帕利亚姆血清群病毒(PALV)在我国广泛流行,给我国牛羊养殖业健康发展构成了严重威胁,目前国内尚无PALV核酸检测方法的报道。本研究根据流行于我国的中山病毒(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)和D’Aguilar virus(DAV)3种血清型PALV的Seg-...
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帕利亚姆血清群病毒(PALV)在我国广泛流行,给我国牛羊养殖业健康发展构成了严重威胁,目前国内尚无PALV核酸检测方法的报道。本研究根据流行于我国的中山病毒(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)和D’Aguilar virus(DAV)3种血清型PALV的Seg-7保守基因序列,设计针对PALV的群特异性RT-PCR扩增引物,通过反应条件优化,建立了PALV的一步法RT-PCR检测方法,其最佳引物浓度为0.8μmol/L;最佳退火温度为56℃。对该方法进行特异性试验,结果显示该方法可特异性的检测出CHUV、BCV和DAV核酸,而对环状病毒属的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒和广西环状病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对RNA标准品的最低检测限为6.9×10~1拷贝/μL。利用该方法检测血液样品,结果显示该方法检测结果与病毒分离结果基本一致。本研究建立的PALV一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感度高等优点,为开展PALV感染疫病诊断与流行病学研究提供了技术保障。
旨在从牛、羊监控动物群中,对流行于我国的帕利亚姆血清群病毒(PALV)进行分离、鉴定与序列特征分析,明确我国流行毒株与国外毒株之间的关系。自监控动物采集的PALV阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;对所分离PALV毒株的Seg-7与Seg-2基因节段进行扩增、测序与序列分析;通过高分辨率琼脂糖凝胶电泳分析不同血清型PALV代表毒株基因组的"电泳带型"特征;通过免疫荧光与中和试验分析不同血清型PALV的阳性血清之间的交叉反应特性与中和活性。试验结果如下:2012—2016年,在云南、广西、广东共计分离出19株PALV;Seg-2与Seg-7测序与系统发育分析显示,分离毒株分属Chuzan virus(CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)与Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型,不同血清型毒株均与日本毒株具有最近的亲缘关系,而与澳洲、非洲毒株亲缘关系较远。病毒基因组电泳结果显示PALV基因组呈现"3-3-4"的电泳带型特征。免疫荧光结果显示针对CHUV的多克隆抗体可使感染CHUV、DAV与BCV的BHK-21细胞呈现特异性荧光。血清学中和试验显示,CHUV、DAV与BCV三种病毒的阳性血清之间无交叉中和保护作用。本研究报道了2012—2016年中国PALV的分离与Seg-2、Seg-7序列特征,并首次报道了PALV的DAV与BCV两种血清型病毒在我国的分离,研究结果将有助于掌握我国PALV的分布与遗传特征,为诊断试剂的开发、流行病学调查与致病性研究提供科学依据。
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