检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：郑璐北京协和医学院

学位级别：博士

背景与目的:近些年来,非中性粒细胞缺乏宿主肺曲霉菌病的发病率持续增加,患有此类型疾病尤其是侵袭性肺曲霉菌病的患者的临床预后往往不佳,高死亡率以及预后不良事件发生的背后,也提示临床上对于此类疾病的早期识别与诊断能力的不足。... 详细信息

背景与目的:近些年来,非中性粒细胞缺乏宿主肺曲霉菌病的发病率持续增加,患有此类型疾病尤其是侵袭性肺曲霉菌病的患者的临床预后往往不佳,高死亡率以及预后不良事件发生的背后,也提示临床上对于此类疾病的早期识别与诊断能力的不足。另一方面,对于该类疾病的早期诊断与治疗能极大提高患者的生存率以及改善患者的预后。所以针对此类疾病,急需寻找新的可以快速并且能进行精确诊断的检测方法以及诊治策略。在呼吸道样本的曲霉菌检测方面,以qpcr技术为代表的新型分子检测技术在近些年来显示出了较高的临床应用价值,但由于此类检测技术对待检样本的类型以及靶标的底物浓度等要求较高,以及不能对待检样本内的目的靶标进行精准定量等原因,该技术在临床上的应用也受到了一定的限制。近年来,随着微液滴数字pcr技术在微生物检测领域的广泛应用,对于病原微生物的检测也迈入了新的篇章。研究结果提示,与qpcr相比,微液滴数字pcr在对相关临床样本的微生物病原体检测方面具有更高的灵敏度和准确性,并且在复杂样本的检测方面,该技术具有更好的应用前景。但是,目前尚无已发表研究评价该技术在非中性粒细胞缺乏宿主肺曲霉菌病方面的临床应用价值。所以,本实验将以临床实际需求出发,结合相关病例回顾性分析结果以及前瞻性基础实验的研究结果,来评价微液滴数字pcr技术以及非分子学诊断方法如GM实验、G实验在非中性粒细胞缺乏宿主肺曲霉菌病方面的应用价值,以期为实现对该类患者早诊早治的目标提供新的具有实践价值与意义的方案。方法:本研究的第一部分,采用回顾性病例分析的方法对肺曲霉菌病患者的临床资料进行分析,并且评价可能导致该类患者预后不良的因素,以及比较不同类型样本进行GM实验和G实验对于该类疾病的诊断价值。本研究的第二以及第三部分,将对收集的肺泡灌洗液以及痰液样本进行微液滴数字pcr的检测,并且对收集的肺泡灌洗液样本进行GM实验和G实验。根据微液滴数字pcr对于呼吸道样本中曲霉菌DNA数量的检测结果,以及其他非分子学诊断方法的检测结果,综合评价分析微液滴数字pcr技术以及非分子学诊断方法如GM实验和G实验对非中性粒细胞缺乏宿主肺曲霉菌病的临床应用价值。结果:(1)回顾性病例分析的结果显示,进入呼吸重症监护室治疗的非中性粒细胞缺乏的侵袭性曲霉菌病患者更易合并COPD(P=0.011)以及甲型流感(P=0.033),且90天内死亡的患者更易合并肺癌(P=0.033)以及甲型流感(P=0.033)。合并侵袭性肺曲霉菌的非中性粒细胞缺乏的呼吸重症监护室患者30天(P=0.03)以及90天(P<0.01)的死亡率要显著高于在普通病房进行治疗的患者。以上患者合并肺部基础疾病种类的多少为患者疾病诊断后30天(95%1.328-11.232)以及90天(95%CI,1.129-4.410)死亡的独立危险因素。对于不用类型的肺曲霉菌病,肺泡灌洗液样本的GM实验以及G实验的检测阳性率均高于血液样本。(2)对肺泡灌洗液样本的研究结果显示,微液滴数字pcr技术对非中性粒细胞缺乏宿主肺曲霉菌病患者肺泡灌洗液样本中曲霉菌DNA显示出了较高的检出能力(敏感性80%),并且将该检测技术的诊断切点值与GM实验的诊断切点值进行组合后所拟定的诊断策略对此类患者侵袭性肺曲霉菌病的诊断效能最高(敏感度为87.5%,特异度98.99%,阳性预测值87.5%阴性预测值98.99%,诊断比值比95%CI为38.67-12170.79)。在肺曲霉菌病患者组,肺泡灌洗液微液滴数字pcr的曲霉菌DNA检出数量与GM实验的检测结果呈显著正相关(r=0.736,P=0.010)。非肺曲霉菌病组人群中呼吸道样本曲霉菌DNA检出者为27人(26.4%)。(3)对痰液样本的研究结果显示,与传统培养方法相比(灵敏度33.33%),微液滴数字pcr技术对痰液样本的曲霉菌DNA显示出了较高的检出能力(灵敏度83.33%)。死亡组的侵袭性肺曲霉菌病患者,其痰液的微液滴数字pcr检出的曲霉菌DNA数量显著高于非死亡组(P=0.034)。微液滴数字pcr检出的痰液曲霉菌DNA数量可以对接受抗真菌药物治疗的肺曲霉菌病患者的治疗效果起到侧面提示的作用。结论:1.非中性粒细胞缺乏的侵袭性肺曲霉菌病患者的死亡风险与其肺部基础疾病的复杂程度存在高度的相关性,对于此类型的肺曲霉菌病患者,使用肺泡灌洗液进行GM实验以及G实验检测的阳性率要高于血液样本。2.微液滴数字pcr技术对肺泡灌洗液以及痰液样本中的曲霉菌DNA具有较好的检出能力,对于此检测方法进行合理的诊断切点值划定,并且与肺泡灌洗液GM实验进行联合检测,可以提高对于非中性粒细胞缺乏宿主肺曲霉菌病的诊断能力。3.对呼吸道样本进行微液滴数字pcr检测将有助于对非中性粒细胞缺乏的肺曲霉菌病患者进行治疗以及预后的监测,并且可能提升对呼吸道曲霉定植患者的

关键词：肺曲霉菌病非中性粒细胞缺乏微液滴数字pcr GM实验

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猴痘病毒微液滴数字pcr检测方法的建立

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中华实验和临床病毒学杂志 2024年第3期38卷 337-342页

作者：冯俊霞袁静首都儿科研究所细菌学研究室北京100020

目的建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)检测方法。方法设计靶向猴痘病毒F3L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddpcr检测方法,对ddpcr的最适反应条件进行优化,并对ddpcr的... 详细信息

目的建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)检测方法。方法设计靶向猴痘病毒F3L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddpcr检测方法,对ddpcr的最适反应条件进行优化,并对ddpcr的特异性、灵敏度以及重复性进行检测。进一步对人脓拭子临床样本进行检测,对ddpcr方法检测临床样本的能力进行评价。结果对ddpcr反应温度和引物探针浓度进行优化,建立猴痘病毒ddpcr检测方法,该方法最低检测限可达2拷贝/μl,与其他8种病毒无交叉反应。对10份人皮肤脓液拭子临床样本中的猴痘病毒进行检测,ddpcr方法检测到5份阳性样本,实时荧光定量pcr(real time fluorescence quantitative pcr,qpcr)方法检测到4份阳性样本。结论建立的猴痘病毒的ddpcr检测方法快速、特异、灵敏度高,用于临床样本中猴痘病毒检测。

关键词：猴痘病毒微液滴数字pcr 实时荧光定量pcr

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基于微液滴数字pcr的呼吸道真菌检测方法建立及临床应用研究

基于微液滴数字PCR的呼吸道真菌检测方法建立及临床应用研究

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作者：王楠北京协和医学院

学位级别：博士

真菌是自然界常见且种类繁多的异养型真核生物,其中与对人类健康产生影响的约300多种,造成感染的类型主要分为浅表感染(例如真菌性皮肤病)和深部感染(或称侵袭性真菌感染)。全世界范围内约有17亿人受到浅表真菌感染的影响,但其不构成生... 详细信息

真菌是自然界常见且种类繁多的异养型真核生物,其中与对人类健康产生影响的约300多种,造成感染的类型主要分为浅表感染(例如真菌性皮肤病)和深部感染(或称侵袭性真菌感染)。全世界范围内约有17亿人受到浅表真菌感染的影响,但其不构成生命威胁。侵袭性真菌感染与之相反死亡率极高,以侵袭性曲霉病为例,部分患者人群中诊断和治疗的延误会导致死亡率接近100%。每年因侵袭性真菌感染导致死亡的患者人数高达到150万人,免疫抑制人群增加(例如HIV、血液病、器官移植患者等)和侵入性医疗干预是导致侵袭性真菌感染呈上升趋势的主要原因。肺是最常见的深部真菌感染受累器官,因此对呼吸道常见致病真菌进行快速早期检测具有很高的临床应用价值。念珠菌和曲霉是呼吸道中最常见的条件致病真菌,本研究中以痰液样本为检材,首次建立了基于微液滴数字pcr(Droplet digital pcr,ddpcr)的呼吸道中多靶标真菌(念珠菌、曲霉)检测方法,初步对该方法在肺曲霉病诊断的临床应用情况进行了研究。研究结果表明,该方法的灵敏高、特异性好、临床适用性强,是一种有前景的临床常见呼吸道真菌快速精准检测方法。目前用于肺部真菌感染检测的新型方法主要有G试验、GM试验、质谱、测序、pcr等,对应样本来源主要有静脉血、肺泡灌洗液、支气管刷片和肺组织样本,此类样本的获取需侵入性操作对患者具有创伤性。痰液是无需侵入性操作即可获取的非无菌临床样本,目前对痰液样本进行真菌感染检测的报道较少,主要原因是其成分的复杂性。本研究中基于痰液样本和ddpcr技术建立了对8种呼吸道常见真菌(白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉)的检测方法并进行了验证。实验结果表明该方法的分析灵敏度高,所有真菌靶标在2-2×104拷贝的检测范围内的线性好,R2均大于0.99,引物探针特异性强,与其他细菌、真菌或人细胞株无交叉反应,对临床曲霉或念珠菌分离株检出率为100%。该方法对仅含5个曲霉(烟曲霉和黄曲霉)孢子的模拟痰液样本可进行有效检出,进一步对已知培养结果的29例痰液样本进行检测,结果显示一致性为96.5%,其中1例丝状真菌阴性培养样本中有烟曲霉检出,7例阳性培养结果样本中检出真菌混合阳性结果。最终通过二代测序方法对ddpcr检测结果进行验证,二代测序结果证明了 ddpcr检测结果的精准可靠。随后ddpcr真菌检测方法被首次应用于肺曲霉病的诊断。肺曲霉病是由曲霉感染引起的严重疾病,已有研究表明曲霉在样本中的载量与感染状态相关联,目前曲霉载量尚无定量标准且报道较少。ddpcr方法具有绝对定量和对复杂样本分析的优势,可对痰液样本中曲霉载量进行准确定量,.研究中选取了可涵盖临床90%以上曲霉的4种曲霉靶标(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉)进行检测。首先对收集的18位肺曲霉病患者和99位非肺曲霉病患者进行了临床特征和风险因素分析,分析结果表明肺结核、支气管扩张和长期使用激素或免疫抑制剂是肺曲霉病的主要风险因素。160例临床样本的ddpcr检测结果显示,肺曲霉病组患者的曲霉检出率为84.2%,非肺曲霉病组患者的曲霉检出率为8.2%,肺曲霉病组检出菌株以烟曲霉为主。随后肺曲霉病组患者进一步分为包含或不包含变应性支气管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)组进行受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve,ROC)分析,结果显示前者在检测阈值为20.2拷贝时的灵敏度和特异性可达81.6%和95.1%,后者在检测阈值为39.9拷贝时的灵敏度可达94.7%和99.2,两者的曲线下面积(Area Under Curve,AUC)值均大于0.9,表明该方法对肺曲霉病的诊断价值高。最后,4位肺曲霉病患者在不同时间点采集的共计17份痰液样本检测结果被用于肺曲霉病的病情监测分析,结果表明ddpcr的检测结果变化和患者病情的进展或改善的趋势一致。本研究以痰液作为检测样本,以ddpcr技术为检测平台,建立了一种无创、精确、快速、可靠的呼吸道中真菌检测方法。该方法可对呼吸道中痕量常见真菌进行准确鉴定,对复合感染样本中的每种真菌靶标亦可有效检出,灵敏度高,特异性好,检出率高。基于ddpcr技术绝对定量特性,该检测方法可为样本中真菌准确载量的确定提供一种有效工具,研究结果表明本方法可被用于肺曲霉病的诊断,将来有望为肺曲霉病患者的病情监测提供一种有效的解决方案。

关键词：真菌感染痰液样本微液滴数字pcr 肺曲霉病快速精准检测

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基于微液滴数字pcr的遗传性耳聋无创检测方法的建立及应用研究

基于微液滴数字PCR的遗传性耳聋无创检测方法的建立及应用研究

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作者：王芳北京协和医学院

学位级别：博士

耳聋是一种常见的遗传病,遗传异质性高、人群携带率高,诊断价值高,普筛需求高。目前已发现有100多个基因与耳聋发生相关,中国遗传性耳聋的发病率约为1-3/1000,每年大约新增6万聋儿,包括3.5万新生听力障碍儿童和2.5万迟发性和药物性耳聋... 详细信息

耳聋是一种常见的遗传病,遗传异质性高、人群携带率高,诊断价值高,普筛需求高。目前已发现有100多个基因与耳聋发生相关,中国遗传性耳聋的发病率约为1-3/1000,每年大约新增6万聋儿,包括3.5万新生听力障碍儿童和2.5万迟发性和药物性耳聋。耳聋的高发病率归结于中国人群约4-5%的突变基因携带率,基因突变检测具有很高的诊断价值。因此,本研究基于微液滴数字pcr（Droplet digital pcr,ddpcr）以口腔拭子为检测样本建立了耳聋常见突变位点无创检测方法,尤其是首次实现了药物性耳聋基因突变异质率的精准定量检测。此外,以孕妇血浆游离DNA（Cell-free DNA,cfDNA）为检材进行了耳聋无创产前检测的（Noninvasive prenatal testing,NIPT）初步研究。研究结果显示基于ddpcr的检测方法简便快速、灵敏度高、精准可靠是一种有前景的无创耳聋基因突变检测方法。首先,本研究基于ddpcr以口腔拭子为检测样本建立了超高灵敏度的耳聋无创检测方法,该方法极大降低了检测模板量且不会对被检测者造成创伤。目前耳聋突变检测方法主要有微阵列基因芯片、质谱、测序技术等,这些方法通量高、准确性高,但不足之处在于检测样本来源主要以成人静脉血、新生儿足跟血为主,均需要针刺取样,属于侵入性取样方式,基于这些技术开发无创检测方法的报道较少。口腔拭子是一种无创检测样本,采样简便且成本低,但样本含量波动大量化不可控且纯度较血液低。为实现无创检测的目的,本研究基于灵敏度高、准确性高的ddpcr和口腔拭子样本建立了耳聋常见8位点无创检测方法并进行系统研究,结果显示该方法特异性可以达到100%,最低检测限为5拷贝,在105-10拷贝范围内检测线性好且R2＞0.9976,在105-10拷贝范围内定量的准确性和重复性好。本方法对-20℃冻存和常温保存90天的口腔拭子所提取的核酸均可准确检出,进一步对23例干血斑和42例口腔拭子临床样本进行检测,检出率为100%,与Sanger测序结果一致率为100%。进一步基于ddpcr的超高灵敏度和绝对定量的优势,研究首次实现药物性耳聋基因突变异质率的精准定量检测。在某种程度上异质率水平是决定线粒体功能、疾病严重程度及复杂临床表型的最重要的影响因素之一。目前,药物性耳聋基因异质性突变的检测尚无金标准方法,对异质率定量检测的报道较少,尤其是较低水平异质率检测。因此,本研究首次基于ddpcr对具有重大筛查意义的药物性耳聋m.1494C＞T和m.1555A＞G位点突变异质率进行定量检测,结果表明该方法在0%-100%的异质率范围内检测线性好且R2＞0.9990。本方法可检测低至1%的异质率。进一步对14例干血斑进行定量及分型检测,ddpcr结果与芯片和Sanger测序结果比对,从1例野生型样本中检测出低水平的异质突变,7例均质突变样本均检测出不同水平的异质突变。最后,对2个药物性耳聋家系的5位母系成员口腔拭子进行检测,异质突变样本均精准定量,均质突变样本均检测到不同水平的异质突变且异质率在每代间传递逐渐递增。最后,基于ddpcr的快速简便、超高灵敏度和绝对定量的优势,开展了耳聋NIPT的初步研究。目前,耳聋无创产前诊断的常用方法有新一代测序技术和ddpcr技术。新一代测序技术检测价格高、操作复杂且结果准确性影响因素较多。因此本研究基于更为简便灵活的ddpcr技术建立遗传性耳聋无创产前诊断方法。首先通过ddpcr对不同基因型样本和不同浓度样本进行特异性和定量准确性验证,结果显示ddpcr可对不同浓度样本进行定量检测且具有较高的灵敏度和特异性。然后,通过片段化DNA对临床常见两种孕妇cfDNA进行模拟,ddpcr检测结果显示当胎儿cfDNA≥5%时定量准确性和重复性较好。最后,对3例耳聋家系进行定量检测,检测结果与侵入性产前诊断结果一致,检测结果精准可靠。本研究以ddpcr技术平台为基础,以口腔拭子为检材,建立了适合大规模开展的耳聋无创筛查方法。该方法不仅能对常见位点进行分型检测还能对药物性耳聋突变异质率进行精准定量,快速简便、灵敏度高、准确性高,有望成为新一代耳聋基因突变筛查方法。基于方法的灵活性和简便性,也可用于线粒体其它相关疾病检测,为线粒体疾病的分子机制研究、临床诊断、基因治疗提供了精准的分析方法。本研究进一步以cfDNA为检材完成了耳聋无创产前诊断的初步研究,该方法在cfDNA检测方面具有较好的灵敏度和准确性,是一种可靠的耳聋无创产前检测方法。

关键词：遗传性耳聋微液滴数字pcr 无创检测口腔拭子血浆游离DNA

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鞍区生殖细胞瘤患者的临床特点和鞍区疾病脑脊液白细胞肿瘤基因表达量的初步探索

鞍区生殖细胞瘤患者的临床特点和鞍区疾病脑脊液白细胞肿瘤基因表...

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作者：韩慧侨北京协和医学院

学位级别：博士

第一部分鞍区生殖细胞肿瘤患者的临床特点总结目的中枢性尿崩症患者常在影像学上表现为垂体柄增粗,而病因学诊断充满了挑战。本研究旨在总结鞍区生殖细胞瘤患者的临床病理特点。方法回顾性分析2008年1月至2018年10月北京协和医院收治... 详细信息

第一部分鞍区生殖细胞肿瘤患者的临床特点总结目的中枢性尿崩症患者常在影像学上表现为垂体柄增粗,而病因学诊断充满了挑战。本研究旨在总结鞍区生殖细胞瘤患者的临床病理特点。方法回顾性分析2008年1月至2018年10月北京协和医院收治的垂体柄增粗的鞍区生殖细胞瘤患者的临床特点,与朗格汉斯细胞组织细胞增生症(langerhans cell histiocytosis,LCH)和自身免疫性垂体炎(autoimmune hypophysitis,AH)患者进行对比,为鉴别诊断提供临床证据。结果共纳入生殖细胞瘤患者85例,LCH患者65例,AH患者30例,男女比例为0.7:1、1.5:1、0.5:1,发病年龄为AH>LCH>生殖细胞瘤(38.7岁>20.1岁>12.0岁,P<0.001),生殖细胞瘤发病到确诊时间间隔长于AH(2.0年vs 0.6年,P=0.005)。中枢性尿崩症为三种疾病中最常见的首发症状(66.7%～76.9%),三组中第二常见的首发症状均为月经紊乱。初诊时三组最常累及的轴系均为HPG轴。HPA轴、HPT轴、HPG轴、GH-IGF1轴及全垂体功能受损的发生率均在生殖细胞瘤中最高。生殖细胞瘤组的脑脊液白细胞数(3*106/L vs2*106/L)、单核细胞数(4*106/L vs1*106/L)明显高于LCH组(P<0.02),生殖细胞瘤组的脑脊液葡萄糖分别低于LCH(3.1mmol/L vs 3.3mmol/L,P=0.017)AH(3.1mmol/L vs 3.3mmol/L,P=0.021)。而生殖细胞瘤组的脑脊液和血β-HCG水平显著高于LCH组和AH组(P<0.005)。三组垂体柄横径和前后径无差异,三组垂体后叶高信号消失比例均较高(92.3%～100%)。对于生殖细胞瘤的诊断,脑脊液β-HCG切点值为4.9mIU/ml时,灵敏度为67.1%,特异性为75.0%。而发病年龄<20岁(OR=6.878,P<0.001)、脑脊液 β-HCG>4.9 mIU/ml(OR=8.325,P<0.001)、全垂体功能减低(OR=6.954,P=0.005)、脑脊液葡萄糖≤3.3mmol/L(OR=4.311,P=0.013)是生殖细胞瘤的危险因素。结论发病年龄小、全垂体功能减低、脑脊液β-HCG高、脑脊液葡萄糖低是生殖细胞瘤的危险因素,影像学检查难以鉴别生殖细胞瘤、LCH和AH,必要时需组织活检以明确病因。第二部分鞍区疾病脑脊液白细胞肿瘤基因表达量的初步探索目的利用微液滴数字pcr(droplet digital pcr,ddpcr)检测脑脊液白细胞肿瘤基因的表达量,探究不同鞍区肿瘤的相关基因表达量的差异。方法以2018年8月至2019年5月北京协和医院收治的14例生殖细胞瘤患者、4例朗格汉斯细胞组织细胞增生症患者以及3例垂体无功能腺瘤患者为实验组,健康人的外周血白细胞为对照组。收集脑脊液检验结果和临床资料。采用一步法ddpcr进行脑脊液中的8种生殖细胞瘤特异基因(PLAP、OCT3/4、SALL4、CD117、SOX9、NANOG、HCG、EMA)和8种朗格汉斯细胞组织细胞增生症特异基因(CD1a、S100、CD207、BRAF、CD40、CD45、CD68、CD163)表达情况绝对定量,分析和比较不同肿瘤的差异。探究表达量与脑脊液常规检查中白细胞数量之间的关系。结果一步法ddpcr实验证实高/低表达量样本的批内和批间的β-actin基因绝对表达量的变异小,该方法稳定可靠,重复性好。脑脊液和外周血白细胞均表达所有生殖细胞瘤和朗格汉斯细胞组织细胞增生症的特异基因。所有肿瘤类别中,CD117、SALL4均不表达或低表达,健康人外周血白细胞中表达结果与脑脊液白细胞一致。三组肿瘤比较发现,除CD117、SALL4外,生殖细胞瘤的所有指标表达量均为最高,但无统计学意义(P>0.05)。脑脊液常规中的白细胞数与总体基因的中位表达量之间存在正相关关系(rs=0.664,P=0.001)。CD1a、S100、CD207、BRAF、CD68、CD163、PLAP、OCT3/4、HCG的表达量与脑脊液白细胞数呈正相关关系(P<0.05)。结论生殖细胞瘤患者脑脊液中,白细胞激活状态可能强于另外两种疾病。CD117、SALL4可能是生殖细胞瘤脑脊液中的特异性标志物。

关键词：垂体柄增粗生殖细胞瘤朗格汉斯细胞组织细胞增生症自身免疫性垂体炎微液滴数字pcr 脑脊液白细胞

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西北地区苯丙酮尿症患者PAH基因突变谱分析及无创产前诊断的初步研究

西北地区苯丙酮尿症患者PAH基因突变谱分析及无创产前诊断的初步...

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作者：闫有圣北京协和医学院

学位级别：博士

苯丙酮尿症（Phenylketonuria,PKU,OMIM#261600）是一种最常见的常染色体隐性遗传代谢病,因苯丙氨酸轻化酶（Phenylalanine Hydroxylase,PAH）基因突变导致PAH活性降低或丧失,苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe）在肝脏中代谢紊乱所致。PKU... 详细信息

苯丙酮尿症（Phenylketonuria,PKU,OMIM#261600）是一种最常见的常染色体隐性遗传代谢病,因苯丙氨酸轻化酶（Phenylalanine Hydroxylase,PAH）基因突变导致PAH活性降低或丧失,苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe）在肝脏中代谢紊乱所致。PKU发病率有种族和地区差异,我国北方地区的PKU发病率高于南方地区,而西北地区明显高于全国平均水平,是PKU的高发区域。本论文对西北地区PKU患者的分子遗传基础进行了研究,分析了该地区PKU致病基因PAH的突变谱,明确了其突变热点以及突变位点与PKU临床表型的相关性,为PKU的防治奠定了基础数据。为了筛选西北地区PKU患者中PAH基因热点突变,建立了一种基于MassArray基因分型技术的PAH基因突变热点的筛查方案,评价其特异性和准确性。建立了一种基于微液滴数字pcr（droplet digital pcr,ddpcr）的苯丙酮尿症无创产前诊断的方法,并与常规侵入性诊断方法进行比对评价其准确性。通过本研究建立了一个集孕前或孕期PAH基因热点突变携带者筛查、孕期无创和侵入性产前诊断、产后基因诊断为一体的PKU三级预防干预方案。我们收集整理了西北地区475个PKU家系,采用Sanger测序、MLPA方法、gap-pcr对PAH基因突变进行分析,并采用生物信息学软件对新发现的突变进行功能预测,分析PAH基因突变与PKU患者表型的相关性。结果在475例PKU患者的950个等位基因中检测到895个突变,检出率为94.21%（95%CI,92.72%-95.70%）,通过家系验证鉴定了 128个突变,突变等位基因中频率最高的是c.728G>A（14.00%）、其次是 c.611A>G（5.58%）、c.1068C>A（4.95%）。74 例患者采用 MLPA 方法鉴定了PAH基因7种大片段缺失/重复突变,占总突变频率的3.01%（27/895）,其中c.-4163-406del3758是西北地区最常见的类型,并用gap-pcr分析了大片段缺失突变的断裂点。我们鉴定了 20个PAH基因新突变,并对其功能进行了预测。根据PKU患者的临床分型标准将475例患者进行分型,并对患者的表型与基因突变频率进行相关性分析,结果提示c.158G>A、c.1256A>G与轻度高苯丙氨酸血症相关。为了筛选西北地区PAH基因突变频率位于前35位的突变位点,设计了基于MassArray技术的突变分型方案,成功对其中29个突变分两组反应进行了分型分析,设计成功率为82.85%。对105例已明确PAH基因突变的PKU患者样本进行MassArray分型,通过两个Panel的检测,29个突变均检测到了突变样本,MassArray基因突变分型结果均与Sanger测序结果一致,检测准确性为100%。采用双盲法对照实验,对初诊的50例苯丙酮尿症患者进行MassArray技术筛查热点突变,同时采用Sanger测序及MLPA分析进行突变验证,50例初诊的苯丙酮尿症患者中MassArray技术检测到74个突变等位基因,检出率为74%（95%CI,65%-83%）,基因诊断率为 54%（95%CI,40%-68%）。我们收集了 24个需要进行产前诊断的PKU家系,先证者及父母基因突变明确,采用传统的侵入性产前诊断方法对胎儿进行了产前诊断,同时采集孕妇外周血10mL,分离孕妇血浆,提取血浆中cfDNA。侵入性产前诊断结果显示了在24例胎儿中3例为受累胎儿,8例为正常胎儿,13例为致病突变杂合携带者。针对产前诊断家系PAH基因突变特点设计基于微液滴数字pcr（ddpcr）检测方案,并对方案的灵敏度和特异性进行了评价。成功对其中8个家系进行无创产前诊断分析,无创产前结果与侵入性产前诊断的结果一致,未发现有假阳性也假阴性结果。本研究通过对475个西北地区PKU家系进行PAH基因突变研究,首次建立了西北地区苯丙酮尿症患者基因突变谱,明确了西北地区PAH基因热点突变区域及突变的分布特点。首次发现并鉴定了 20个PAH基因新的变异位点,并对这些位点进行了功能分析,丰富了PAH基因突变库。通过基因型表型分析明确了部分突变位点与表型的相关性,此结果可以为表型预测提供一定的依据。根据西北地区PAH基因突变热点分析建立了一种基于MassArray技术的PAH基因热点突变检测方法,该方案可以同时对PAH基因29个热点突变位点进行基因分型,突变检出率可达到74%（95%CI,65%-83%）,该检测技术操作简单,具有高准确性和特异性,可以作为一种高通量、低成本、快速的PAH基因突变筛查和诊断的方法。本研究首次建立了一种基于ddpcr方法的PKU无创产前诊断方案,并进行了系统的评价,结果显示ddpcr在cfDNA检测方面

关键词：苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶 MassArray 微液滴数字pcr 无创产前诊断

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基于非测序方法对新冠病毒基因型鉴定和新变异株预警的可行性研究

基于非测序方法对新冠病毒基因型鉴定和新变异株预警的可行性研究

引用

作者：杨潇雨安徽理工大学

学位级别：硕士

研究背景:严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2,以下简称新冠病毒)的广泛传播和不断变异强调了对该病毒进行持续监测的紧迫性,以便早发现并采取预防措施。虽然全基因组测序(Whole g... 详细信息

研究背景: 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2,以下简称新冠病毒)的广泛传播和不断变异强调了对该病毒进行持续监测的紧迫性,以便早发现并采取预防措施。虽然全基因组测序(Whole genome sequencing,WGS)作为SARS-CoV-2检测的金标准,但是其专业性和昂贵成本限制了其在各种情境下的广泛应用。在资源匮乏的地区,迫切需要一种低成本高效率的补充方法。研究目的及方法: 本研究的主要目的是开发新的非测序方法,以作为WGS的补充方案,用于快速、简便地识别大规模筛查中新冠病毒的基因型。同时,该研究还旨在评估基于微液滴数字pcr(Droplet digital pcr,ddpcr)的方法在新变异株预警方面的可行性研究。本研究依据CNAS-GL039:2019《分子诊断检验程序性能验证指南》,结合核酸参考品、标准品及101例SARS-CoV-2阳性临床样本,验证一款国产新型冠状病毒2019-n Co V Omicron BF.7、BA.5.2、XBB、BQ.1及亚分支变异株单重核酸检测试剂盒(RT-qpcr法)的性能,并通过对101例SARS-CoV-2阳性临床样本进行评估,验证其在实际应用中的可行性。本研究还建立了一种以ddpcr为平台的新冠病毒基因型鉴定的快速检测方法,并评估了其在预警新变异株方面的可行性。研究结果: ***-qpcr分型方法与“野生型”SARS-CoV-2、Alpha、Beta、Delta变异株和甲型流感病毒参考株之间无交叉反应,最低检测限为100 copies/m L。在101例新冠病毒核酸阳性样本中,该试剂盒对Omicron BF.7、BA.5.2、XBB、BQ.1及亚分支变异的检测结果与WGS检出结果完全一致。 2.基于ddpcr方法检测新冠病毒的分析特异性好,未发现该方法与其他对照核酸模板之间有交叉反应。通过单一临床样本和混合模拟样本的定量检测结果的比对分析发现,该方法能对新变异株进行预警。研究结论: 本研究评估和建立了两种非测序方法,用于快速鉴定新冠病毒变异株的亚型。这些方法简单、经济且高效,可作为WGS的有效补充方案。基于ddpcr的检测方法显示出预警新冠病毒新变异株的应用潜力。这些研究结果为及时监测变异株提供了重要的技术支持。图[16]表[15]参[105]

关键词： SARS-CoV-2 Omicron变异株实时荧光定量逆转录pcr 微液滴数字pcr

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基于核酸扩增技术的艰难梭菌检测方法的建立与评价

基于核酸扩增技术的艰难梭菌检测方法的建立与评价

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作者：印彩虹吉林大学

学位级别：硕士

艰难梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌,寄生在人和动物的肠道内,艰难梭菌感染通常发生在抗菌药物的长期使用或不良使用引起肠道菌群失调后,表现为腹泻、腹痛、白细胞增多等症状。艰难梭菌的检测方法主要包括粪便培养法、细胞毒... 详细信息

艰难梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌,寄生在人和动物的肠道内,艰难梭菌感染通常发生在抗菌药物的长期使用或不良使用引起肠道菌群失调后,表现为腹泻、腹痛、白细胞增多等症状。艰难梭菌的检测方法主要包括粪便培养法、细胞毒性测定和谷氨酸脱氢酶测定,然而这些方法耗时、操作复杂且灵敏度低。核酸扩增技术因反应快速和高灵敏性引起广泛关注,从技术开发至今,核酸扩增技术得到了不断地发展与改进。目前,常见的核酸扩增技术如实时定量聚合酶链反应和环介导等温扩增,前者属于变温扩增且需要精密仪器,后者引物设计复杂,易出现假阳性或假阴性结果。因此,开发新型、快速、简便、准确、灵敏的基于核酸扩增技术的艰难梭菌检测方法,对及时诊断艰难梭菌感染,预防和控制由艰难梭菌引起的肠道感染性疾病具有重要意义。目的:聚合酶螺旋反应技术利用Bst DNA聚合酶的链置换活性,在等温环境下实现一对引物和一种酶的核酸扩增。针对艰难梭菌缺乏快速灵敏的现场检测工具,本论文旨在建立一种聚合酶螺旋等温扩增方法,在基层单位或现场紧急事件场景下,实现对艰难梭菌的快速可视化定性检测。微液滴数字pcr反应技术基于pcr反应,通过对样本的微滴化处理,实现核酸高灵敏度检测和定量。针对艰难梭菌临床样本基质复杂,病原菌含量低,本论文旨在建立一种微液滴数字pcr方法,在临床实验室环境下,实现复杂样品基质中微量艰难梭菌准确而灵敏度高的定量检测。方法:1.基于聚合酶螺旋反应技术快速可视化检测艰难梭菌首先对艰难梭菌进行纯化培养,采用煮沸法提取细菌核酸。针对艰难梭菌特异性毒素tcdB基因设计聚合酶螺旋扩增反应主引物和加速引物,建立并在引物及反应温度方面优化聚合酶螺旋扩增反应体系。体系中引入羟基萘酚蓝指示染料,利用指示染料与镁离子结合呈现紫色,而失去镁离子使得体系颜色呈现蓝色的原理,肉眼观察阳性样品和阴性样品的颜色变化,建立艰难梭菌快速可视化检测方法。通过模拟粪便样品和临床分离株来评价方法的灵敏度、特异性、检出限以及临床适用性。2.基于微液滴数字pcr反应技术定量检测艰难梭菌该方法以艰难梭菌为靶标,针对艰难梭菌特异性毒素tcdB基因评估并合成微液滴数字pcr和实时荧光定量pcr反应引物和探针。首先使用质粒DNA和纯菌液DNA,建立并优化微液滴数字pcr反应体系,检测扩增产物荧光信号,以一维阴阳性液滴分布图呈现分析实现定量检测,最后对方法的灵敏度、特异性、重复性以及检出限进行评价,并在模拟样品和临床分离株中评价所建立方法的可行性。结果:1.基于聚合酶螺旋反应技术快速可视化检测艰难梭菌(1)针对艰难梭菌特异性毒素tcdB基因,采用混合引物的设计理念,成功设计出一对主引物和一对用于促进扩增反应进行的加速引物,随后对影响反应扩增效率最大的引物和反应温度进行选择和优化,选择64℃作为最佳反应温度,选择引物1作为最佳引物,包含一对主引物FIP和BIP,一对加速引物LF和LB,此时扩增效率最高;(2)该方法对艰难梭菌基因组DNA的检测灵敏度可达150 fg/μL,对模拟粪便样品的检出限低至2×10 CFU/mL,整个流程可在60 min内完成,特异性较好,通过羟基萘酚蓝指示染料实现结果可视化,为现场快速筛选艰难梭菌感染样本提供技术支持。对5株临床艰难梭菌分离株的检测结果与基因测序,常规pcr法,分离培养法一致,也可应用于模拟粪便样本及临床分离株的检测中。2.基于微液滴数字pcr反应技术定量检测艰难梭菌(1)针对艰难梭菌特异性毒素tcdB基因,评估并合成微液滴数字pcr反应引物和探针,建立并优化微液滴数字pcr反应体系,在56℃退火温度条件下,可以实现阳性微滴和阴性微滴之间的明显分层,扩增效果最好。在质粒检测中,微液滴数字pcr检测灵敏度可低至8.856拷贝数/反应且线性关系稳定(R>0.99),与实时荧光定量pcr法相比较,在低浓度病原菌情况下性能更为稳定;(2)对模拟粪便样品中的艰难梭菌进行检测,微液滴数字pcr线性范围为1×10～1×10 CFU/mL,灵敏度高,稳定性强,检测范围广;在临床分离株检测中,微液滴数字pcr阳性测定结果与基因测序及电泳结果一致,证明其可用于临床实验室中艰难梭菌的定量检测。结论:1.建立了一种基于羟基萘酚蓝的聚合酶螺旋反应方法,实现对粪便中艰难梭菌的可视化、定性检测。2.建立了一种微液滴数字pcr方法,实现对粪便中的微量艰难梭菌的定量检测。3.建立的两种艰难梭菌检测方法特异性好、灵敏度高,检测范围广,分别适用于现场检测和临床实验室检测两种不同场景。

关键词：艰难梭菌聚合酶螺旋反应微液滴数字pcr 现场即时检测临床实验室检测

来源：评论

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