检索结果-内蒙古大学图书馆

基础医学与临床 2014年第4期34卷 449-453页

作者：李秀红张献彩周德山马伟首都医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室北京100069 邢台医学高等专科学校解剖学教研室河北邢台054000

目的研究自动磷酸化Pak1在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位模式及其在纺锤体形成中的相关性。方法用Western blot检测Ser144位点自动磷酸化的Pak1(pPak1^(S144))的蛋白表达量的动态变化;免疫荧光染色追踪pPak1^(S144)的亚细胞... 详细信息

目的研究自动磷酸化Pak1在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位模式及其在纺锤体形成中的相关性。方法用Western blot检测Ser144位点自动磷酸化的Pak1(pPak1^(S144))的蛋白表达量的动态变化;免疫荧光染色追踪pPak1^(S144)的亚细胞定位模式及其与纺锤体和微管组织中心蛋白之间的时空关系。结果在小鼠卵母细胞内pPak1^(S144)持续稳定地表达于减数分裂各期,pPak1^(S144)与中心粒周围蛋白(pericentrin)和γ微管蛋白(γ-tubulin)在时空上呈现紧密的共定位关系并特异地定位于纺锤体两极。结论pPak1^(S144)是小鼠卵母细胞MTOC相关蛋白,提示其与减数分裂纺锤体形成相关。

关键词： pPak1S144 卵母细胞减数分裂微管组织中心纺锤体

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中心蛋白研究进展

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细胞生物学杂志 2002年第6期24卷 328-332页

作者：贺晓静梁爱华山西大学生物工程实验室太原030006

中心蛋白是一种约20kD的酸性钙结合蛋白,含4个EF手性结构。它在进化上极其保守,尤其是其EF手性结构区域。氨基端是变化最大的区域。目前还没有关于中心蛋白晶体结构的报道。中心蛋白是微管组织中心(MTOC)的主要成分,参与MTOC相关联的纤... 详细信息

中心蛋白是一种约20kD的酸性钙结合蛋白,含4个EF手性结构。它在进化上极其保守,尤其是其EF手性结构区域。氨基端是变化最大的区域。目前还没有关于中心蛋白晶体结构的报道。中心蛋白是微管组织中心(MTOC)的主要成分,参与MTOC相关联的纤维的收缩,并在MTOC的生物合成过程中起重要作用。

关键词：真核细胞微管组织中心中心蛋白研究进展

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KIF2A在人卵母细胞体外成熟中的表达及功能研究

KIF2A在人卵母细胞体外成熟中的表达及功能研究

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作者：张奥南方医科大学

学位级别：博士

研究背景:哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟是一个复杂的多阶段精密调控的过程。排卵前,卵母细胞阻滞于第一次减数分裂前期。在黄体生成素(luteinizing hormone,LH)峰的作用下,才继续开始第一次减数分裂。生发泡破裂(germinal vesicle brea... 详细信息

研究背景:哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟是一个复杂的多阶段精密调控的过程。排卵前,卵母细胞阻滞于第一次减数分裂前期。在黄体生成素(luteinizing hormone,LH)峰的作用下,才继续开始第一次减数分裂。生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)标志着成熟进程的开始。在第一次减数分裂中期(metaphase ofmeiosisⅠ,MⅠ)的卵母细胞中,聚集于染色体附近的微管组装形成有两极的纺锤体,为染色体准确地分离提供有利条件。随后,纺锤体在微丝的作用下迁移至皮层,排出第一极体(firstpolarbody,PB1),卵母细胞进入第二次减数分裂中期(metaphase of meiosis Ⅱ,MⅡ)等待受精。至此,卵母细胞达到了减数分裂成熟,受精后将再次恢复减数分裂直至分裂结束。驱动蛋白超家族是一群可被细分为14种亚家族的驱动蛋白,在大分子运输、有丝分裂乃至减数分裂中都有着关键作用。Kif2a具有解聚酶催化活性,与kif2b、kif2c/MCAK同属于驱动蛋白-13家族。它最早在小鼠脑部被发现,可通过解聚微管的作用对哺乳动物脑部神经元轴突进行剪切,从而抑制神经元轴突的过渡生长。在有丝分裂中,kif2a作为微管负末端解聚蛋白位于纺锤体极点,MACK则作为正末端解聚蛋白位于染色体的着丝粒处;它们分别产生指向纺锤体两极的动力和指向着丝粒处的动力并相互配合,从而维持纺锤体的双极性。敲减kif2a导致细胞在有丝分裂时微管组装过度,可能严重影响微观动力学稳定性,从而导致单极或多极纺锤体的形成。而最近的我中心研究显示,kif2a在小鼠卵母细胞减数分裂中同样至关重要。敲减kif2a导致了小鼠卵母细胞完成第一次减数分裂能力的显著下降。这些卵母细胞中,MI期的纺锤体异常率升高,并无法准确迁移至卵母细胞皮层。另外,研究者们发现Kif2a还参与了微管动力学的调控,通过提高SAC的组件BubR1和其结合配子Bub3使卵母细胞阻滞于MI期。即使卵母细胞能完成第一次减数分裂,它们排出的极体却异常肥大,这种错误的细胞不对称分裂可能是由MI期纺锤体迁移失败导致的。人KIF2A是小鼠kif2a的同源基因,对于其在人的卵母细胞减数分裂成熟目前仍未有研究报道。研究目的:探讨小鼠kif2a的同源基因KIF2A在人卵母细胞体外成熟(尤其是减数分裂过程)中的作用和机制,为临床卵母细胞成熟障碍寻求新的诊治方向。方法:我们利用GEO数据库中对人类胎儿生殖细胞(fetal germ cells,FGCs)转录组的高通量测序信息,从中提取关于KIF2A基因的部分进行计算分析,研究其在人类雌性FGCs四个重要发育时相中的表达。经南方医院医学伦理委员会批准,选择于南方医院生殖医学中心因男方因素不孕行ICSI新鲜周期中的患者,患者(女方)年龄需小于40岁。经患者签字同意后收集其治疗过程中剩余不用的GV期、MI期和MII期卵母细胞,以及质量低下且未达到移植条件的胚胎(1细胞、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑葚胚和囊胚)。首先,对各时期卵母细胞和胚胎进行单细胞qPCR检测KIF2A mRNA的水平、免疫荧光检测KIF2A蛋白的水平和定位;接着用紫杉醇和诺考达唑分别处理MI期和MII期卵母细胞后,用免疫荧光检测分析KIF2A定位与微管动力间的关系;最后对GV期卵母细胞进行KIF2AsiRNA显微注射,敲减其蛋白表达后进行体外成熟培养,研究KIF2A敲减对卵母细胞体外成熟的影响。结果:一、KIF2A在人类雌性FGCs的四个关键发育时相中的表达情况人类雌性FGCs经历的四个关键发育时相:有丝分裂阶段、视黄酸信号响应阶段、减数分裂前期阶段和原始卵泡生成阶段。为了研究KIF2A分别在这四个阶段中的表达,我们从人类雌性FGCs的转录组测序数据中挑选出了 KIF2A基因的转录组测序数据,分析比较KIF2AmRNA在四个发育时相中表达量。结果显示,KIF2A在减数分裂前期阶段的表达较有丝分裂阶段和原始卵泡生成阶段有明显的升高(p<0.05)。这提示KIF2A在减数分裂前期阶段对卵母细胞成熟可能有着重要作用。二、KIF2A在各时期的人卵母细胞和移植前胚胎中的表达情况对各时期人卵母细胞和移植前胚胎进行单细胞qPCR分析的结果显示,KIF2AmRNA从GV期卵母细胞到囊胚期都有丰富的表达,其中GV期表达显著高于其它时期,这证实了上述KIF2AmRNA在减数分裂前期阶段表达显著高于其它发育时相的结果。荧光染色结果显示,在GV期,KIF2A主要定位于生发泡内。这与kif2a在小鼠GV期卵母细胞中的分布特征相符。MⅠ期和MⅡ期,KIF2A主要定位在纺锤体上,并且在纺锤体两极上富集。此外,我们还发现KIF2A蛋白在各时期的早期胚胎中均有较高的表达,并主要分布于整个细胞质中。

关键词： KIF2A 卵母细胞减数分裂微管组织中心纺锤体体外

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Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞纺锤体组装和稳定及中后期转换过程的研究

Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞纺锤体组装和稳定及中后期转换过...

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作者：朱秀兰南方医科大学

学位级别：博士

Synaptotagmin1(Syt1)作为钙离子感受器,与SNAP-25,syntaxin和synaptobrevin一起构成7S或者所谓的SNARE蛋白复合体,用于调节神经末梢胞膜与神经突触囊泡的锚定和融合,引起胞内钙离子浓度升高诱导神经囊泡内神经颗粒的胞吐发生。Syts是... 详细信息

Synaptotagmin1(Syt1)作为钙离子感受器,与SNAP-25,syntaxin和synaptobrevin一起构成7S或者所谓的SNARE蛋白复合体,用于调节神经末梢胞膜与神经突触囊泡的锚定和融合,引起胞内钙离子浓度升高诱导神经囊泡内神经颗粒的胞吐发生。Syts是由一组结构相关的家族蛋白组成,从脊椎动物到人类高度保守于各类组织中。Syt1和Syt2在神经组织丰富表达,尤其Syt1在神经和分泌囊泡膜富集,在外源刺激作用下,结合胞内钙离子诱导神经递质和分泌颗粒的胞吐。但是到目前为止,关于Syt1在生殖细胞中的功能研究很少,尤其与卵母细胞骨架相关。本课题中,我们深入地研究了Syt1在小鼠卵母细胞发育过程中的亚细胞定位及可能发挥的作用。免疫荧光标记证明Syt1定位主要集中分布在MⅠ和MⅡ期纺锤体的两极,这些可能与Syt1在小鼠卵母细胞成熟过程中所行使的功能有关,并且证实了Syt1在MⅠ和MⅡ期与中心体相关蛋白y-tubulin共定位。另外在卵母细胞各时期集中于皮质区、部分分散于胞浆,在MⅠ和MⅡ期皮质区有1/3靠近染色体的无定位区域(类似于卵母细胞皮质颗粒的分布特征),此亚细胞定位可能与Sytl对小鼠卵母细胞皮质颗粒的胞吐和受精功能有关(数据未列出)。紫杉醇处理卵母细胞后发现上述Sytl的定位与纺缍体的组装相关。紫杉醇试验后微管高度集中,在胞内产生很多星体,免疫荧光观察发现Syt1集中定位于星体和高度集中的微管两极。在小鼠卵母细胞内注射Syt1特定寡聚核苷酸(morpholino),它能与Syt1的mRNA或(和)DNA结合,特异性抑制其转录或(和)翻译,降调其表达水平,注射前后免疫印迹试验证实了这一点。降调Syt1表达后,我们发现纺缍体组装异常比例升高,且多数为无极、单极或者多极纺缍体,其次有拉长纺锤体和形态各异纺锤体；染色体排列异常；第一极体排出率下降,并影响微管组织中心相关蛋白γ-tubulin的正确定位。另外小鼠卵母细胞减数分裂进程受到阻碍,染色体铺片和纺锤体检验点蛋白试验发现Syt1降调后后期染色体相对于对照组染色体未能完成正确分离并激活了后期纺锤体检验点蛋白的活性,说明Sytl对小鼠卵母细胞减数分裂中后期转换进程起着重要的作用。为了进一步深入研究降调Sytl后引起的卵母细胞及其对分裂成熟进程影响的缺陷,‘我们向卵母细胞内注射了β5-tubulin-GFP mRNA, H2B-RFP mRNA和Syt1-MO的混合物,并应用活细胞工作站延时拍摄系统去捕捉纺缍体、染色体和卵母细胞分裂进程在降调了Syt1后的的动态变化。结果证实了降调Sytl会影响卵母细胞纺缍体的迁移,纺缍体极的形成和稳定；染色体阻滞在第一次分裂前中期或者中期(Pro-MI/MI);形态异常的纺锤体不能发挥正常功能,使染色体不能沿微管正常排列,导致卵母细胞不能完成中后期转换且反复分离失败和第一极体不能释放。总之,实验结果表明：Syt1在卵母细胞减数分裂成熟的不同阶段有不同的特异性定位,其定位主要集中分布在MⅠ和MⅡ期纺锤体的两极,这些可能与Syt1在纺锤体的组装和稳定、染色体的排列、减数分裂中后期转换和第一极体释放的作用有关,它可能作为一种微管组织中心蛋白监控纺锤体状态或者调控与纺锤体组装和稳定相关的蛋白；Syt1参与调控卵母细胞的减数分裂中第一次分裂中后期转换和第一极体的释放。另外在卵母细胞各时期集中于皮质区、部分分散于胞浆,而且在MⅠ和MⅡ期皮质区有1/3靠近染色体的无定位区域。这些亚细胞定位可能与Syt1对小鼠卵母细胞皮质颗粒的胞吐和受精功能有关(数据未列出)。本研究分两部分进行： [目的] 确定Syt1对小鼠卵母细胞纺缍体组装和稳定的影响。 [研究方法] 卵子的收集和培养本实验采用4-6周龄ICR品系雌性小鼠,断颈法快速处死小鼠后取出卵巢,盛于一次性培养皿中,用刀片将卵巢剁碎,释放出来停留在第一次减数分裂间期的未成熟卵母细胞。只将处于GV期的未成熟卵母细胞转移至M2培养滴中,清洗5-6次后,移至覆盖有矿物油的M16培养滴或者含有2.5gMmilrinone的M16培养滴,置于培养箱中培养(37℃,5%C02,95%湿度)。培养到不同时期后取出用于免疫印迹、免疫荧光及药物处理。 Taxol处理卵子用M16培养液稀释Taxol至10μmol/ml,待卵子发育至特定时期后,移至含Taxol的M16培养滴,于培养箱中孵育45分钟,之后,将卵母细胞彻底洗净用于免疫荧光实验。对照组中卵母细胞用相同浓度的DMSO进行处理。免疫荧光及激光共聚焦显微镜检测卵母细胞放入含4%多聚甲醛的PBS中室温30分钟。在室温下0.5%TritonX-100透膜20分钟,卵母细胞采用添加1%BS

关键词： Synaptotagminl 小鼠卵母细胞减数分裂微管组织中心纺锤体中后期转换

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一个与端粒结合蛋白TRF1相互作用的新蛋白 ——端粒相关中心体蛋白（TACP1）的鉴定及其生物学功能研究

一个与端粒结合蛋白TRF1相互作用的新蛋白 ——端粒相关中心体蛋...

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作者：蓝建平浙江大学

学位级别：博士

端粒是真核细胞染色体末端由DNA重复序列和多种结合蛋白组成的特殊保护性结构。染色体复制存在“末端复制问题”,即随着细胞分裂端粒逐渐缩短,当端粒缩短至一定长度时,细胞失去分裂增殖能力而衰老随后凋亡。端粒异常将导致染色体不稳定... 详细信息

端粒是真核细胞染色体末端由DNA重复序列和多种结合蛋白组成的特殊保护性结构。染色体复制存在“末端复制问题”,即随着细胞分裂端粒逐渐缩短,当端粒缩短至一定长度时,细胞失去分裂增殖能力而衰老随后凋亡。端粒异常将导致染色体不稳定,而染色体的不稳定性与细胞衰老和肿瘤密切相关。端粒酶是一种具有逆转录活性的核糖核蛋白酶复合物,端粒酶以自身RNA模板合成端粒重复序列添加于染色体末端以补偿因细胞分裂而缩短的端粒DNA序列。端粒酶是细胞维持端粒长度的最主要途径。正常人成体细胞不表达端粒酶活性,而85%以上肿瘤细胞和永生化细胞端粒酶活性明显增高,提示端粒酶在细胞永生化和肿瘤发生发展中起着重要作用。许多证据显示端粒长度和结构的维持及端粒酶活性受到一组端粒结合蛋白的调控。目前至少发现三组端粒结合蛋白:端粒双链DNA结合蛋白与相关蛋白、端粒单链DNA结合蛋白与相关蛋白及某些参与DNA损伤修复且也定位在端粒上的蛋白质。TRF1是以端粒序列[TTAGGG]27为探针用离子交换与亲和层析法分离纯化获得的第一个人端粒双链DNA结合蛋白。TRF1以同源二聚体形式与端粒双链DNA结合,促使端粒末端环状三级结构T-loop的形成,保护端粒末端。TRF1是端粒长度负调控因子,过量表达TRF1可抑制端粒酶活性并引起端粒缩短,而大量

关键词：端粒端粒结合蛋白 TRf1 TACP1 Tankyrasel 微管组织中心中心体纺锤体极体 Taz1 PcP1

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一个新的中心体蛋白TACP1被PLK1磷酸化修饰及其对中心体功能的调控

一个新的中心体蛋白TACP1被PLK1磷酸化修饰及其对中心体功能的调控

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作者：朱园园浙江大学

学位级别：博士

中心体是参与细胞有丝分裂的重要细胞器，是动物细胞中主要的微管组织中心，它影响了细胞内所有与微管相关的过程，它与双极纺锤体的形成、纺锤体的定位和胞质分裂直接相关。纺锤体数目的异常直接干扰了双极纺锤体的形成以及染色体的分... 详细信息

中心体是参与细胞有丝分裂的重要细胞器，是动物细胞中主要的微管组织中心，它影响了细胞内所有与微管相关的过程，它与双极纺锤体的形成、纺锤体的定位和胞质分裂直接相关。纺锤体数目的异常直接干扰了双极纺锤体的形成以及染色体的分离过程。因此在分裂细胞中，中心体的复制和分离必须与染色体的复制和分离过程相协调。在特定的细胞周期中，中心体只能分裂一次，中心体数目过多会导致多极纺锤体形成，出现错误的有丝分裂过程，从而直接导致染色体非整倍性的发生，染色体的不稳定性通常认为是引起肿瘤发生的主要机制。中心体上结合的蛋白超过一百种，75％具有coiled-coil结构域，至今仍有许多中心体蛋白质尚未被发现，它们的功能也不完全清楚。中心体蛋白质中有不少是重要的有丝分裂激酶，与细胞周期和调定点调控高度相关。目前公认的有丝分裂调控蛋白主要有CdK家族，Polo家族，Aurora家族，NIMA家族，TTK，Cep55，Bub1，BubR1等。PLK1(Polo-like Kinase 1)就是在脊椎动物中的一种PLK，隶属于Polo家族，是一种与细胞有丝分裂高度相关的激酶。PLK1可以特异性地磷酸化蛋白质的丝氨酸／苏氨酸，它通过磷酸化它的下游底物来放大调节它们的功能活性。PLK1蛋白质与PLK的其它蛋白质在结构上可以分为两部分：N端的激酶结构域(kinase domain)和C端的Polo盒结构域(PBD，polo-box domain)，PLK1通过PBD与其他蛋白质发生相互作用。它在进化中表现得相当保守，从酵母、果蝇、爪蟾到哺乳动物都有它的同源物。如果PLK1被敲除后会引起单级纺锤体，染色体排列异常，有丝分裂阻断等表型。另外PLK1在DNA损伤和调节细胞周期的各调定点也至关重要。本课题组在前一阶段的工作中利用端粒结合蛋白TRF1特异性抗体，通过免疫共沉淀结合蛋白质肽指纹谱技术从分裂期细胞裂解液中分离鉴定了一个TRF1新的相互作用中心体蛋白，将该蛋白命名为TACP1(Telomere Associated Centrosome Protein 1)。本研究是在此基础上对TACP1这个新的中心体蛋白功能展开，以期完善中心体蛋白网络中新蛋白TACP1的分子机制。本研究分为两个部分。第一部分：中心体蛋白TACP1与有丝分裂激酶PLK1相互作用和磷酸化调控的研究。本研究发现TACP1在细胞有丝分裂期能发生特异性磷酸化，通过免疫共沉淀后用质谱分析发现Thr221、Thr457是它的潜在磷酸化位点，而它们的磷酸化激酶可能分别是Nek2A和PLK1。随即通过免疫共沉淀和pull-down实验证实TACP1在体内、体外都能与PLK1形成复合物即两者之间存在相互作用，免疫荧光实验结果也显示它们在有丝分裂期共同定位于中心体。生化实验结果还提示PLK1与TACP1结合依赖于TACP1的羧基端。TACP1-C是PLK1的结合功能区，PLK1与TACP1结合并不依赖于TACP1的中心体定位功能域(TACP1-MC)。PLK1可以在体外条件下特异性磷酸化野生型TACP1，该实验还证实了PLK1激酶活性缺失型则无法磷酸化TACP1，模拟非磷酸化状态的TACP1457A突变型也无法被PLK1磷酸化，从而证实PLK1的确是TACP1蛋白457位苏氨酸的磷酸化激酶。当siRNA基因抑制内源性的PLK1后，TACP1稳定表达的Hela细胞G2／M期的细胞明显增多。我们推测TACP1得不到PLK1的磷酸化，过量非磷酸化的TACP1蛋白造成细胞无法通过G2／M调定点从而造成阻滞。为了深入探讨TACP1被PLK1磷酸化发生的时间空间信息，利用针对TACP1的457位苏氨酸磷酸化抗体进行免疫荧光实验，结果发现PLK1磷酸化TACP1发生于有丝分裂前期、前中期、中期，空间上位于中心体上。后期开始以后，TACP1在中心体上的信号就开始弥散削弱，末期时完全消失。siRNA基因干扰抑制PLK1表达导致TACP1无法定位于中心体，但如果仅抑制PLK1激酶活性，TACP1仍定位于中心体，因此TACP1的中心体定位依赖于PLK1而非PLK1的磷酸化作用。第二部分：TACP1对中心体功能的调控。为了探讨TACP1的功能，筛选建立了TACP1稳定表达的Hela细胞株。在此细胞株上进行免疫荧光实验，结果发现TACP1在细胞周期中的定位呈现出动态性，间期分布于胞质，部分共定位于F-actin，有丝分裂期则定位于中心体上。本研究主要立足于探讨TACP1在有丝分裂期的功能研究。利用互联网上的数据库，通过蛋白质序列比对发现TACP1与裂殖酵母中心体蛋白Pcp1同源。若用TACP1 siRNA干扰抑制内源性TACP1

关键词：中心体 TACP1 PLK1 微管组织中心纺锤体磷酸化有丝分裂激酶 Pcp1

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植物微管的列阵组织、转换及体外动态特性的分析

植物微管的列阵组织、转换及体外动态特性的分析

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作者：黄善金中国农业大学

学位级别：博士

植物微管动态对于植物细胞的分裂与分化以及形态建成起着非常重要的作用,但植物细胞内微管列阵的组织、转换和体外动态等许多问题亟待解决.本研究以烟草BY-2悬浮细胞、小麦和蒜根尖细胞以及百合花粉管为试验材料,对植物细胞微管列阵的... 详细信息

植物微管动态对于植物细胞的分裂与分化以及形态建成起着非常重要的作用,但植物细胞内微管列阵的组织、转换和体外动态等许多问题亟待解决.本研究以烟草BY-2悬浮细胞、小麦和蒜根尖细胞以及百合花粉管为试验材料,对植物细胞微管列阵的排列、转换、组织以及植物微管的体外动态特性进行了研究.论文首次实现了在无任何微管稳定剂存在条件下植物微管理蛋白体聚合,荧光显微镜和电子显微镜观察表明微管聚合形成典型的微管结构.经测定,在无任何微管稳定剂下百合花粉微管蛋白体外聚合的临界浓度为2.8mg/ml,高于报导的同样条件下动物微管的临界浓度.这可能是植物细胞内微管具更高的周转速率的原因之一.该文还首次在百合花蛋白上标记了罗丹明,并在烟草BY-2细胞核颗粒上实现了聚合,表明标记的百合花粉微管蛋白具有生物学活性,为进一步研究植物微管体内和体外动态提供了条件.

关键词：植物微管微管蛋白 γ-微管蛋白微管组织中心

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Kif2a调节小鼠卵母细胞纺锤体组装和减数分裂成熟进程的研究

Kif2a调节小鼠卵母细胞纺锤体组装和减数分裂成熟进程的研究

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作者：易子云南方医科大学

学位级别：博士

目的和意义:Kif2a作为微管解聚酶,在有丝分裂中的双极纺锤体的形成,染色体联会与分离,纺锤体极联合中起到重要作用。到目前为止,Kif2a是否参与减数分裂过程中调节纺锤体组装、染色体运动及分离等仍未知。本研究中,我们研究了 Kif2a在小... 详细信息

目的和意义:Kif2a作为微管解聚酶,在有丝分裂中的双极纺锤体的形成,染色体联会与分离,纺锤体极联合中起到重要作用。到目前为止,Kif2a是否参与减数分裂过程中调节纺锤体组装、染色体运动及分离等仍未知。本研究中,我们研究了 Kif2a在小鼠卵母细胞减数分裂过程中表达、定位和功能。方法:取6-8周ICR雌性小鼠的GV期卵母细胞体外培养;首先对各期卵母细胞进行免疫印迹检测Kif2a蛋白表达、免疫荧光检测Kif2a定位;接着用免疫荧光试验检测Taxol和Nocodazole处理后的中期卵母细胞,以明确Kif2a与微管动力的关系;对卵母细胞进行Kif2asiRNA显微注射,抑制其蛋白表达后采用染色体铺片、冷处理、免疫荧光、免疫印迹等方法研究其在减数分裂成熟中具体作用。三次独立重复的实验用平均数±标准差表示。用SPSS 17.0软件进行差异分析,采用独立样本T检验。P<0.05被定义为差异有显著统计学意义。用ZEN(2012)软件进行荧光强度数据分析。实验结果:一、Kif2a作为微管解聚酶调节减数分裂纺锤体的组装和染色体排列Western blot结果示:Kif2a在减数分裂成熟各时期均有表达,GV期表达水平较低,从GV期到MⅠ期逐渐上升,MⅡ期有所下降。免疫荧光显示:GV期Kif2a定位于生发泡内。GVBD后,Kif2a聚拢于染色体周围,且染色体着丝粒上检测到较弱信号。MⅠ期和MⅡ期,Kif2a主要定位于纺锤体,并于纺锤体两极及染色体着丝粒处富集。TⅠ期,Kif2a富集于细胞中体上。染色体铺片显示,MⅠ期和MⅡ期Kif2a信号位于染色体内着丝粒处。Taxol处理后,纺锤体微管蛋白高度聚集,并在胞内形成大量胞质星体。免疫荧光发现,Kif2a信号和α-tubulin信号出现重叠,且高度集中在异常的纺锤体极、胞质星体和着丝粒上。以上定位提示,Kif2a可能参与调控纺锤体组装和染色体运动。利用siRNA干扰Kif2a表达后,导致纺锤体严重缺陷(大多数为无极、单极,其次为多极和变宽的纺锤体);影响卵母细胞纺锤体向皮质迁移;并出现染色体排列异常(延迟分裂和完全排列异常的染色体)。γ-tubulin作为MTOC相关蛋白,是参与减数分裂中微管成束和纺锤体组装的重要蛋白。在Kif2a降调组,γ-tubulin从纺锤体的两极脱落且不规则散布于纺锤体微管或分散于胞浆中。由此推断,Kif2a可能参与纺锤体极聚集。冷处理后,在Kif2a降调组MⅠ期卵母细胞纺锤体中的α-tubulin荧光强度较强,显著高于对照组;说明Kif2a通过其微管解聚酶活性,发挥对微管的解聚作用,参与纺锤体组装调节。二、Kif2a参与小鼠卵母细胞减数分裂进程调控降调Kif2a影响纺锤体组装,引起小鼠卵母细胞第一次减数分裂Pro-MⅠ/MⅠ期阻滞、第一极体排出率下降、大极体排出率增加。我们进一步探究:染色体是否可以发生正确分离。染色体铺片发现,实验组同源染色体未分离;而对照组同源染色体已经分离,提示减数分裂已进入后期完成阶段。接下来研究了纺锤体检验点(SAC)的重要成分Bub3的分布。Kif2a降调组卵母细胞即使培养10小时,仍阻滞于Pro-MⅠ/MⅠ期,并在染色体上检测到Bub3信号,提示SAC被激活;而对照组卵母细胞进入AI期,且未检测到Bub3信号。CyclinB1的降解和MPF活性缺失是卵母细胞突破MI期进入后期的必要条件。我们将Kif2a降调组和对照组卵母细胞培养10小时,对CyclinB1进行免疫印迹检测。Kif2a降调后,CyclinB1水平较对照组显著升高,提示:Kif2a降调引起CyclinB1降解异常,从而引起中/后期转化受阻。将Kif2a降调组和对照组细胞培养8.5小时后进行鬼笔环肽-FITC染色发现,对照组染色体位于细胞边缘且检测到微丝帽形成。Kif2a降调组染色体位于细胞中央,未检测到微丝帽形成。可见Kif2a敲减引起微丝帽形成受损。结论:我们研究结果显示:Kif2a可能作为微管解聚酶和微管组织中心相关蛋白,在小鼠卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的组装与迁移、染色体排列、微丝帽形成和第一极体排出中起到重要作用。

关键词： Kif2a 小鼠卵母细胞减数分裂微管组织中心纺锤体中后期转换

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中心体异常与宫颈癌关系的研究进展

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广东医学 2010年第3期31卷 386-388页

作者：李云徐建平暨南大学附属第一医院妇产科广州510630

中心体作为哺乳动物细胞微管组织中心,在细胞分裂间期通过成核作用和微管的形成来维持细胞正常结构.双极纺锤体的形成是细胞有丝分裂中染色体均衡分离的必需条件,而中心体对双极纺锤体的形成起着关键作用.中心体的异常已经在越来越多的... 详细信息

中心体作为哺乳动物细胞微管组织中心,在细胞分裂间期通过成核作用和微管的形成来维持细胞正常结构.双极纺锤体的形成是细胞有丝分裂中染色体均衡分离的必需条件,而中心体对双极纺锤体的形成起着关键作用.中心体的异常已经在越来越多的恶性肿瘤细胞中被发现.然而关于中心体异常和宫颈癌的关系,国内外研究较少.本文主要对中心体异常与宫颈癌的关系进行综述.

关键词：中心体异常宫颈癌微管组织中心哺乳动物细胞细胞分裂间期细胞有丝分裂恶性肿瘤细胞正常结构

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非受体酪氨酸激酶对细胞功能的影响及其研究进展

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实用医学杂志 2015年第3期31卷 339-340页

作者：吴建楠宋萌上海交通大学附属第一人民医院口腔科 200080

非受体酪氨酸激酶是一个多功能的蛋白质,它通过与一系列的底物相互作用参与多种细胞生命活动,与细胞骨架、细胞凋亡和细胞周期等均有密切关系。本文就非受体酪氨酸激酶对细胞功能调控作用及其机制作一综述,希望对非受体酪氨酸激酶的生... 详细信息

非受体酪氨酸激酶是一个多功能的蛋白质,它通过与一系列的底物相互作用参与多种细胞生命活动,与细胞骨架、细胞凋亡和细胞周期等均有密切关系。本文就非受体酪氨酸激酶对细胞功能调控作用及其机制作一综述,希望对非受体酪氨酸激酶的生理功能有一个更加深入全面的了解。

关键词：细胞骨架鼠白血病病毒细胞周期原癌基因细胞生命同源基因激酶活性微管蛋白保守的微管组织中心

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