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2012中国器官移植大会

作者：王水良林凤锦王庆华谭建明南京军区福州总医院全军器官移植研究所福建省移植生物学重点实验室全军组织修复和器官重建重点实验室

【目的】建立人核受体hLRH-1慢病毒表达系统,初步分析经该系统介导的hLRH-1过表达对胰腺癌细胞表型的影响及其相关的分子机理。【方法】以人核受体hLRH-1表达载体pcDNA3-hLRH-1为模板,利用Phusion高保真DNA聚合酶通过常规的PCR法扩增得... 详细信息

【目的】建立人核受体hLRH-1慢病毒表达系统,初步分析经该系统介导的hLRH-1过表达对胰腺癌细胞表型的影响及其相关的分子机理。【方法】以人核受体hLRH-1表达载体pcDNA3-hLRH-1为模板,利用Phusion高保真DNA聚合酶通过常规的PCR法扩增得到人核受体hLRH-1的完整编码区,并克隆至慢病毒表达载体pLEX-MCS中,重组载体行PCR法和限制性内切酶酶切法鉴定和测序验证。经鉴定的重组慢病毒表达质粒与相应包装质粒psPAX2和pMD2.G经聚乙烯亚胺（PEI）

关键词：胰腺癌细胞慢病毒表达系统 hLRH-1 核受体增殖抑制

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目的基因CXCL-1慢病毒表达系统的构建及在人正常肝细胞中的功能研究

目的基因CXCL-1慢病毒表达系统的构建及在人正常肝细胞中的功能研...

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第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议

作者：杨琦赵荫农广西医科大学附属肿瘤医院

＜正＞目的 CXCL-1又被称作GRO-α,属CXC趋化因子家族,早期研究发现CXCL-1在很多肿瘤的的发生、生长、发展、增殖、侵袭、迁移、血管新生、淋巴管新生、淋巴转移、转化等过程中发挥关键作用。但是目前CXCL-1及其受体与肝脏疾病发生发展... 详细信息

＜正＞目的 CXCL-1又被称作GRO-α,属CXC趋化因子家族,早期研究发现CXCL-1在很多肿瘤的的发生、生长、发展、增殖、侵袭、迁移、血管新生、淋巴管新生、淋巴转移、转化等过程中发挥关键作用。但是目前CXCL-1及其受体与肝脏疾病发生发展间的关系报道甚少,因此,本研究拟通过构建目的基

关键词：正常肝细胞生物学功能 CXCL-1趋化因子慢病毒表达系统

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慢病毒系统HBV基因可调控表达动物模型的构建

慢病毒系统HBV基因可调控表达动物模型的构建

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作者：孙勇复旦大学

学位级别：硕士

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种在世界范围内严重危害人类健康的疾病。目前,全世界大约有3.5亿人感染乙肝病毒,我国约有0.3亿人患有乙型肝炎,有很大一部分患者并发肝硬化及原发性肝癌。我国是乙肝高流行区,每年新发病例... 详细信息

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种在世界范围内严重危害人类健康的疾病。目前,全世界大约有3.5亿人感染乙肝病毒,我国约有0.3亿人患有乙型肝炎,有很大一部分患者并发肝硬化及原发性肝癌。我国是乙肝高流行区,每年新发病例约200万,造成的经济损失高达近万亿元。乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒,仅感染灵长类动物及少数其它物种。经过近半个世纪的研究,乙型肝炎至今仍然没有被攻克,其原因主要是免疫耐受会造成HBV感染的慢性化,同时免疫耐受也是HBV持续感染的重要因素。因此,深入了解乙肝病毒免疫耐受的形成机制、弄清维持免疫耐受的分子基础及其特征,这是目前攻克乙型病毒性肝炎的重要研究方向。研究乙肝病毒免疫耐受形成机制、弄清维持耐受的细胞学特征和分子机制需要打破动物模型造成的瓶颈。但迄今为止,可以用来研究乙型肝炎病毒的动物模型主要有黑猩猩、小鼠、土拨鼠、鸭等动物,它们由于自身局限性及稳定性而不适合作为常规的实验动物模型；更为重要的是：上述动物模型中乙型肝炎病毒DNA在建模初期就已稳定的整合到动物肝细胞的基因组,形成了病毒与宿主细胞静态相容的结果,因此不能反映病毒侵染过程中细胞内动念变化的过程,更无法达到对免疫耐受形成前后的差异性研究。因此我们选用四环素调控的慢病毒系统来构建乙肝动物模型并实现乙肝病毒基因在动物体内的可调控表达,通过人为的控制来研究不同发育时期及不同免疫状态下动物体内的整体变化情况,以此来对形成免疫耐受前后的体内状态进行研究,预期找出免疫系统的差异性如特异性的分子或者靶点的差异,找到打破免疫耐受的突破口。这对于揭示乙肝病毒特异免疫耐受的形成机制、弄清维持耐受的细胞和分子基础及特征,将会产生深远的影响。在实验室之前的工作中,已经构建了含有乙肝病毒各个基因(X,P,C,preC-C, S,preS2-S,PreS1-S2-S)的可诱导表达载体质粒系统,本研究中将载体利用慢病毒包装细胞系HEK 293T细胞分别获得含有调控质粒pLVX-Tet-On和表达质粒pLVX-X及pLVX-LS的病毒颗粒,获得的病毒滴度达到可108LPs/mL。将包装获得的病毒等量混合后进行小鼠睾丸注射,每只雄性小鼠的左右侧睾丸内各注射约10μL的病毒,注射后与母鼠合笼,母鼠经过怀孕、分娩生产获得子代FO代小鼠。提取F0代小鼠的基因组,通过southern-blot和反向PCR的方法对子代小鼠基因组内目的基因的整合情况进行研究分析。经过鉴定后对其中含有四环素调控基因及乙肝病毒部分基因的小鼠进行诱导蛋白质的表达。诱导72h后提取其肝脏组织的蛋白质进行western-blot验证及其对其肝脏组织、肾脏组织进行免疫组织化学分析。检测目的基因的蛋白表达情况。结果：本实验共获得F0代小鼠共96只,通过Southern-blot和反向PCR的方法对F0代小鼠基因组的分析,在所获得的F0代小鼠中,四环素调控基因阳性小鼠共14只,阳性率为14.58%,乙肝病毒X组小鼠49只,阳性小鼠5只,阳性率为10.20%。将经过鉴定后的小鼠进行诱导,在小鼠饮水中加以浓度为1.5mg/mL的强力霉素(DOX)进行诱导乙肝病毒-X基因的蛋白表达,诱导72h后提取小鼠的肝脏组织及其肝脏组织内总蛋白,进行western-blot分析及免疫组织化学分析。结果表明：小鼠体内发现其乙肝病毒-X基因的蛋白表达。经过对小鼠的肝脏组织及肾脏组织的免疫组织化学分析,结果同样表明小鼠体内组织内存在乙肝病毒的X蛋白。

关键词：乙型肝炎病毒慢病毒表达系统动物模型可诱导表达

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慢病毒系统HBV基因可调控表达细胞模型的构建

慢病毒系统HBV基因可调控表达细胞模型的构建

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作者：白荷露复旦大学

学位级别：硕士

乙型病毒性肝炎(hepatitis B, HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界范围内流行的一种严重危害人类健康的疾病。HBV感染后,有相当部分的患者最终将转化为慢性肝病,并发肝硬化和原发性肝癌。以往用于HBV研究的实验模型多为HepG2细胞,HCC... 详细信息

乙型病毒性肝炎(hepatitis B, HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界范围内流行的一种严重危害人类健康的疾病。HBV感染后,有相当部分的患者最终将转化为慢性肝病,并发肝硬化和原发性肝癌。以往用于HBV研究的实验模型多为HepG2细胞,HCC组织及转基因动物等模型,这些模型中HBV DNA均已稳定的整合入肝细胞的基因组,是一种与宿主细胞静态相容的结果,不能反映病毒感染过程中细胞中动态变化过程,以作为观察研究病毒抗原与宿主互作的研究模型。为此我们选用四环素调控的慢病毒系统来实现乙肝病毒基因的可调控表达,通过人为的控制可观察不同时期细胞内的整体变化情况。研究中,我们构建了含有乙肝病毒基因(X, P, C, preC-C, S, preS2-S, PreS1-S2-S)的七种可诱导表达载体质粒,经鉴定DNA序列正确。利用慢病毒包装细胞系HEK293T细胞分别获得含有调控质粒pLVX-Tet-On和表达质粒pLVX-GOI的病毒颗粒,滴度达到可108LPs/ml。将这两种病毒共感染HepG2和L02细胞株,并利用双重抗生素筛选(G418和Puromycin)获得整合有目的基因的稳定细胞株。随后,对于构建的细胞株中目的基因的存在进行了鉴定,并对其中含有X和PreS1-S2-S的细胞株HepG2-X/LS诱导表达的RNA进行鉴定,证明获得可诱导表达的mRNA,进一步对X转基因细胞HepG2-X进行诱导产物X蛋白鉴定,证明获得了X蛋白可诱导表达的细胞株。HBV基因可调控细胞模型的构建,为进一步研究HBV各基因在对宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了理想的实验模型。

关键词：乙型肝炎病毒慢病毒表达系统四环素调控可诱导表达

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SHIP基因诱导白血病细胞株K562凋亡及其机制

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生理学报 2009年第2期61卷 146-154页

作者：杨琳罗建民刘小军温树鹏杜行严姚丽杨敬慈河北医科大学第二医院血液科河北省血液病重点实验室石家庄050000

肌醇5'磷酸酶(src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase,SHIP)是继PTEN之后发现的又一肌醇磷酸酶,对造血细胞增殖有关键负调控作用。目前国内外对SHIP基因与人类肿瘤抑制关系方面的研究报道较少。本研究利用携带... 详细信息

肌醇5'磷酸酶(src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase,SHIP)是继PTEN之后发现的又一肌醇磷酸酶,对造血细胞增殖有关键负调控作用。目前国内外对SHIP基因与人类肿瘤抑制关系方面的研究报道较少。本研究利用携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体稳定感染K562细胞,应用实时荧光PCR、Western blot检测转染前后细胞内SHIP基因mRNA和蛋白水平的变化,MTT测定细胞增殖水平的变化,ELISA检测相关激酶活性,TUNEL、Hoechst33342检测细胞凋亡的变化,从而探讨SHIP基因诱导K562凋亡的机制,分析SHIP基因在白血病发病中的意义。结果如下:(1)K562细胞SHIP蛋白表达阴性;(2)携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体转染使K562细胞表达SHIP mRNA和蛋白;(3)与对照组相比,转染野生型SHIP基因导致K562细胞生长受抑,并出现明显的凋亡征象;(4)转染SHIP基因的K562细胞Akt磷酸化水平降低;NF-κB和bcl-xL表达降低;同时细胞促凋亡基因bad、p27表达和caspase-9、caspase-3活性明显增高。上述结果提示SHIP通过抑制PI3K/Akt路径中Akt的磷酸化,促进其下游bad、p27表达和caspase-9、caspase-3的活化,抑制bcl-xL,最终诱导白血病细胞凋亡;另外,NF-κB表达下调也是SHIP抑制白血病细胞增殖并促进细胞凋亡的重要作用机制。

关键词： SHIP 慢病毒表达系统细胞增殖细胞凋亡

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慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

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畜牧兽医学报 2019年第1期50卷 218-226页

作者：吴锦艳田宏蒙学莲惠小婷王耀杰关玉华尚佑军刘永生张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定... 详细信息

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID_(50)·0.1mL^(-1)由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。

关键词：小反刍兽疫病毒 SLAM Vero细胞系 Gateway技术慢病毒表达系统

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gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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中国预防兽医学报 2012年第11期34卷 847-853页

作者：欧阳伟朱向东王永山王永强潘群兴毕振威王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21与3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。将VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1 mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1 mL)。采用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染DF-miR-21细胞,采用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可以抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。

关键词：传染性法氏囊病病毒 miRNA gga-miR-21 慢病毒表达系统病毒复制

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慢病毒介导的HBV-X基因可调控表达小鼠模型的构建

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复旦学报（自然科学版） 2013年第4期52卷 447-451,459页

作者：孙勇汤必奎白荷露朱乃硕复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系上海200433 蚌埠医学院生物科学系蚌埠233030

理想动物模型的缺乏是乙型肝炎病毒(HBV)研究的一个重要障碍.本实验运用可调控慢病毒载体结合精子介导的方法构建体内乙型肝炎病毒X基因(HBV-X)可调控表达的转基因小鼠模型.首先构建了四环素调控的HBV-X基因可调控表达慢病毒颗粒,再对... 详细信息

理想动物模型的缺乏是乙型肝炎病毒(HBV)研究的一个重要障碍.本实验运用可调控慢病毒载体结合精子介导的方法构建体内乙型肝炎病毒X基因(HBV-X)可调控表达的转基因小鼠模型.首先构建了四环素调控的HBV-X基因可调控表达慢病毒颗粒,再对雄性小鼠进行睾丸注射,后与母鼠合笼,母鼠分娩获得子代小鼠,最后利用Southern blot,反向PCR,Western blot以及免疫组织化学等方法分别对子代小鼠体内病毒基因整合情况和可控诱导表达情况进行检测.结果提示子代小鼠体内成功整合HBV-X基因,并在强力霉素(Dox)诱导后,可表达目的蛋白,可调控转基因小鼠构建基本成功.

关键词：乙型肝炎病毒慢病毒表达系统动物模型诱导表达

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FGFR2IIIc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

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中国生物工程杂志 2011年第5期31卷 1-7页

作者：郭淑军万艳李丽玲秦丽陈小佳国家教育部基因组药物工程研究中心广东省生物工程药物重点实验室暨南大学生物工程研究所广州510632 深圳南山区慢性病防治院深圳518000

目的:构建人FGFR2IIIc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2IIIc的重组细胞株,初步研究FGFR2IIIc对L6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得FGFR2IIIc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR... 详细信息

目的:构建人FGFR2IIIc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2IIIc的重组细胞株,初步研究FGFR2IIIc对L6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得FGFR2IIIc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2IIIc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2IIIc。将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2～4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株。RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2IIIc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系。结果:构建了含人FGFR2IIIc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2IIIc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化。结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2IIIc的重组L6细胞株,FGFR2IIIc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2IIIc基因与成肌分化功能相关性奠定基础。

关键词：成纤维细胞生长因子受体2IIIc 慢病毒表达系统大鼠肌原细胞

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稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞系的建立

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中国兽医科学 2013年第7期43卷 749-753页

作者：关洪鑫李志勇高鹏许生智白银梅柳纪省中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070

为了建立能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞系,利用PCR方法从BL21(DE3)细菌中扩增T7RNA聚合酶基因,并克隆到慢病毒表达系统的pLVX-Puro转移载体上,然后与Lenti-X HTX包装载体共转染Lenti-X 293T细胞系,收获高效价的慢病毒。将慢病毒感... 详细信息

为了建立能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞系,利用PCR方法从BL21(DE3)细菌中扩增T7RNA聚合酶基因,并克隆到慢病毒表达系统的pLVX-Puro转移载体上,然后与Lenti-X HTX包装载体共转染Lenti-X 293T细胞系,收获高效价的慢病毒。将慢病毒感染BHK-21细胞,用嘌呤霉素多次筛选后获得抗性细胞。用构建的pET-28a-IRES-EGFP检测质粒转染得到的抗性细胞,有荧光表达的细胞即可以稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系。结果表明:构建的BHK-T7株细胞能稳定表达T7RNA聚合酶。

关键词： T7 RNA聚合酶细胞系慢病毒表达系统

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