检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2020年第7期40卷 1319-1324页

作者：郝军红闫鸣昊张大俊张学刚申超超徐国伟李国丽张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

通过基因合成的TPL2(tumor progression locus 2)质粒,获得稳定表达TPL2的PK-15/TPL2细胞系。将慢病毒载体Lv-PCDH和TPL2(Pig)重组慢病毒载体Lv-TPL2(Pig)利用转染试剂将其转染至PK-15细胞。感染48 h后,加入嘌呤霉素进行药物筛选,通过... 详细信息

通过基因合成的TPL2(tumor progression locus 2)质粒,获得稳定表达TPL2的PK-15/TPL2细胞系。将慢病毒载体Lv-PCDH和TPL2(Pig)重组慢病毒载体Lv-TPL2(Pig)利用转染试剂将其转染至PK-15细胞。感染48 h后,加入嘌呤霉素进行药物筛选,通过筛选得到的阳性细胞株PK-15/TPL2即为稳定表达TPL2蛋白的PK-15细胞株。通过qRT-PCR法和琼脂糖凝胶电泳、IFA,TCID50技术验证PK-15/TPL2细胞系和对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪塞内加谷病毒(seneca valley virus,SVV)病原复制的影响。结果显示,细胞表达大量的TPL2的基因产物,用FMDV、SVV病毒感染稳定表达TPL2的PK-15细胞株时,明显抑制病毒的复制。结果表明,利用该技术可高效快速地建立了稳定高表达TPL2的PK-15细胞系,该细胞株的建立为病毒的分离及TPL2的生物学活性研究奠定理论基础。

关键词： TPL2基因 PK-15细胞系 FMDV SVV 慢病毒表达系统

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过表达TPL2蛋白BHK21细胞系的建立及其初步应用

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中国兽医科学 2019年第12期49卷 1527-1534页

作者：郝军红闫鸣昊张大俊张学刚申超超徐国伟李国丽张克山郑海学刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室

利用慢病毒表达系统将TPL2(COT和MAP3K8)质粒稳定整合在乳仓鼠肾细胞(baby Hamster Syrian kidney)BHK21细胞基因组染色体上,建立稳定表达TPL2的BHK21/TPL2细胞系。构建TPL2质粒,通过基因合成将TPL2基因和慢病毒载体Lv-PCDH连接,得到重... 详细信息

利用慢病毒表达系统将TPL2(COT和MAP3K8)质粒稳定整合在乳仓鼠肾细胞(baby Hamster Syrian kidney)BHK21细胞基因组染色体上,建立稳定表达TPL2的BHK21/TPL2细胞系。构建TPL2质粒,通过基因合成将TPL2基因和慢病毒载体Lv-PCDH连接,得到重组慢病毒载体Lv-TPL2。通过嘌呤霉素筛选得到的阳性细胞株BHK21/TPL2即为稳定表达TPL2蛋白的BHK21细胞株。运用间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、实时荧光定量PCR和普通PCR等技术分别验证TPL2基因组整合、转录、反应活性以及FMDV、SVV在BHK21/TPL2细胞株上的增殖效果。结果,TPL2基因被稳定整合在BHK21细胞基因组染色体上,建立的细胞系连续传代不丢失。接种病毒后致细胞病变严重,相对于正常的BHK21/PCDH细胞,整合有TPL2的BHK21细胞对FMDV、SVV的易感性显著增强。上述结果为FMDV疫苗的研制和生产提供了更佳的功能细胞系。

关键词： TPL2基因 BHK-21细胞系口蹄疫病毒 SVV病毒慢病毒表达系统

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应用RNA干扰技术抑制MCF7/MX100细胞中BCRP表达和活性

应用RNA干扰技术抑制MCF7/MX100细胞中BCRP表达和活性

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作者：余彩虹浙江大学

学位级别：硕士

本课题采用短发夹RNA (Short-hairpin-RNA, shRNA)和小干扰RNA (Small interference RNA, siRNA)两种方法筛选乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的干扰RNA,选择干扰效果好的RNA干扰序列重组到慢病毒载体上,构建慢病毒干扰RNA稳定表达模型。该模型能... 详细信息

本课题采用短发夹RNA (Short-hairpin-RNA, shRNA)和小干扰RNA (Small interference RNA, siRNA)两种方法筛选乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的干扰RNA,选择干扰效果好的RNA干扰序列重组到慢病毒载体上,构建慢病毒干扰RNA稳定表达模型。该模型能有效抑制BCRP/ABCG2的mRNA表达和蛋白表达水平,并能强强烈抑制BCRP活性,逆转其耐药性。RNA干扰慢病毒稳定转染细胞株也可以方便地用于BCRP底物和抑制剂的筛选和确证,为新药研发和药物合理应用研究提供高效模型,拓展RNA干扰的应用范围。 1、shRNA表达质粒的构建及其对BCRP的干扰作用应用基于米托蒽醌高剂量诱导时间递增的“两阶筛选法”建立MCF7/MX100耐药细胞,并经western blot. MTT实验鉴定。结果表明MCF7/MX100细胞与亲本细胞相比,BCRP蛋白表达明显增加。MCF7/MX100比亲本细胞MCF7耐药性显著上升,ICso从1.014±0.11μmol/L上升到4.064±0.38μmol/L(P<0.001).构建shRNA表达质粒,包括siRNA的设计,双链干扰片段模板制备以及质粒扩增。表达质粒为pSilencer4.1,构建成功后进行质粒测序及电泳鉴定,然后转染至MCF7/MX100耐药细胞中,采用RT-PCR、western blot、流式细胞术实验考察干扰效果。阳性对照shRNA效果明显,但是本论文设计的位点对BCRP mRNA的表达没有明显抑制效果。 2、化学合成siRNA及其对BCRP的干扰作用考察了针对BCRP mRNA不同位点获得的三条化学合成siRNA (si-BCRP1, si-BCRP2, si-BCRP3)对MCF7/MX100细胞中BCRP蛋白的干扰作用。RT-PCR和Western blot检测结果显示：si-BCRP2和si-BCRP3组干扰效果明显,mRNA抑制率分别为97%和95%,蛋白的表达抑制率分别为76%和71%。流式细胞术实验结果显示：si-BCRP2和si-BCRP3组对米托葸醌的敏感性明显提高,与对照组差异有显著性(P<0.01)。 3、干扰BCRP/ABCG2基因的慢病毒稳定转染细胞株的建立从前面两部分研究筛选出干扰效果好的干扰序列,扩增siRNA模板,酶切连接到pTRIPZ质粒中,然后采用转染试剂Roche X-tremeGENE在状态良好的lenti293t细胞中进行慢病毒包装。包装48h后收集病毒液,MCF7/MX100耐药细胞用8μg/mL polybrene感染病毒。然后经过嘌呤霉素(1μg/mL)筛选和强力霉素(1μg/mL)诱导,构建干扰BCRP/ABCG2基因的慢病毒稳定转染细胞株：Lenti-BCRP2和Lenti-BCRP3。RT-PCR, Western blot和流式细胞术法检测各组慢病毒干扰稳定转染细胞株中BCRP的基因表达以及活性情况。结果显示,Lenti-BCRP2和Lenti-BCRP3组的mRNA抑制率分别为72%和56%,蛋白表达的抑制率分别为70%和53%, Lenti-BCRP2的药物敏感性也显著增加(P<0.05)。 4、干扰BCRP/ABCG2基因的慢病毒稳定转染细胞株的应用本章考察了二氢杨梅素(30μmol/L),异鼠李素(25μmol/L),淫羊藿苷(10pmol/L)在慢病毒稳定转染细胞株中的单独积聚以及与米托葸醌(5μmol/L)的相互作用。单独积聚总孵育时间为45min,而相互作用考察时先加中药有效成分预孵育15mmin,然后加米托葸醌孵育30mmin。采用UPLC-MS/MS液质联用分析方法,记录色谱图,以标准曲线法求出细胞内米托蒽醌以及中药有效成分的浓度,单位时间内细胞中的药物积聚量用细胞裂解液蛋白含量进行校正。结果显示在BCRP干扰组中,诱导后异鼠李素的积聚显著增加,预测异鼠李素是BCRP的底物。与米托葸醌共同孵育结果显示各组细胞经二氢杨梅素和淫羊藿苷处理前后经典底物米托葸醌的积聚均没有显著差异,表明二氢杨梅素和淫羊藿苷不是BCRP的抑制剂；而异鼠李素处理前后,Lenti-NC-, Lenti-NC+, Lenti-BCRP-组经典底物米托葸醌的积聚均有显著性差异,表明异鼠李素为BCRP的抑制剂。综上,异鼠李素可能既是BCRP的底物又是其抑制剂。

关键词：乳腺癌耐药蛋白 RNA干扰慢病毒表达系统耐药逆转米托蒽醌异鼠李素二氢杨梅素淫羊藿苷药物合理利用

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禽流感H5N1亚型病毒样颗粒表达与组装

禽流感H5N1亚型病毒样颗粒表达与组装

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作者：薛倩新疆农业大学

学位级别：硕士

禽流感（avian influenza,AI）是由A型流感病毒引起的禽类的一种呼吸道疾病。禽流感主要的预防和控制手段是疫苗接种。目前广泛使用的流感灭活疫苗,对呼吸道不能诱发有效的黏膜免疫,尽管能抑制病毒在体内的扩散,具有减轻症状的效果。但... 详细信息

禽流感（avian influenza,AI）是由A型流感病毒引起的禽类的一种呼吸道疾病。禽流感主要的预防和控制手段是疫苗接种。目前广泛使用的流感灭活疫苗,对呼吸道不能诱发有效的黏膜免疫,尽管能抑制病毒在体内的扩散,具有减轻症状的效果。但是疫苗存在的缺陷不容忽视,如鸡胚内培养而导致的抗原变异或被接种者对鸡蛋成分过敏反应等问题,因此需要深入研究开发高效、安全的新型疫苗。病毒样颗粒（Virus-Like particles,VLPs）疫苗与其他疫苗相比,不含有核酸、具有与天然病毒相似的抗原表位、成本更低,是一种安全、高效的疫苗。1.家禽禽粪便和泄殖腔拭子、病禽组织,以及野鸟粪便,共计109份分别收集于新疆多地。设计禽流感病毒H5亚型特异引物,通过RT-PCR从病料中扩增HA基因并测序,获得H5亚型病毒4株,遗传进化分析归类为Clade 8。2.为研究H5N1亚型禽流感基因工程疫苗,构建了多拷贝整合表达禽流感VLPs的重组巴斯德毕赤酵母。以巴斯德毕赤酵母GS115株18S r RNA基因（r DNA）部分序列,插入p PIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1亚型毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒p8K-HA、p8K-M和p8K-NA。上述三个表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白经免疫印迹试验,可检测到与HA、M1和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80～120 nm的病毒样颗粒;免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。研究结果支持巴斯德毕赤酵母能有效表达并组装禽流感VLPs,从而为基于酵母的禽流感基因工程疫苗研究提供了基础。3.本试验使用带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的慢病毒表达载体,将禽流感病毒HA、M1基因插入到该载体中,构建表达载体,命名为p CDH-HA和p CDH-M1。将两个表达质粒和两个包装质粒p SPAX2和p LOX共转染生长良好的BHK21细胞,连续适应性传代,观察荧光强度确定收获病毒时间。细胞沉淀通过25%硫酸铵沉淀后,Western-blot检测表达产物。试验结果表明,免疫印迹试验可检测到与HA、M1分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80～120 nm的病毒样颗粒。HA血凝试验检测重组蛋白,显示血凝价可达到2～5。以上试验结果表明,慢病毒载体介导的BHK21细胞可以成功表达组装禽流感VLPs,有望为今后的禽流感疫苗的研究提供试验基础。

关键词：禽流感病毒多拷贝整合病毒样颗粒巴斯德毕赤酵母慢病毒表达系统

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乙酰胆碱酯酶促肝癌细胞凋亡作用机制的研究

乙酰胆碱酯酶促肝癌细胞凋亡作用机制的研究

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作者：郭凯杰中国科学院大学

学位级别：硕士

第一章乙酰胆碱酯酶促肝癌细胞凋亡作用机制的研究\n 乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的经典功能是水解乙酰胆碱，终止神经冲动传递。多个研究组诸多研究成果证实，在多种细胞凋亡过程中，AChE广泛存在且表达上调;抑制其... 详细信息

第一章乙酰胆碱酯酶促肝癌细胞凋亡作用机制的研究\n 乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的经典功能是水解乙酰胆碱，终止神经冲动传递。多个研究组诸多研究成果证实，在多种细胞凋亡过程中，AChE广泛存在且表达上调;抑制其表达，凋亡则明显受阻。这些数据表明，AChE在多种细胞凋亡过程发挥重要作用，其中包括肝癌细胞。本文对临床肝癌组织芯片样本进行免疫组化分析发现，与癌旁组织相比，细胞无节制增殖的癌组织中AChE表达下调，此数据进一步支持了AChE的促凋亡功能。但是，AChE介导肝癌细胞凋亡的机制尚不清楚。\n 2008年世界范围内癌症统计结果显示，在诸多恶性肿瘤中，肝癌发生率居于第六位，死亡率居于第三位。因此，肝癌成为当今危及人们健康和生命的严重疾患，目前尚无有效治疗措施。阐明AChE促肝癌细胞凋亡分子机制可为肝癌治疗提供新策略。为此，本文以肝癌模式细胞BEL-7404为例，研究促凋亡关键分子AChE介导肝癌细胞凋亡的分子机制。\n 我们发现，抗肿瘤药物Cisplatin诱导的BEL-7404凋亡过程中，AChE表达上调且在细胞核内有明显分布。此数据提示:AChE发挥促凋亡作用的场所可能是细胞核。进一步研究发现，在无其它凋亡刺激情况下，过表达带有核定位信号的AChE(NLS-AChE)，导致细胞全部凋亡，在裸鼠皮下不能成瘤;然而，过表达不带有NLS信号AChE的BEL-7404细胞与过表达GFP的对照组细胞相类似，均表型正常，能形成稳转株，可长期生存。此数据进一步证实:细胞核是AChE发挥促凋亡作用的场所。上述数据表明，核转位是AChE促细胞凋亡中的关键性事件。\n 前期工作发现，AChE蛋白具有DNase活性，能够剪切质粒DNA及裸露的基因组DNA。本研究发现AChE蛋白还能剪切经预先固定处理的细胞中的染色体DNA。由此，我们推断AChE可能是通过剪切基因组DNA行使促凋亡功能的。\n 在NLS-AChE过表达触发细胞凋亡实验中，在凋亡形态学特征出现之前，H2AX磷酸化程度很早便明显增强，表明DNA损伤信号通路被激活，这一数据进一步支持AChE在凋亡过程中发挥DNA酶作用。\n 本研究表明，入核后剪切DNA行使DNase功能是AChE促肝癌细胞凋亡的作用机制。根据这一发现，介导AChE蛋白靶向进入肝癌细胞细胞核可望成为肝癌治疗新举措。\n 第二章AChE(32-578)的表达纯化研究\n 乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是一种羧酸酯酶，在神经递质乙酰胆碱(ACh)介导的神经传递中起重要作用。我们实验室发现它的一种新功能，需要表达纯化相关蛋白进行体外功能探索。本研究中，我们将编码人源AChE(32-578)位氨基酸的cDNA序列插入到改造后的表达载体p3×FLAG-CMV-9 vector中，其编码的融合蛋白为含有真核细胞分泌信号肽的Flag-tag标记的目标蛋白。之后，我们将该cDNA序列亚克隆到慢病毒载体pCHO-puro vector中，利用慢病毒表达系统构建稳定表达该融合蛋白的N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅰ缺失的HEK293S(GnTⅠ-293S)细胞株。免疫印迹分析和Ellman酯酶活性检测表明，稳转株构建成功;一步亲和纯化后，我们得到高纯度的目标蛋白。以上数据表明，我们在GnTⅠ-293S细胞培养液中得到分泌表达的以可溶形式存在的AChE片段蛋白(T547)，产量大约为1.5-2.0 mg/L，满足功能探索的需要。

关键词：乙酰胆碱酯酶肝肿瘤细胞分泌信号肽慢病毒表达系统促凋亡机制

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人脐静脉内皮细胞Caveolin-1基因沉默模型的建立

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现代医药卫生 2011年第13期27卷 1924-1927页

作者：彭韦霞文芳曹仁贤杨慧龄颜斌张友其益阳市中心医院内分泌科湖南益阳413000 衡阳市南华大学附属第一医院内分泌科湖南衡阳412000 衡阳市南华大学附属第一医院临床研究所湖南衡阳412000

目的:利用小干扰RNA(siRNA)技术建立人脐静脉内皮细胞(ECV304)小凹蛋白(Caveolin-1)基因沉默模型,为研究Cave-olin-1基因在人脐静脉内皮细胞中的作用。方法:通过Ambion专用软件对Caveolin-1基因编码区分析,设计合成短发夹RNA(shRNA)单... 详细信息

目的:利用小干扰RNA(siRNA)技术建立人脐静脉内皮细胞(ECV304)小凹蛋白(Caveolin-1)基因沉默模型,为研究Cave-olin-1基因在人脐静脉内皮细胞中的作用。方法:通过Ambion专用软件对Caveolin-1基因编码区分析,设计合成短发夹RNA(shRNA)单链。通过T4连接酶将退火反应合成的shRNA双链克隆入含RNA PolIII聚合酶表达元件的pENTRTM/U6入门载体,并利用Gateway技术构建相应的慢病毒RNA干扰(RNAi)表达载体。用REAL-TIME RT-PCR、蛋白印迹法分析沉默效率。结果:测序结果显示pEN-TRTM/U6载体插入的Cavelin-1基因shRNA序列大小及阅读框架正确。LR重组反应后成功构建了针对Caveolin-1基因的RNAi慢病毒表达系统。转染ECV-304细胞获得对Caveolin-1的沉默效率大于85%。结论:成功地构建了针对Caveolin-1基因的RNAi慢病毒表达系统,获得了长期稳定的基因剔除效应。人脐静脉内皮细胞Caveolin-1基因沉默模型能长期保种及传代,为进一步研究Cav-eolin-1基因的功能奠定了基础。

关键词： Caveolin-1 人脐静脉内皮细胞 siRNA 慢病毒表达系统

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gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：欧阳伟朱向东王永山王永强潘群兴毕振威王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21和3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。用VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得了过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1mL)。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染的DF-miR-21细胞,用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) miRNA gga-miR-21 慢病毒表达系统病毒复制

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