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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第9期28卷 828-832页

作者：程建平邹全明毛旭虎易勇王庆旭马颖徐州医学院附属淮安医院检验科 233002 第三军医大学临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038

目的研究肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力。方法将60只bALb／c小鼠平均分为5组，分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PbS对照组，用注射方式免疫3次，抗原和佐剂均为每次100μg／只。采集免... 详细信息

目的研究肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力。方法将60只bALb／c小鼠平均分为5组，分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PbS对照组，用注射方式免疫3次，抗原和佐剂均为每次100μg／只。采集免疫前和各次免疫后7d的小鼠血清检测抗体，末次免疫10d后以10^9CFU的O157全菌液经口感染小鼠。观察小鼠临床症状及死亡情况，检测粪便与肠道带菌情况，并作病理组织学检测。结果各抗原免疫组小鼠特异抗体明显增加，感染后各组小鼠均有死亡，IntiminC300、Stx2b、HlyAN436和联合免疫组保护率分别为73％、64％、36％和91％。未病死小鼠粪便排菌情况：对照组22d，实验组为5—14d。肠道带菌情况：对照组阳性率为100％，实验组为25％-83％。病死小鼠肺脏、肝脏均有明显组织病理学改变。结论IntiminC300、Stx2b和HlyAN436疫苗对于O157感染具有一定的预防作用，而联合免疫效果又大于单独免疫。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7 紧密黏附素志贺毒素ⅱb亚单位 EHEC溶血素基因工程疫苗

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肠出血性大肠杆菌O157：H7（EHEC O157：H7）基因工程多亚单位融合蛋白疫苗的实验研究

肠出血性大肠杆菌O157：H7（EHEC O157：H7）基因工程多亚单位融...

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作者：刘艳青第三军医大学

学位级别：硕士

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC ) O157:H7(本文简称O157)是一种重要的人畜共患传染病病原菌。自1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患... 详细信息

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC ) O157:H7(本文简称O157)是一种重要的人畜共患传染病病原菌。自1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),还可在5～10%的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。然而目前对其感染仍缺乏有效的防治方法,研究证明:抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx),从而使患者并发HUS的危险性增加。由于O157的暴发流行和治疗上的困难,疫苗成为预防和控制O157感染最简单、经济、快捷的手段,发展有效的O157疫苗就显得亟为紧迫。由于O157菌体抗原成份复杂,含有多种致病因子,且与普通大肠杆菌有大量的共同抗原,易引发不良反应,使O157全菌疫苗研究和应用受到限制。随着基因工程技术的成熟,亚单位基因工程疫苗将成为O157疫苗研究的主攻方向。 Ⅲ型分泌蛋白A (E. coli secreted protein A,EspA)、紧密粘附素(Intimin)及志贺毒素ⅱb亚单位(Shiga like toxinⅡb subunit, Stx2b)为O157的重要保护性候选抗原,本课题在本实验室前期对它们研究的基础上,构建EspA、IntiminC端免疫保护性片段及Stx2b的融合基因;并通过原核表达系统制备多亚单位融合蛋白;纯化目的蛋白后对balb/c小鼠进行免疫后攻毒保护实验,评价该疫苗的免疫保护率,为多亚单位O157疫苗的研制提供实验依据。本实验完成了以下几个方面的工作: 1. espA -eaeC300(EI)融合基因的构建、表达、纯化及部分生物学性质研究。 1.1采用PCR法自O157菌基因组扩增EspA的编码基因espA和IntiminC300的编码基因eaeC300。通过基因重组技术构建融合基因espA-eaeC300,酶切、测序证实与预期序列完全一致。阳性重组子转化大肠杆菌bL21(DE3)后,IPTG诱导表达,目的蛋白表达率约40%,SDS-PAGE分析目的蛋白的分子量约54KD,超声破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。Western blotting显示融合蛋白EI具有与EspA和IntiminC300兔多抗血清的免疫反应性。目的蛋白经包涵体洗涤和亲和层析纯化后纯度为90%,免疫家兔获得了双扩效价为1:32的多抗血清。 1.2重组融合蛋白EI生物学作用研究: 1.2.1 EHEC O157体外粘附细胞模型建立。选用培养简单、生长周期较短、贴壁生长的HeLa细胞,将O157接种于HEPES-DMEM液体培养基内,培养至对数生长期(OD600nm≈0.6),然后将贴壁生长在盖玻片上的HeLa细胞与细菌于37℃、5%CO2共同孵育4h,姬姆萨染色及电镜观察。结果显示O157菌与HeLa细胞呈聚集性粘附。 1.2.2采用EI兔抗血清与细菌预中和及细菌与抗体同时加入方法,与HeLa细胞粘附,用PbS洗去未粘附细菌,胰酶消化细胞,倍比稀释后接种Lb平板,计数单菌落,统计学分析EI兔抗血清阻断粘附的效果。结果显示:抗体预先中和的O157菌与抗体同时加入的O157菌没有显著性差异(P>0.05),表明EI多抗血清不能阻断细菌与细胞的粘附。 1.2.3用EI兔抗血清作为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG作为二抗,检测O157菌与HeLa细胞的粘附。结果显示:EI兔抗血清可以与天然O157菌发生抗原抗体反应。 1.2.4 FAS(Fluorescent actin staining )试验检测EI兔抗血清阻止O157菌与HeLa细胞间粘附和擦拭性(attaching and effacing, A/E)损伤的效果。结果显示:EI兔抗血清可以影响O157菌对HeLa细胞造成的A/E损伤。 2. espA -eaeC300-stx2b (EIS)融合基因的构建、表达与纯化采用重叠延伸PCR的方法,EI为融合基因的前端,通过linker GSGGSG与stx2b相连接,从而获得融合基因EIS;将融合基因构建在原核表达载

关键词：肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7 Ⅲ型分泌蛋白A 紧密粘附素志贺毒素ⅱb亚单位融合蛋白疫苗

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肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA蛋白的重组表达及生物学作用研究

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA蛋白的重组表达及生物学作用研究

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作者：王庆旭第三军医大学

学位级别：硕士

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC) O157:H7是一种重要的传染病病原菌。自1975年首次被分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可致腹泻、出血... 详细信息

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC) O157:H7是一种重要的传染病病原菌。自1975年首次被分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染可致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),还可引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症,严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成为全球性的公共卫生问题。然而目前对其感染仍缺乏有效的防治方法,研究证明抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx),从而使患者并发HUS的危险性增加。病原体和宿主的相互作用是决定感染及发病的关键。EHEC与宿主肠道粘膜上皮细胞的粘附是疾病发展的第一步。介导O157细菌粘附定植的主要结构单元是Ⅲ型分泌系统(type-III secretion system,TTSS)。Ⅲ型分泌蛋白EspA(Esp为E. coli secreted protein缩写)在细菌表面形成针状扩展结构,这种结构是绕过细胞微绒毛和粘膜层必不可少的转移装置,它在细菌和宿主细胞之间架起一座桥梁,多种分泌蛋白及Tir被转移至宿主细胞。效应蛋白的转入促使O157紧密粘附至宿主细胞,引起肌动蛋白重排与聚集,导致宿主细胞发生病理改变,形成A/E(attaching/effacing)损伤。EspA不仅在细菌粘附中发挥关键性的起动作用,也在形成A/E损伤的效应分子传递中起到桥梁作用。因此研究EspA的生物学功能及其在粘附定植中的作用对阐明O157的致病机理,寻找预防、控制和治疗O157感染的手段具有重要意义。基于以上认识,本实验从以下几个方面对肠出血性大肠杆菌O157 EspA生物学功能进行了研究,取得了以下结果: 1. O157 EspA的克隆表达。采用PCR法自O157菌基因组扩增编码EspA的约580bp全长基因,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA,经酶切、测序证实与预期序列完全一致。阳性重组子转化*** bL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白表达率约40%,PAGE电泳初步测

关键词：肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 生物学作用大肠杆菌分泌蛋白A 志贺毒素ⅱb亚单位 EspA-Stx2b融合蛋白细胞粘附模型

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肠出血性大肠杆菌O157：H7（EHEC O157：H7）基因工程双亚单位融合蛋白疫苗的实验研究

肠出血性大肠杆菌O157：H7（EHEC O157：H7）基因工程双亚单位融...

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作者：易勇第三军医大学

学位级别：硕士

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7是一种重要的新发传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157：H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colit... 详细信息

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7是一种重要的新发传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157：H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis, HC)，还可在5～10％的病例中引发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome, HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。EHEC O157的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。目前EHEC O157：H7的全基因组测序已经完成，但对其感染仍缺乏有效的防治方法，研究证明：抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Stx)，从而使患者并发HUS的危险性增加。人类同传染病斗争的历史表明，疫苗是人类战胜传染病的有力武器。由于O157的暴发流行和治疗上的困难，疫苗研究就显得尤其紧迫。 O157：H7及其它出血性大肠杆菌的致病性主要体现于细菌的粘附定植和产生毒素两个方面。紧密粘附素(Intimin)介导细菌与肠上皮细胞的紧密粘附，是O157最主要的定植因子，尤其是它的C端1／3部分(Intimin-C)为胞外功能区，与相应受体结合，且具有良好的免疫原性和免疫保护性，是理想的疫苗备选抗原。 EHEC O157主要产生两种毒素，分别称为志贺毒素Ⅰ(Stx1)和志贺毒素Ⅱ(Stx2)。在细菌体内，Stx2为分泌型表达，Stx1为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个b亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28S rRNA作用从而抑制蛋白质合成，是大肠杆菌O157：H7引起临床表现的病理基础；b亚单位具有细胞结合特性，能与具有特定受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用。多数O157：H7细菌产生Stx2，而且Stx2毒性强于Stx1，与溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)等严重并发症的相关性更为密切。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基础。Paola Marcato等克隆表达了志贺毒素Ⅱ结合亚单位(Stx2b)并探索了其免疫保护性，发现Stx2b无毒，且具有良好的免疫保护性，针对Stx2b的单克隆抗体具有阻断毒素的作用。Nacilla H等人研究提示，痢疾志贺菌志贺毒素b亚单位(stxb)因能与具有Gb3受体的抗第三军医大学硕士学位论文原递呈细胞—树突状细胞(dendritic cells，DC)结合，有助于疫苗抗原的递呈和诱导细胞及体液免疫应答，显示了良好的免疫佐剂活性。与Stxb亚单位结构功能类似，且结合受体一致的StxZb是否具有佐剂作用就很值得探讨。基于以上认识，本实验拟从以下几个方面进行肠出血性大肠杆菌0157:H7(EHEc 0157:H7)紧密粘附素免疫保护性片段(玩ti而nC300)及其与StxZb融合蛋白基因工程疫苗的实验研究。 1.对 0157:H7的IntiminC300进行基因克隆表达、初步纯化和动物免疫试验。设计引物采用PCR法自0 1 57菌基因组扩增Inti而nC3OO的编码基因eae一e300，T一A克隆后构建原核表达质粒pET一28a(+)一eaeC300，经测序鉴定后转化*** bLZI(DE3)，IPTG 诱导表达，队GE电泳检测。目的蛋白经包涵体洗涤和阴离子交换柱初步纯化后免疫家兔。结果显示PCR法自0 157菌基因组扩增出了约900bP的目的片段;原核表达质粒pET一28a(+)一eaeC经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化*** bLZI(D E3)后 IPTG诱导目的蛋白表达率约30%;PAGE电泳初步测定目的蛋白的分子量约35KD，破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。经包涵体洗涤和阴离子交换柱初步纯化后目的蛋白纯度>80%，免疫家兔获得了较高效价的多抗血清，双扩效价为1:16，与O巧7菌的凝集效价达到1:128。 2.对O巧7:H7的StxZb进行基因克隆表达。同上设计引物采用PCR法自O巧7

关键词：肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 紧密粘附素志贺毒素ⅱb亚单位 Stx2b-IntiminC30O双亚单位融合蛋白疫苗免疫保护

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