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解放军医学杂志 2017年第8期42卷 692-697页

作者：齐江莉蔡钟奇董颖陈韵岱李泱解亚楠李旺曹雪滨河北北方学院研究生院河北张家口075000 解放军总医院心内科北京100853 解放军252医院心内科河北保定071000

目的观察应激状态下大鼠心肌细胞快激活延迟整流钾电流(I_(Kr))的改变。方法 40只雄性SD大鼠随机分为4组(n=10):对照组、力竭组、噪声组、复合组。力竭组采用力竭游泳作为应激原,噪声组采用白噪声作为应激原,复合组采用力竭游泳+白噪声... 详细信息

目的观察应激状态下大鼠心肌细胞快激活延迟整流钾电流(I_(Kr))的改变。方法 40只雄性SD大鼠随机分为4组(n=10):对照组、力竭组、噪声组、复合组。力竭组采用力竭游泳作为应激原,噪声组采用白噪声作为应激原,复合组采用力竭游泳+白噪声作为应激原,分别制备应激动物模型。采用Langendorff装置逆向灌流胶原酶分离大鼠心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录应激对大鼠单个心室肌细胞I_(Kr)电流和门控机制的影响。结果与对照组相比,力竭组和噪声组大鼠心室肌细胞I_(Kr)尾电流(I_(Kr,tail))密度均明显增加(P<0.01),而复合组大鼠心室肌细胞I_(Kr,tail)密度与力竭组和噪声组相比明显增加(P<0.01),且作用呈电压依赖性。门控机制研究发现力竭组、噪声组及复合组与对照组相比均可以使I_(Kr,tail)半失活电压(V_(1/2,inact))右移,同时使失活后恢复时间常数缩短(P<0.01)。同时,与对照组相比,力竭组、噪声组及复合组对I_(Kr,tail)的稳态激活、快速失活常数及其电压依赖性影响差异均无统计学意义。结论应激刺激可增加大鼠心肌细胞I_(Kr)电流,可能是应激诱发心律失常的细胞电生理基础之一。

关键词：应激刺激心律失常快激活延迟整流钾电流膜片钳技术

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苄基四氢巴马汀对豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流的作用(英文)

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药学学报 2002年第8期37卷 603-607页

作者：李泱傅丽英姚伟星夏国瑾江明性华中科技大学同济医学院同济医院心内科湖北武汉430030 华中科技大学同济医学院药理教研室湖北武汉430030

目的　研究苄基四氢巴马汀 (BTHP)对心室肌细胞快激活 (Ikr)延迟整流钾电流的作用。方法用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞钾离子通道电流。结果　BTHP在 1～ 10 0 μmol·L-1以浓度依赖性方式阻滞Ikr,其IC50 为 13 5 μmol... 详细信息

目的　研究苄基四氢巴马汀 (BTHP)对心室肌细胞快激活 (Ikr)延迟整流钾电流的作用。方法用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞钾离子通道电流。结果　BTHP在 1～ 10 0 μmol·L-1以浓度依赖性方式阻滞Ikr,其IC50 为 13 5 μmol·L-1(95 %可信范围 :11 2～ 15 8μmol·L-1)。 30 μmol·L-1BTHP可使Ikr及Ikr,tail分别降低 (31± 4 ) %和 (36± 5 ) % (n =6 ,P <0 0 1)。与多数III类抗心律失常药物不同 ,BTHP可频率依赖性地抑制Ikr。该药主要改变Ikr的失活过程 ,可使Ikr的失活时间常数 (τ)从 (2 38± 16 )ms降至 (196± 14 )ms ,而对Ikr的激活动力学影响不大。结论　BTHP对Ikr有明显的抑制作用。

关键词：苄基四氢巴马汀快激活延迟整流钾电流膜片钳心室肌细胞

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PKCα亚型中介α1A肾上腺素受体下调快激活延迟整流钾电流及其机制

PKCα亚型中介α1A肾上腺素受体下调快激活延迟整流钾电流及其机制

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作者：刘雪莉河北医科大学

学位级别：博士

哺乳类动物心室肌细胞延迟整流钾电流包括快、慢激活两种成分,其中负责快激活成分IKr的通道孔区亚单位由hERG(human ether-a-go-go-related gene)基因编码,hERG通道的激活引发动作电位3期复极的开始,对心肌的复极化有重要作用。h ERG基... 详细信息

哺乳类动物心室肌细胞延迟整流钾电流包括快、慢激活两种成分,其中负责快激活成分IKr的通道孔区亚单位由hERG(human ether-a-go-go-related gene)基因编码,hERG通道的激活引发动作电位3期复极的开始,对心肌的复极化有重要作用。h ERG基因突变是引发离子通道病的遗传分子基础。此外,疾病状态下,如高血压、冠心病、心肌缺血等引发的心肌肥厚和心衰以及糖尿病等,均伴有IKr下调,是造成获得性LQT综合征的重要原因。越来越多的证据表明,同其它细胞功能一样,磷酸化是调节hERG通道功能进而影响心肌电生理特性的有效方式,其中催化磷酸化反应的蛋白磷酸激酶C(protein kinase C,PKC)家族对hERG通道的调控备受关注。PKC依据它们的结构和激活的机制分为3类:即传统型PKC(cPKC,包括α、βI、βII和γ),为Ca2+依赖性的,被二脂酰甘油(DAG)、磷脂酰丝氨酸(PS)激活;新型PKC(nPKC,包括δ、ε、π和θ),为非Ca2+依赖性,被DAG和PS激活;非典型PKC(aPKC,包括ζ、?/λ),为非Ca2+依赖性,被PS激活。已知心肌细胞存在多种PKC亚型,可催化膜离子通道蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化,是神经体液因素调控通道功能的关键中介物。实验显示,缺血缺氧、血管紧张素II、氧化应激(H2O2)等不同病理刺激可激活心肌不同的PKC亚型,而不同PKC亚型可能对离子通道发挥不同的调节作用,如Makary等发现不同的PKC亚型对乙酰胆碱激活的K+通道存在激活与抑制两种不同的调控作用。有研究表明,?1A肾上腺素受体激活对hERG钾通道呈现急性下调作用,我们的前期研究发现Ang II激动AT1受体同样对hERG通道发挥急性抑制作用。AT1受体与?1A肾上腺素受体同属于Gq蛋白偶联受体,而PKC是受体激活后调控通道的主要中介分子。然而,二者对通道抑制的方式表现不同,激动?1A肾上腺素受体使通道激活曲线右移,而AT1受体激动并不影响通道的电压依赖性激活。由此我们推测,两种不同的Gq蛋白偶联受体可能通过不同的PKC亚型对通道发挥抑制作用。为验证以上假设,本研究主要采用全细胞膜片钳技术和westernblot技术,探索?1a肾上腺素受体激动剂a61603对豚鼠心室肌细胞以及异源表达系统hek293细胞上ikr/herg电流的影响。利用pkc亚型选择性抑制剂(抑制肽)以及激活肽,分析其中介的pkc亚型,并同angii对herg通道的调控作用相对比。同时利用磷酸化位点突变通道分析不同pkc亚型对通道调控的分子机制。第一部分?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制心室肌细胞ikr目的:观察选择性?1a肾上腺素受体激动剂a61603对成年豚鼠心室肌细胞快激活延迟整钾电流ikr的影响,分析中介其作用的pkc亚型。方法:在急性分离的豚鼠心室肌细胞上,全细胞膜片钳技术记录ikr,观察a61603对电流影响。结果:(1)a61603以浓度依赖的方式抑制ikr,ic50是300nm。在激活电压为+40mv时,a61603(1μm)作用10分钟ikr电流密度由对照组的0.93±0.04pa/pf下降至0.62±0.07pa/pf(p<0.01)。(2)选择性?1a肾上腺素受体抑制剂wb4101,以及pkc非选择性抑制剂bis-1明显减弱a61603对ikr的抑制作用,而pka非选择性抑制剂h89对其作用无显著影响。表明a61603激动?1a肾上腺素受体主要通过pkc途径抑制ikr。(3)pkc选择性抑制剂g?6976(抑制pkc?,?,?)与g?6983(抑制pkc?,?,?,δ,ζ)以及pkc?选择性抑制肽?c2-4明显减弱a61603对ikr的抑制作用,特异性pkcε抑制肽εv1-2无此作用。表明a61603激动?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制ikr。小结:在急性分离的豚鼠心室肌细胞上,a61603激动?1a肾上腺素受体对ikr产生急性抑制作用,这种抑制作用主要由pkc?介导。第二部分不同pkc亚型对herg电流的调节作用目的:在异源表达系统hek293细胞上研究pkc亚型激活肽对herg电流的作用,同时验证?1a肾上腺素受体激动对herg电流的调控作用,进一步验证?1a肾上腺素受体激动通过pkc?亚型抑制herg电流。方法:在共表达herg和人?1a肾上腺素受体基因的hek293细胞上,全细胞膜片钳技术记录herg电流,观察a61603及pkc亚型激活肽对电流影响,其中a61603为细胞外灌流给药方式,而pkc亚型激活肽采用细胞内电极内液给药方式。结果:(1)cpkc激活肽(cpkc-ap)与pkcε激活肽(ε-ap)均急性抑制herg电流。cpkc-ap对herg通道的半数激活电压v1/2由对照组的-18.6mv

关键词： α1A肾上腺素受体快激活延迟整流钾电流 IKr hERG PKC亚型

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I_(Ks)复极储备下调对心肌肥厚豚鼠室性心律失常发生的影响

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中南大学学报（医学版） 2018年第4期43卷 428-433页

作者：汪和贵黄霆王政葛楠楠柯永胜皖南医学院附属弋矶山医院心血管内科安徽芜湖241001

目的:观察心肌肥厚时快激活延迟整流钾电流(rapidly activated delayed rectifier potassium channel,I_(Kr))和慢激活延迟整流钾电流(slowly activated delayed rectifier potassium channel,IKs)的变化,并探讨I_(Kr)和IKs阻断剂对心肌肥厚豚鼠室性心律失常发生的影响。方法:豚鼠分为假手术组和左心室肥厚(left ventricular hypertrophy,LVH)组,制备LVH模型。采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞I_(Kr)和IKs电流,观察I_(Kr)和IKs电流的变化;给予豚鼠分别静脉注射I_(Kr)阻断剂多非利特(0.04 mg/kg)和IKs阻断剂chromanol 293B(0.1 mg/kg),观察其对LVH豚鼠QTc及室性心律失常发生的影响。结果:豚鼠胸主动脉缩窄6周后,与假手术组相比,室间隔厚度,左室后壁厚度,QTc间期和细胞电容显著增加(P<0.05或P<0.01);LVH心室肌细胞IKs明显减少[+60 m V:(0.36±0.03)p A/p F vs(0.58±0.05)p A/p F,P<0.01];LVH对I_(Kr)无明显影响。I_(Kr)阻断剂可显著延长LVH豚鼠QTc间期(P<0.01),并增加室性心律失常的发生。IKs阻断剂对LVH豚鼠QTc间期及室性心律失常的发生无明显影响。结论:IKs复极储备下调是心肌肥厚诱发室性心律失常的重要机制之一。

关键词：心肌肥厚快激活延迟整流钾电流慢激活延迟整流钾电流复极储备室性心律失常

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桂枝甘草汤对豚鼠心室肌细胞IKs及HEK293细胞IKr的影响

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中医杂志 2023年第7期64卷 729-735页

作者：邢作英王永霞朱明军胡宇才陈召起高原宋欢欢邱伯雍河南中医药大学河南省郑州市450000 河南中医药大学第一附属医院河南省人民医院/郑州大学人民医院

目的探讨桂枝甘草汤治疗心律失常的可能作用机制及配伍意义。方法30只SD大鼠随机分为桂枝组(桂枝单煎液120 mg/ml)、甘草组(甘草单煎液60 mg/ml)、桂枝甘草单煎液混合组(桂枝单煎液+甘草单煎液混合180 mg/ml)、桂枝甘草汤同煎液组(桂枝... 详细信息

目的探讨桂枝甘草汤治疗心律失常的可能作用机制及配伍意义。方法30只SD大鼠随机分为桂枝组(桂枝单煎液120 mg/ml)、甘草组(甘草单煎液60 mg/ml)、桂枝甘草单煎液混合组(桂枝单煎液+甘草单煎液混合180 mg/ml)、桂枝甘草汤同煎液组(桂枝和甘草同煎液180 mg/ml)、对照组(生理盐水),每组6只。各组每天灌胃相应药物1 ml/100 g,3天后腔静脉取血制备含药血清。分离豚鼠心室肌细胞,设桂枝血清组、甘草血清组、桂枝甘草单煎液混合血清组、桂枝甘草汤同煎液血清组、对照血清组,每组5个复孔;各组以体积比分别加入10%和15%浓度含药血清,培养24 h后分别检测各组在0、20、30、40、50 mV条件下慢激活延迟整流钾电流(IKs)电流密度。HEK293细胞分组及干预方法同心室肌细胞,培养24 h后分别检测各组在0、20、30、40、50 mV条件下快激活延迟整流钾电流(IKr)尾电流密度及IKr尾电流动力学参数(包括激活半电压、斜率因子)。结果在10%浓度药物干预下,0、20、30、40、50 mV时各组IKs电流密度比较差异均无统计学意义(P>0.05),20、30、40、50 mV时各组IKr尾电流密度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在15%浓度药物干预下,与对照血清组比较,甘草血清组和桂枝甘草单煎液混合血清组各电压IKs电流密度均降低,桂枝血清组30、40、50 mV时IKs电流密度降低,桂枝甘草汤同煎液血清组50 mV时IKs电流密度降低(P<0.05);桂枝甘草汤同煎液血清组各电压IKr尾电流密度均降低,桂枝甘草单煎液混合血清组50 mV时IKr尾电流密度降低,甘草血清组0 mV时IKr尾电流密度升高(P<0.05)。在15%浓度药物干预下,与甘草血清组比较,桂枝甘草汤同煎液血清组30 mV时IKs电流密度升高,各电压IKr尾电流密度均降低(P<0.05);与桂枝血清组比较,桂枝甘草汤同煎液血清组30、40、50 mV时IKr尾电流密度降低(P<0.05)。与对照血清组比较,在10%药物浓度干预下,各组IKr尾电流激活半电压均减小(P<0.05);在15%药物浓度干预下,各组IKr尾电流激活半电压均减小(P<0.05),甘草血清组、桂枝血清组斜率因子减小(P<0.05)。结论桂枝甘草汤可在一定程度上抑制心室肌细胞IKs及HEK293细胞IKr,这可能是其治疗心律失常的作用机制之一,且方中桂枝和甘草配伍具有协同增效的作用。

关键词：心律失常桂枝甘草汤心室肌细胞 HEK293细胞慢激活延迟整流钾电流快激活延迟整流钾电流

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西红花苷对心肌细胞离子通道调控作用的研究

西红花苷对心肌细胞离子通道调控作用的研究

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作者：刘涛河北医科大学

学位级别：硕士

西红花（Crocus sativus L）在临床上的应用已有几千年的历史,具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效。常被用于治疗经闭症瘕、产后瘀阻、温毒发斑、忧郁痞闷、惊悸发狂等症。现代《中药大辞典》载其“活血化瘀、解郁开结之功效,主治... 详细信息

西红花（Crocus sativus L）在临床上的应用已有几千年的历史,具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效。常被用于治疗经闭症瘕、产后瘀阻、温毒发斑、忧郁痞闷、惊悸发狂等症。现代《中药大辞典》载其“活血化瘀、解郁开结之功效,主治胸膈痞闷、忧思郁结、吐血、伤寒发狂、惊悸恍惚、妇女经闭、产后瘀血腹痛、跌扑肿痛。”西红花中含有150多种化合物,其中西红花苷（crocin）是其主要有效成分之一。近年来,越来越多的研究表明,西红花苷具有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、增强记忆、抗粥样动脉硬化及神经和心脏保护作用。实验研究证明,西红花苷具有抑制豚鼠心肌收缩的药理作用。钙通道电流是细胞动作电位的重要电流,在形成动作电位的平台期和兴奋-收缩偶联方面起重要作用。L型钙通道（L-type calcium channel,LTCCs）主要存在于肌细胞和分泌细胞中。心肌细胞的收缩是由于心肌细胞的兴奋而引起LTCC的开放,外钙内流,胞质内钙离子浓度升高,并通过钙诱导钙释放（CICR）的方式使肌质网在短时间内释放大量钙离子,从而引起心肌收缩。在病理状态下,触发钙释放则会导致心肌细胞舒张期钙浓度过高,从而形成钙超载,引起心律失常和细胞损伤。因而,钙拮抗剂的作用就是降低心肌细胞内钙浓度以改善心肌细胞的正常生理功能。电压门控性钾通道参与调解动作电位,并起到重要作用。其中延迟整流钾电流是引起心肌细胞动作电位复极的主要的外向钾电流,分为快速激活延迟整流钾电流(the rapid component of IK,IKr)和慢速激活延迟整流钾电流(the slow component of IK,IKS)。研究显示,能够诱导引发QT间期延长的药物均能在不同程度上阻断IKr。并且由于药物与心肌细胞钾离子通道蛋白的相互作用,IKr的阻滞还会引起长QT间期综合征（long QT syndrome,LQTS）。近来,制药工业普遍通过研究药物对IKr通道的作用来评价新药致心律失常的风险。近年来,尽管有文献表明crocin具有心肌保护作用,但是crocin对心肌细胞上的钙电流,延迟整流钾电流,钙瞬变和收缩力的影响的研究还未见报道。我们推测crocin是通过阻断LTCCs发挥心肌保护的作用。目的:观察crocin对心肌细胞上的钙电流,延迟整流钾电流,钙瞬变和收缩力的影响,以探究其心肌保护作用的细胞学机制。方法:通过膜片钳技术（Patch-clamp）和细胞收缩与离子浓度同步测量系统（Ion Optix）,观察crocin对大鼠急性分离的心肌细胞钙电流,钙瞬变及细胞收缩的影响。用Patch-clamp观察crocin对表达在HEK293细胞上的IKs和IKr的影响。结果:1心室肌细胞钙电流(ICa-L)的确定全细胞电压钳模式下,将钳制电压设置为-80 mv,施以-80 mv去极化至0 mv,持续200 ms,频率为0.5 Hz的去极化脉冲,记录到ICa-L。当电流稳定后,用含0.01 m M的尼卡地平（Nicardipin,Nic）的台氏液灌流,电流基本被阻断（P<0.01）,说明所测电流为钙电流。用含0.1 mM的氯化镍（NiCl2）的台氏液灌流,电流基本没变化吗,说明这些电流不是T型钙电流,用含0.01 m M的维拉帕米（Verapamil,Ver）的台氏液灌流基本阻断电流（P<0.01）,说明记录的是L型钙电流（n=5-7）。2 Crocin对心室肌细胞ICa-L的抑制作用300μM的crocin可以明显抑制钙电流。细胞外液冲洗后,钙电流可部分恢复到给药前水平。通过连续给六个不同浓度的crocin（1,3,10,30,100和300μM）后发现crocin浓度依赖性的抑制钙电流,抑制率分别为9.53±0.87%,13.04±1.03%,29.66±1.5%,39.11±1.85%,60.23±1.90%和72.20±1.54%（n=9-12）。3 Crocin对ICa-L电流-电压（I-V）关系曲线的影响通过绘制给药前,给三个浓度的crocin（3,30和300μM）以及0.01m M的维拉帕米的I-V关系曲线,发现曲线随crocin浓度的增加而逐步上移,说明crocin浓度依赖性的抑制ICa-L。然而I-V关系以及反转电位并没有明显变化。4 Crocin对心室肌细胞ICa-L稳态激活和失活曲线的影响通过绘制给药前及给不同浓度的crocin（3和30μM）后,心室肌细胞ICa-L的稳态激活和失活曲线,发现crocin对ICa-L的稳态激活和失活无显著性的作用。给药前以及各浓度crocin的激活曲线的半最大激活电压（V1/2）/斜率因子（k）分别为-10.93±0.66 m V/7.04±0.59,-8.75±0.59m V/7.23±0.53,-6.88±

关键词：西红花苷 L型钙电流心肌收缩钙瞬变慢激活延迟整流钾电流快激活延迟整流钾电流

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丹参酸A对心肌细胞离子通道以及收缩力的调控作用

丹参酸A对心肌细胞离子通道以及收缩力的调控作用

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作者：宋琼涛河北医科大学

学位级别：硕士

L-型钙离子通道(L-type calcium channels,LTCCs)介导并调控Ca2+进入细胞,对心肌细胞的正常生理功能有重要的意义。LTCCs主要分布于肌纤维膜上,能够被去极化电压所激活,同时内流的Ca2+则能引起通道失活关闭。L-型钙离子电流(L-type calc... 详细信息

L-型钙离子通道(L-type calcium channels,LTCCs)介导并调控Ca2+进入细胞,对心肌细胞的正常生理功能有重要的意义。LTCCs主要分布于肌纤维膜上,能够被去极化电压所激活,同时内流的Ca2+则能引起通道失活关闭。L-型钙离子电流(L-type calcium current,ICa-L)不仅在心肌的兴奋-收缩耦联中起着极为重要的作用,同时参与心肌动作电位的形成和维持并与心律失常的发生有关。钙通道阻滞剂能够抑制心肌细胞Ca2+内流,降低细胞内钙,减弱心肌收缩力,降低心肌氧耗量,在临床上可用于高血压,冠心病,急性左心衰等病症。慢激活延迟整流钾电流(the slowly activating delayed rectifier potassium current,IKs)和快激活延迟整流钾电流(the rapidly activating delayed rectifier potassium current,IKr)在心肌动作电位的复极化过程中发挥重要作用。当电学重构或基因突变导致IKs和IKr通道功能异常时,将引起K+外流减少,使心肌复极减慢,动作电位延长,产生Q-T间期延长综合征(Long QT syndrome,LQTS),表现为心电图Q-T间期延长并发生恶性心律失常性晕厥及猝死。IKs和IKr抑制剂则可能导致Q-T间期延长而引发心律失常。丹参(Salvia miltiorrhiza)在中国有几千年的临床应用历史,它被广泛用于治疗高血压,冠心病,心肌梗塞,血液循环疾病和其他的心血管疾病。越来越多的研究表明,丹参主要的水溶性成分为丹参酸A(Salvianic acid A,SAA),具有多种药理学活性,如抗炎和抗肿瘤,神经和心肌保护作用,提高免疫力等。在前期的工作中,我们发现丹参注射液可以阻断LTCCs,SAA作为丹参注射液主要的成分之一,可能是丹参注射液阻断LTCCs发挥心肌保护作用的物质基础。目的:本研究主要探讨了SAA心脏保护作用的机制。通过电生理膜片钳技术观察SAA对大鼠心室肌细胞LTCCs以及HEK293细胞上表达的KCNQ1/KCNE1、h ERG通道电流的调控作用,通过Ion Optix测量系统观察SAA对大鼠心室肌细胞收缩力的影响。方法:(1)成年大鼠心室肌细胞分离成年雄性Sprague-Dawley大鼠麻醉后开胸取出心脏进行急性分离,心脏在Langendorff装置上用含0.02%胶原酶II的无钙台氏液在37°C下进行酶解消化。酶消化完毕后自左心室分段剪取心室肌组织放入盛有Kreb’s(KB液)的试管中轻轻吹打使之分散成单个细胞。单个心肌细胞通过200目尼龙网过滤收集,收集的心室肌细胞在室温下静置于KB液中1小时后逐渐增加KB液中Ca2+浓度直到1.8 m M。而大鼠缺血性心室肌细胞则通过对大鼠尾静脉注射垂体后叶素诱导心肌缺血10分钟后参照正常大鼠心肌细胞分离方法准备。所分离的心室肌细胞需在分离后6小时内进行实验。全细胞膜片钳技术记录SAA对ICa-L及其动力学过程的影响。(2)细胞培养HEK293细胞系在37°C,5%CO2和95%空气条件下常规培养,并每隔1-2天进行细胞传代。HEK293细胞需要经过脂质体转染才能表达人心脏KCNQ1/KCNE1(IKs)钾离子通道。表达h ERG通道(IKr)的HEK293为稳定转染细胞株培养后可直接用于膜片钳实验。穿孔膜片钳技术记录SAA对IKs和IKr及其动力学过程的影响。(3)细胞收缩测定成年雄性Sprague-Dawley大鼠心脏进行急性分离,用经典酶解法分离得到单个心室肌细胞。所分离的心室肌细胞需在分离后6小时内进行实验。细胞收缩与离子浓度同步测量系统则用于检测分离的成年大鼠心肌收缩力。结果:1心室肌细胞ICa-L的鉴定将细胞膜钳制于-80 m V,采用不同程度的去极化(-60-+60 m V,Δ10 m V)激活ICa-L。结果显示ICa-L能够被特异性钙通道阻断剂维拉帕米几乎完全阻断(P<0.05)。2 SAA对心室肌细胞ICa-L的抑制作用3×10-4 M SAA可显著抑制心室肌细胞ICa-L,抑制率为35.5±0.9%。细胞外液冲洗后ICa-L可部分恢复到用药前水平(19.8±2.7%)(n=5)。3 SAA对心室肌细胞ICa-L作用的量效关系结果显示,SAA可浓度依赖性抑制ICa-L。3×10-6、10-5、3×10-5、10-4和3×10-4 M SAA对ICa-L的抑制率分别为9.5±0.9%、21.0±2.1%、29.6±1.8%、34.6±1.9%和39.5±1.9%(n=5)。4 SAA对心室肌细胞ICa-L的电流-电压(I-V)关系曲线的作用I-V关系曲线随SAA浓度增加而逐步上移,表明SAA浓度依赖性地抑制I

关键词：丹参酸A L-型钙电流心肌收缩力慢激活延迟整流钾电流快激活延迟整流钾电流

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丹酚酸A对心肌细胞离子通道以及收缩力的调控作用

丹酚酸A对心肌细胞离子通道以及收缩力的调控作用

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作者：宋琼涛河北医科大学

学位级别：硕士

L-型钙离子通道(L-type calcium channels，LTCCs)介导并调控Ca2+进入细胞，对心肌细胞的正常生理功能有重要的意义。LTCCs主要分布于肌纤维膜上，能够被去极化电压所激活，同时内流的Ca2+则能引起通道失活关闭。L-型钙离子电流(L-type ... 详细信息

L-型钙离子通道(L-type calcium channels，LTCCs)介导并调控Ca2+进入细胞，对心肌细胞的正常生理功能有重要的意义。LTCCs主要分布于肌纤维膜上，能够被去极化电压所激活，同时内流的Ca2+则能引起通道失活关闭。L-型钙离子电流(L-type calcium current，ICa-L)不仅在心肌的兴奋-收缩耦联中起着极为重要的作用，同时参与心肌动作电位的形成和维持并与心律失常的发生有关。钙通道阻滞剂能够抑制心肌细胞Ca2+内流，降低细胞内钙，减弱心肌收缩力，降低心肌氧耗量，在临床上可用于高血压，冠心病，急性左心衰等病症。 　　慢激活延迟整流钾电流(the slowly activating delayed rectifierpotassium current，IKs)和快激活延迟整流钾电流（the rapidly activatingdelayed rectifier potassium current，IKr）在心肌动作电位的复极化过程中发挥重要作用。当电学重构或基因突变导致IKs和IKr通道功能异常时，将引起K+外流减少，使心肌复极减慢，动作电位延长，产生Q-T间期延长综合征(Long QT syndrome，LQTS)，表现为心电图Q-T间期延长并发生恶性心律失常性晕厥及猝死。IKs和IKr抑制剂则可能导致Q-T间期延长而引发心律失常。 　　丹参(Salvia miltiorrhiza)在中国有几千年的临床应用历史，它被广泛用于治疗高血压，冠心病，心肌梗塞，血液循环疾病和其他的心血管疾病。越来越多的研究表明，丹参主要的水溶性成分为丹参酸A(SalvianicacidA，SAA)，具有多种药理学活性，如抗炎和抗肿瘤，神经和心肌保护作用，提高免疫力等。在前期的工作中，我们发现丹参注射液可以阻断LTCCs，SAA作为丹参注射液主要的成分之一，可能是丹参注射液阻断LTCCs发挥心肌保护作用的物质基础。 　　目的:本研究主要探讨了SAA心脏保护作用的机制。通过电生理膜片钳技术观察SAA对大鼠心室肌细胞LTCCs以及HEK293细胞上表达的KCNQ1/KCNE1、hERG通道电流的调控作用，通过IonOptix测量系统观察SAA对大鼠心室肌细胞收缩力的影响。 　　方法: 　　(1)成年大鼠心室肌细胞分离成年雄性Sprague-Dawley大鼠麻醉后开胸取出心脏进行急性分离，心脏在Langendorff装置上用含0.02％胶原酶Ⅱ的无钙台氏液在37℃下进行酶解消化。酶消化完毕后自左心室分段剪取心室肌组织放入盛有Kreb's（KB液）的试管中轻轻吹打使之分散成单个细胞。单个心肌细胞通过200目尼龙网过滤收集，收集的心室肌细胞在室温下静置于KB液中1小时后逐渐增加KB液中Ca2+浓度直到1.8mM。而大鼠缺血性心室肌细胞则通过对大鼠尾静脉注射垂体后叶素诱导心肌缺血10分钟后参照正常大鼠心肌细胞分离方法准备。所分离的心室肌细胞需在分离后6小时内进行实验。全细胞膜片钳技术记录SAA对ICa-L及其动力学过程的影响。 　　(2)细胞培养HEK293细胞系在37℃，5％ CO2和95％空气条件下常规培养，并每隔1-2天进行细胞传代。HEK293细胞需要经过脂质体转染才能表达人心脏KCNQ1/KCNE1(IKs)钾离子通道。表达hERG通道(IKr)的HEK293为稳定转染细胞株培养后可直接用于膜片钳实验。穿孔膜片钳技术记录SAA对IKs和IKr及其动力学过程的影响。 　　(3)细胞收缩测定成年雄性Sprague-Dawley大鼠心脏进行急性分离，用经典酶解法分离得到单个心室肌细胞。所分离的心室肌细胞需在分离后6小时内进行实验。细胞收缩与离子浓度同步测量系统则用于检测分离的成年大鼠心肌收缩力。 　　结果: 　　1、心室肌细胞ICa-L的鉴定 　　将细胞膜钳制于-80 mV，采用不同程度的去极化(-60-+60 mV，Δ10mV)激活ICa-L。结果显示ICa-L能够被特异性钙通道阻断剂维拉帕米几乎完全阻断(P＜0.05)。 　　2、SAA对心室肌细胞ICa-L的抑制作用 　　3×10-4 M SAA可显著抑制心室肌细胞ICa-L，抑制率为35.5±0.9％。细胞外液冲洗后ICa-L可部分恢复到用药前水平（19.8±2.7％）(n=5)。 　　3、SAA对心室肌细胞ICa-L作用的量效关系 　　结果显示，SAA可浓度依赖性抑制ICa-L

关键词：丹参酸A L-型钙电流心肌收缩力慢激活延迟整流钾电流快激活延迟整流钾电流心脏保护

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