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文献类型

1 篇 学位论文

馆藏范围

1 篇 电子文献
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日期分布

学科分类号

1 篇 医学
- 1 篇 公共卫生与预防医...

主题

1 篇 树突状细胞
1 篇 乙型肝炎病毒
1 篇 核心抗原
1 篇 强制泛素化
1 篇 ctl细胞
1 篇 慢病毒载体
1 篇 免疫反应

机构

1 篇 上海交通大学

作者

1 篇 周丽芹

语言

1 篇 中文

检索条件"主题词=强制泛素化"

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详细简洁

排序：

强制泛素化HBcAg重组慢病毒载体的构建及其诱导体内CTL反应的初步研究

强制泛素化HBcAg重组慢病毒载体的构建及其诱导体内CTL反应的初步...

引用

作者：周丽芹上海交通大学

学位级别：硕士

HBV的最终清除有赖于CTL细胞的参与，有效诱导足够强度的HBV特异性CTL是慢性乙型病毒性肝炎治疗的关键。目前已有大量的相关疫苗研究，慢病毒载体具备良好的载体特性，已成为广泛研究和发展的生物载体。本实验利用慢病毒载体介导强制泛... 详细信息

HBV的最终清除有赖于CTL细胞的参与，有效诱导足够强度的HBV特异性CTL是慢性乙型病毒性肝炎治疗的关键。目前已有大量的相关疫苗研究，慢病毒载体具备良好的载体特性，已成为广泛研究和发展的生物载体。本实验利用慢病毒载体介导强制泛素化HBcAg诱导小鼠体内CTL反应，探讨泛素化修饰在抗原蛋白降解和提呈中的作用，从而了解其是否在诱导细胞免疫反应中发挥促进作用。实验主要分为以下三部分：\n 第一部分Ub-HBcAg融合基因慢病毒表达载体的构建和表达\n 目的：构建四质粒系统的重组慢病毒载体，包装重组慢病毒，观察和鉴定重组慢病毒表达。\n 方法：分别以Pwpxld-Ub-HBcAg和Pwpxld-HBcAg为模板，PCR扩增Ub-HBcAg和HBcAg基因序列。用BamHI和NheI双酶切慢病毒载体pLenti6.3-IRES-EGFP，连接PCR产物及慢病毒载体，构建重组质粒pLenti6.3-HBcAg和pLenti6.3-Ub-HBcAg。将重组质粒与包装质粒1 pGag/Pol、包装质粒2 pRev、包膜质粒pVSVG按照脂质体转染顺序混合后加入293T细胞的培养液中，转染293T包装细胞，进行包装，获得重组慢病毒LV-Ub-HBcAg和LV-HBcAg，qPCR和western blot检测其在293T细胞中的表达。\n 结果：双向测序结果证实构建的慢病毒载体目的基因序列均正确，荧光倒置显微镜下可见转染细胞内绿色荧光蛋白（GFP）表达，在293T细胞中qPCR和Western blot检测到目的蛋白的表达。\n 结论：成功构建四质粒系统的携带目的基因的慢病毒载体，重组慢病毒感染293T细胞后能够稳定表达目的基因。\n 第二部分重组慢病毒LV-Ub-HBcAg负载DC免疫小鼠诱导CTL细胞的体内研究\n 目的：探讨携带目的基因的重组慢病毒载体负载的DC疫苗对小鼠体内CTL的诱导作用。\n 方法：体外分离培养近交系的小鼠髓源性DC，应用重组小鼠白细胞介素(IL-4)和重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）联合诱导分化DC。培养至第5天，分别加入重组慢病毒和LPS刺激DC成熟，收集细胞，尾静脉注射小鼠。取小鼠脾脏，分离纯化T细胞，流式细胞仪检测T细胞胞内细胞因子水平，CCK8（Cell Counting Kit-8)试剂盒检测T细胞增殖反应，ELISA检测T淋巴细胞上清中细胞因子IFN-γ(interferon-γ)、IL-2、IL-4、和IL-10的分泌水平。\n 结果：成功分离培养和诱导分化小鼠髓源性DC；获得纯度较高的T淋巴细胞。流式细胞仪的检测、CCK8试剂盒的检测及ELISA的检测结果不理想，与预期结果有差异。\n 结论：GM-CSF和IL-4联合应用能够诱导分化小鼠髓源性DC，尼龙毛分离法能够得到较高纯度的T淋巴细胞。由于本实验采用的实验方法不理想使得重组慢病毒感染DC效率低，不足以刺激小鼠发生免疫反应，故T淋巴细胞的实验检测结果不理想。\n 第三部分重组慢病毒LV-Ub-HBcAg直接免疫小鼠诱导CTL细胞的体内研究\n 目的：重组慢病毒携带Ub-HBcAg基因直接免疫小鼠，观察Ub-HBcAg对小鼠体内CTL细胞的诱导作用。\n 方法：选取近交系同等条件的Balb/c小鼠32只，进行实验分组，共分为四组：PBS组4只、LV组4只、LV-HBcAg组12只、 LV-Ub-HBcAg组12只。在小鼠尾根部皮内，注射慢病毒2?107/只，用PBS稀释体积至200ul。1周后，每组取一半小鼠提取T淋巴细胞进行实验，其余一半用于二次免疫。二次免疫2周后，将小鼠全部处死，提取T淋巴细胞，进行相关检测。流式细胞术双标法检测胞内细胞因子IFN-γ的水平，ELISA法检测T淋巴细胞上清中INF-γ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平，CCK-8试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。所得实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数间的比较采用的统计方法为单因素方差分析(one-way ANOVA)，当p<0.05时表示差异有统计学意义。\n 结果：流式细胞仪检测LV-Ub-HBcAg组诱导的CTL数量水平高于LV-HBcAg组及其它对照组，具有统计学意义；CCK-8试剂盒检测LV-Ub-HBcAg组T淋巴细胞的增殖反应高于各对照组；ELISA法检测LV-Ub-HBcAg组两次免疫后分泌的细胞因子，其中初次免疫后LV-Ub-HBcAg组分泌的IFN-γ(44.57±2.91 pg/ml)和IL-2(152.77±12.39pg/ml)高于LV-HBcAg组分泌的IFN-γ(37.23±0.84pg/m1)和IL-2(101.24±

关键词：乙型肝炎病毒核心抗原强制泛素化慢病毒载体树突状细胞 CTL细胞免疫反应

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