牛X精子和Y精子存在差异表达基因。高纯度的X精子和Y精子是进行差异表达基因研究的绝佳材料。高通量测序技术作为革命性的测序技术,广泛的应用在转录组分析上。通常研究基因表达量采用荧光定量PCR技术,但基因表达量超出荧光定量PCR的灵敏度时,荧光定量PCR的验证效果不如荧光原位杂交技术(FISH),后者作为新兴的热点技术,在基因表达量更低时,也可进行分析。为了进一步探究牛X、Y精子在m RNA水平上的差异,本研究通过对牛流式分选100%纯度的X精子和Y精子进行RNA提取,转录组测序及分析,筛选牛X、Y精子差异表达基因;利用荧光实时定量PCR及荧光原位杂交技术分析筛选到候选基因的特征,并进行生物信息学分析。主要研究内容如下:1.采用三种方法(方法一:试剂盒法、方法二:TRIzol与RNA亲和层析柱法、方法三:添加1%β-巯基乙醇的TRIzol与RNA亲和层析柱法)提取牛性控冻精RNA并对比其提取效果。结果显示:方法一与方法三提取牛性控冻精RNA总RNA量(364.20±8.46ng、377.50±2.65ng)无显著差异(P值为0.095365),但均显著低于(P值分别为0.000032、0.000096)方法二提取牛性控冻精RNA总RNA量(439.00±10.54ng),三种方法得到的RNA的OD260/280值均符合后续转录组测序的实验要求(1.8~2.0),无基因组DNA的污染。2.选用流式分选后100%纯度的X精子和Y精子为试验材料,利用Illumina Hi Seq Xten平台进行高通量测序,并进行基因差异表达分析、GO功能和KEGG通路分析。结果显示:转录组测序得到的原始数据质量合格。筛选出X精子表达基因1408个,Y精子表达基因2297个,其中X精子特异表达基因864个,Y精子特异表达基因1753个,共同表达基因544个。通过富集分析,发现X精子特异表达基因大部分聚集在代谢条目,如核酸代谢,RNA代谢、细胞大分子降解、蛋白代谢、细胞大分子降解等,Y精子特异表达基因大多与能量代谢、精子活力和精子异常有关。通过GO和KEGG分析差异基因及后续试验要求,分析出X精子特异表达基因ADGRA3、ITGA6、BMPR1A、TM2D1、RUVBL2、TDP2等6个及Y精子特异表达基因CD63、PHB1、EPHA1、ZNF394、MARCKSL1等5个。3.对RUVBL2基因、EPHA1基因进行qPCR、FISH,并进行生物信息学分析,结果显示:(1)在荧光显微镜下可见标本背景清晰,精子头部成蓝色,边界清楚,X精子89.5%(n=600)有荧光信号,Y精子9.67%(n=600)有荧光信号,常规精子49.5%(n=600)有荧光信号。实验证明了所选取RUVBL2基因序列为X精子携带。RUVBL2基因CDs区长1392bp,编码463个氨基酸。经过预测,RUVBL2蛋白为稳定的疏水酸性蛋白,无跨膜域和信号肽,荷斯坦牛RUVBL2基因与杂交牛RUVBL2基因相似度最高,其次是普通牛,符合生物进化的规律。(2)在荧光显微镜下可见标本背景清晰,精子头部成蓝色,边界清楚,常规精子98.17%(n=600)有荧光信号,X精子96.17%(n=600)有荧光信号,Y精子97.33%(n=600)有荧光信号。实验证明了所选取EPHA1基因序列X、Y精子均携带。综上,TRIzol与RNA亲和层析柱法相结合提取牛性控冻精RNA效果最好。转录组测序结果显示X精子与Y精子的主要差异基因集中能量代谢上。转录组测序分析得到的RUVBL2基因仅在X精子中表达,而EPHA1基因在X、Y精子中均表达。
本文主要对大鼠、小鼠盲肠结扎穿刺术(CLP)脓毒血症模型进行分析,从模式动物角度发现潜在的脓毒血症相关基因,为脓毒血症诊疗提供理论依据。从NCBI-Gene Expression Omnibus数据库下载原始微阵列数据集,然后纳入盲肠结扎穿刺术脓毒血症及假手术组模型数据。运用生物信息学方法将数据标准化处理后,筛选差异基因进行富集分析和通路分析,并构建蛋白质相互作用关系网络,筛选出具有重要生理调节功能的核心蛋白质和关键候选基因。通过大鼠盲肠穿刺脓毒血症诱导后肝组织的差异基因表达芯片筛选,共获得350个能上调1.5倍及以上的差异基因,1337个能下调2倍及以上的差异基因;通过小鼠盲肠穿刺脓毒血症诱导后肝组织的差异基因表达芯片筛选,获得3532个上调1.5倍及以上的差异基因,4020个下调1.5倍及以上的差异基因;对上述芯片结果的差异基因取交集,得到29个共同上调表达1.5倍以上的差异基因和84个共同下调表达1.5倍以上的差异基因。利用String数据库对上述基因进行蛋白质-蛋白质的相互作用(PPI)网络分析,并利用David数据库从生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路4个角度进行基因功能分析,发现共有10条通路与脓毒血症肝组织关系密切,其中最主要的通路为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,其次,缺氧诱导因子1(HIF-1)、叉形头转录因子的O亚型(FoxO)、乙型肝炎、血小板激活及胆汁分泌等通路调控也与脓毒血症相关。本研究为进一步探讨脓毒血症相关病理生理机制及诊疗方法提供了理论基础。
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