⅵ型胶原巨噬细胞表型外周神经损伤极化

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腺苷激酶信号调控巨噬细胞极化在肾纤维化中的作用及其机制

腺苷激酶信号调控巨噬细胞极化在肾纤维化中的作用及其机制

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作者：徐一力南京医科大学

学位级别：博士

第一部分巨噬细胞以及腺苷激酶参与IgA肾病纤维化过程背景慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease,CKD）是世界范围内一个主要的公共卫生问题。预计到2030年,CKD发病率将增加11-18%,接受肾脏替代治疗的人数将增加一倍多,这为CKD的治疗提... 详细信息

第一部分巨噬细胞以及腺苷激酶参与IgA肾病纤维化过程背景慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease,CKD）是世界范围内一个主要的公共卫生问题。预计到2030年,CKD发病率将增加11-18%,接受肾脏替代治疗的人数将增加一倍多,这为CKD的治疗提出了巨大的挑战。肾脏纤维化导致终末期肾脏病（End Stage Kidney Disease,ESKD）的共同途径。已知巨噬细胞在肾脏纤维化中的具有重要作用,但参与巨噬细胞转型以及功能调控的信号途径较为复杂,其中腺苷（adenosine,ADO）作为一种内源性核苷酸,参与生命体的能量代谢,主要受腺苷激酶（adenosine kinase,ADK）的调控。已有数据表明,提高腺苷（adenosine,ADO）的水平在保护在糖尿病肾病、足细胞疾病以及肾脏免受缺血以及放射性造影剂和药物诱导的肾损伤方面发挥着重要作用。腺苷是否也参与肾脏纤维化的巨噬细胞极化以及功能的调控目前尚未可知,也是本研究的聚焦点。我国是IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）发病率最高的国家之一,伴随疾病的进展,肾间质纤维化逐渐加重是主要的特征之一,大约25%的IgAN患者最终将进入终末期肾脏病患者的行列。因此,我们第一部分选择IgAN患者作为研究对象。目的观察IgAN患者纤维化进程中巨噬细胞浸润以及腺苷激酶的表达。方法根据入排标准选取2022年1月至2022年6月在江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）肾内科行肾活检病理诊断为IgAN患者50例。根据患者肾小管萎缩以及间质纤维化评分,将患者分为T0、T1、T2三组,行肾组织免疫荧光染色,采用CD68、甘露糖受体（mannose receptor,MR）、ADK观察三组肾间质纤维化以及巨噬细胞浸润情况和腺苷激酶表达的差异。结果 1、纳入共50例患者,其中男性23人,女性27人,平均年龄为41.27±14.29岁,e GFR水平为85.51（53.54,114.86）ml/min/1.73 m2。12%的患者出现肾病综合征,88%患者表现为慢性肾炎综合征。 2、IgAN患者中,40例患者诊断为IgANT0,7例患者诊断为T1期,3例患者为T2期。肾间质均出现巨噬细胞浸润,并伴随IgAN患者的纤维化评分（T）的升高,患者CD68+巨噬细胞浸润显著增多,并且MR+巨噬细胞浸润显著增多,提示IgAN患者中纤维化巨噬细胞浸润以MR+巨噬细胞为主。 3、伴随IgAN患者的纤维化评分（T）的升高,患者肾组织中ADK表达显著降低,T0期患者肾组织表达ADK细胞的数量约34个/高倍镜,T1期患者约9个/高倍镜,T2期患者中约2个/高倍镜（P<0.05）。结论在IgAN慢性疾病进程中,肾小管间质损伤越严重,巨噬细胞的浸润越多,并且是以M2型巨噬细胞浸润为主,并且肾组织中ADK的表达逐渐减少,提示M2巨噬细胞以及ADK参与了肾纤维化中过程。第二部分巨噬细胞特异性ADK基因敲除在缺血再灌注诱导的肾脏纤维化中的作用背景已知腺苷参与血管功能的调节作用,具体包括体外诱导内皮细胞增殖和迁移以及体内血管生长。近些年,腺苷介导的“开关”在血管生成修复以及损伤等过程中发挥调节作用。肾脏作为富含毛细血管的器官之一,腺苷在急性肾损伤模型中被发现具有肾脏保护作用,但在慢性肾脏损伤情况下的作用尚不明确。目的探讨巨噬细胞特异性ADK基因敲除在缺血再灌注诱导的巨噬细胞浸润和肾脏纤维化中的作用。方法 1、选取成年雄性C57BL/6（MφADK+/+）以及巨噬细胞特异性ADK基因敲除C57BL/6（MφADK-/-）小鼠各12只,6～8周龄,体重22-28g。分为MφADK+/+组、MφADK-/-组、MφADK+/+缺血再灌注组（ischemia reperfusion,IR）以及MφADK-/-IR组,每组各6只。MφADK+/+组、MφADK-/-组采用IR组与假手术组进行对照。四组小鼠在缺血再灌注术后继续饲养14天而后处死,并留取肾组织标本。Masson染色观察肾脏纤维化情况,Western Blot方法检测α-SMA、E-cadherin表达情况,巨噬细胞特异性抗体F4/80以及MR双染检测肾脏巨噬细胞浸润的程度以及表型变化,免疫组化染色iNOS和Arg-1观察巨噬细胞表型的变化。 2、流式细胞术检测MφADK+/+以及MφADK-/-小鼠腹腔巨噬细胞表型。结果 1、Masson染色显示IR手术组的小鼠比假手术组小鼠肾脏结构紊乱,间质炎细胞浸润增多,可见淋巴细胞及单核细胞,纤维化加重。在IR手术之后14天,MφADK-/-IR组小鼠炎性细胞的浸润更多,间质纤维化比MφADK+/+IR组进一步加重。

关键词： IgAN 腺苷激酶 M2巨噬细胞腺苷激酶缺血再灌注巨噬细胞表型肾脏纤维化腹腔巨噬细胞,腺苷激酶巨噬细胞表型干扰素调控因子4,MCP-1

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大黄（庶虫）虫丸改善外泌体CCL2启动介导的转移前微环境抑制结直肠癌肝转移

大黄（庶虫）虫丸改善外泌体CCL2启动介导的转移前微环境抑制结直...

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作者：陈纯辉南方医科大学

学位级别：博士

背景与目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来中国结直肠癌发病率和死亡率有所上升。大黄(庶虫)虫丸是出自《金匮要略》的经方,千百年来被广泛用于治疗癥瘕积聚。本研究希望阐明大黄(庶虫)虫丸是否... 详细信息

背景与目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来中国结直肠癌发病率和死亡率有所上升。大黄(庶虫)虫丸是出自《金匮要略》的经方,千百年来被广泛用于治疗癥瘕积聚。本研究希望阐明大黄(庶虫)虫丸是否通过改善肝纤维化,从而抑制结直肠癌的肝转移。方法:利用脾注射过表达绿色荧光蛋白的MC38-EGFP细胞建立C57BL/6J小鼠结直肠癌肝转移模型,在体观察大黄(庶虫)虫丸对结直肠癌肝转移的影响。提取小鼠血清外泌体,通过Label-free蛋白质组学分析差异蛋白。通过QPCR检测mRNA的表达,通过免疫组化,免疫荧光与蛋白免疫印迹检测蛋白表达。通过Masson染色检测肝脏胶原沉积。所有统计通过SPSS完成。结果:1.大黄(庶虫)虫丸抑制结直肠癌生长及肝转移。利用MC38-EGFP脾注射构建小鼠结直肠癌肝转移模型。相比模型组,大黄(庶虫)虫丸显著降低脾脏中肿瘤大小,重量及荧光强度,大黄(庶虫)虫丸显著降低肝脏绿色荧光强度及转移灶数目。2.大黄(庶虫)虫丸通过调控肝纤维化抑制肝转移前微环境形成。Masson染色和免疫组化显示,模型组中胶原沉积和纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)表达显著增加,大黄(庶虫)虫丸治疗后显著降低。Spearman相关分析显示,FN所代表的肝脏ECM重构与肝转移灶呈正相关关系。3.大黄(庶虫)虫丸调节外泌体CCL2介导的巨噬细胞浸润和表型。血清外泌体的Label-free蛋白质组学显示,趋化因子CC趋化因子配体-2(CCchemokineligand-2,CCL2)在模型组中上调,但在大黄(庶虫)虫丸治疗后又下调。QPCR和蛋白免疫印迹显示,肝脏CCL2及其受体CCR2的mRNA表达在模型组中上调,但在大黄廑虫丸治疗后下调。Spearman相关分析表明,CCL2 mRNA的相对表达水平与肝转移呈正相关关系。CCL2诱导巨噬细胞募集。免疫组化结果显示,相比空白对照组,模型组肝脏中巨噬细胞标志物F4/80表达显著增加,CCR2+F4/80+巨噬细胞比例显著增加,但大黄(庶虫)虫丸治疗后均显著下降。大黄(庶虫)虫丸降低在模型组中上调的活化的TGF-β1和FN的表达。免疫荧光结果显示,相比起空白对照组中,模型组M1型巨噬细胞比例显著降低,M2型巨噬细胞比例显著升高。与模型组相比,大黄(庶虫)虫丸处理显著上调M1型巨噬细胞、降低M2型巨噬细胞比例。4.抑制纤维化和CCR2减少结直肠癌肝转移。纤维化抑制剂Pirfenidone和CCR2抑制剂CCR2-RA-[R]抑制肠癌肝转移,减少TGF-β1调控的肝纤维化。结论:大黄(庶虫)虫丸抑制CCL2介导的巨噬细胞M2极化,改善肝纤维化微环境,抑制结直肠癌肝转移。

关键词：大黄(庶虫)虫丸结直肠癌肝转移外泌体 CCL2 巨噬细胞表型

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肿瘤相关性巨噬细胞标记物CD206在肝癌中的表达及其药物抑制研究

肿瘤相关性巨噬细胞标记物CD206在肝癌中的表达及其药物抑制研究

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作者：朱方玉重庆医科大学

学位级别：博士

第一部分人原发性肝细胞癌中肿瘤相关性巨噬细胞CD206的表达分析目的:使用肝癌组织芯片研究肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)标记物CD206的表达与原发性肝癌(HCC)预后的关系并分析其临床特点。方法:选取并收集手术时间于2010年1月-2011年9月,随... 详细信息

第一部分人原发性肝细胞癌中肿瘤相关性巨噬细胞CD206的表达分析目的:使用肝癌组织芯片研究肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)标记物CD206的表达与原发性肝癌(HCC)预后的关系并分析其临床特点。方法:选取并收集手术时间于2010年1月-2011年9月,随访时间截止至2013年9月,共随访2-3.7年的原发性肝细胞癌患者共90例,采集病史,获取包含性别、年龄、肝功能、肿瘤分期等完整临床数据,并于术后将肝癌内及相应癌旁组织标本,制作成10*18共180点微阵列组织芯片(癌内及癌旁组织各1点)。免疫组织化学(IHC)检测组织芯片中肿瘤相关性巨噬细胞标记物CD206在肝癌内及对应癌旁组织的阳性表达情况,使用Kaplan-Meier(log-rank检验)法,COX回归分析了解患者生存率与CD206的表达高低及各临床指标的相关性。结果:组织芯片结果表明CD206在癌内的表达水平相较于癌旁显著为高(P<0.05),生存分析结果表明,癌内CD206高表达者较CD206低表达者生存率显著为低(P=0.008),而癌旁组织中CD206的表达高低与患者生存率无显著差异(P=0.772)。COX回归分析提示病理分级(III级,HR=1.449,P=0.043),肿瘤TNM分期(III/IV期,HR=2.117,P=0.013),性别(男性,HR=3.581,P=0.019),甲胎蛋白AFP(>200μg/L,HR=2.518,p=0.037)及癌内CD206的表达(高表达,HR=2.371,P=0.036)是患者的独立预后危险因素。结论:与TAM密切相关的甘露糖受体CD206在人原发性肝细胞肝癌组织中整体呈高表达,各病例对应的癌旁组织CD206表达相较癌内为低。癌内TAM CD206的高表达是与患者预后密切相关的独立危险因素,这为我们后续干预CD206治疗HCC提供了理论依据。第二部分诱导构建稳定细胞表型的肿瘤相关性巨噬细胞并鉴定目的:使用小鼠RAW264.7巨噬细胞系诱导构建稳定表型的肿瘤相关性巨噬细胞,并通过分子生物学手段进行鉴定。方法:RAW264.7为小鼠单核巨噬细胞,源于小鼠血液系统恶性肿瘤,是肿瘤相关性巨噬细胞(TAM,或M2)研究中常用细胞系。使用2.5μg/ml的LPS刺激RAW264.7细胞2小时,然后换完全培养基继续培养48小时,使其向M1型转变;使用10ng/ml的IL-4因子干预细胞48小时,诱导其向M2型巨噬细胞转变。诱导后的M1及M2型巨噬细胞经由流式细胞术分析F4/80,CD16/32,CD206的表达,PCR分析cd206,arg-1,inos,nf-κb1基因的表达、Western Blot检测NOS2及Arg-1蛋白的表达差异。结果:经过LPS诱导后的小鼠RAW264.7巨噬细胞高表达i NOS(NOS2),CD16/32,NF-κb1,呈现M1巨噬细胞表型;IL-4作用后的RAW264.7细胞高表达F4/80,CD206及Arg-1,呈现M2表型。结论:成功诱导建立不同表型的小鼠RAW264.7细胞,其中M2表型的巨噬细胞高表达CD206及Arg-1。这与TAM的特征相符,为后续实验打下良好基础。第三部分氯化钆(Gd Cl3)抑制肿瘤相关性巨噬细胞CD206的表达作用及相关机制研究目的:从体外细胞及体内动物实验多角度证实镧系化合物氯化钆(Gd Cl3)能够通过影响CD206的表达从而影响TAM功能,从而抑制小鼠肝癌的恶性进展。方法:配制不同浓度的Gd Cl3溶液作用RAW264.7细胞,通过CCK8实验明确Gd Cl3作用于细胞的IC10浓度;于IC10浓度下的Gd Cl3干预巨噬细胞,使用流式细胞学,免疫细胞化学,PCR,Western Blot观察并验证Gd Cl3对RAW264.7细胞CD206的抑制作用;使用cd206 RNAi抑制M2巨噬细胞CD206的表达,与Gd Cl3干预后的M2巨噬细胞分别与小鼠Hepa1-6肝癌细胞建立共培养体系,同对照组比较,探索Hepa1-6细胞在侵袭力及肿瘤上皮间质化(EMT)水平变化。使用N-亚硝基乙二胺(DEN)诱导BALB/c幼鼠发生原发性肝癌,并于肿瘤形成过程中给予小鼠注射Gd Cl3,于不同时间点获取肝脏组织及血清标本,分析Gd Cl3干预后小鼠肝脏CD206的表达变化,结合分析小鼠肝癌的生长动力学参数(肿瘤大小、体积等)、小鼠肝功指标、小鼠生存率等,综合判断分析Gd Cl3的抗癌效果及应用安全性。结果:Gd Cl3抑制RAW264.7细胞的IC10浓度为0.069μg/μl。M2型RAW264.7在IC10浓度下的Gd Cl3干预后,其CD206基因及蛋白表达即可出现显著下调。稳定下调CD206的M2型巨噬细胞与小鼠肝癌Hepa1-6细胞共培养,与未下调CD20

关键词：肝癌肿瘤相关性巨噬细胞 CD206 组织芯片巨噬细胞表型氯化钆二乙基亚硝胺上皮间质转化

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