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FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤A549细胞的影响

中国医学科学院学报 2015年第6期37卷 645-649页

作者：李瑾昱朱艳云张国庆孙胜杰焦顺昌中国人民解放军总医院肿瘤内一科北京100853

目的探讨FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用杀伤A549细胞的影响。方法选取肺腺癌A549细胞作为靶细胞,NKTm细胞为效应细胞。基因测序法检测NKTm细胞FCGR3A基因多态性,CCK-8法检测西妥昔单抗介导NKT... 详细信息

目的探讨FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用杀伤A549细胞的影响。方法选取肺腺癌A549细胞作为靶细胞,NKTm细胞为效应细胞。基因测序法检测NKTm细胞FCGR3A基因多态性,CCK-8法检测西妥昔单抗介导NKTm细胞的ADCC活性。结果 NKTm细胞FCGR3A具有基因多态性,分别为V/V、V/F及F/F表型。西妥昔单抗介导3种表型的NKTm细胞的ADCC活性差异具有统计学意义(P=0.0015),其中FCGR3A-158V/V表型的NKTm细胞的ADCC活性比V/F及F/F表型强(P<0.01),而V/F与F/F表型的NKTm细胞ADCC活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论西妥昔单抗介导的NKTm细胞ADCC活性与FCGR3A基因多态性有关。

关键词：西妥昔单抗 A549细胞 FCGR3A 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用

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溶瘤呼肠孤病毒联合CD30/CD16A双特异性抗体对NK细胞介导的ADCC效应的影响

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贵州医科大学学报 2021年第1期46卷 1-8,15页

作者：廖春香龙世棋安媛媛车启元王念雪陈亮杨薇赵星贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心贵州贵阳550004 贵州医科大学基础医学院免疫学教研室贵州贵阳550004 安顺市人民医院胸甲乳外科贵州安顺561000 贵州医科大学临床医学院肿瘤学教研室贵州贵阳550004

目的探究溶瘤呼肠孤病毒(reovirus)联合CD30/CD16A双特异性抗体(Bs Abs)对自然杀伤细胞(NK)活性及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的影响。方法采集健康献血者肝素抗凝静脉血30 m L,分离外周血单个核细胞(PBMC),采用免疫磁珠筛... 详细信息

目的探究溶瘤呼肠孤病毒(reovirus)联合CD30/CD16A双特异性抗体(Bs Abs)对自然杀伤细胞(NK)活性及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的影响。方法采集健康献血者肝素抗凝静脉血30 m L,分离外周血单个核细胞(PBMC),采用免疫磁珠筛选获得NK细胞,采用流式细胞术检测NK细胞纯度;溶瘤呼肠孤病毒(reovirus)预处理NK细胞(Reo-NK组),以单独NK组为对照,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测2组NK细胞的活化作用;reovirus联合(CD30/CD16A) Bs Ab杀伤KARPAS-299细胞,分为Ig G1处理组(Ig G1+NK组)、CD30/CD16A处理组(CD30/CD16A+NK组)、病毒联合Ig G1处理组(Ig G1+Reo-NK组)及病毒联合CD30/CD16A处理组(CD30/CD16A+Reo-NK组),采用LDH释放实验检测各组NK细胞的活化作用,采用流式细胞术检测各组NK细胞表面活化标注物CD69和细胞毒性颗粒CD107a的表达;用reovirus联合(CD30/CD16A) Bs Ab处理NK细胞(Reo-NK+CD30/CD16A组),以NK联合(CD30/CD16A) Bs Ab为对照(NK+CD30/CD16A组),采用LDH释放试验检测2组NK细胞对Raji细胞的杀伤效应。结果体外新鲜分离的NK细胞纯度可达70%以上;与单独NK细胞组相比,Reo-NK组DLD-1细胞的杀伤率明显增高(P<0.01);KARPAS-299细胞上CD30分子的阳性率高达90%以上;Ig G1与(CD30/CD16A) Bs Ab抗体浓度大于1.00×10^-12mol/L时,与NK+Ig G1组相比,NK+CD30/CD16A组促进KARPAS-299细胞死亡率(P<0.05);与Reo-NK相比,Reo-NK+CD30/CD16A组能明显促进KARPAS-299细胞死亡率(P<0.01);随着reovirus滴度增加,NK细胞表面活化标致物CD69及细胞毒性物质CD107a阳性率随之上升;reovirus与(CD30/CD16A) Bs Abs相比可以进一步促进NK细胞的活化。结论 Reovirus可促进NK细胞的活化并增强其细胞毒作用,联合(CD30/CD16A) Bs Abs后可进一步促进NK细胞介导的ADCC效应。

关键词：抗体,双特异性呼肠孤病毒自然杀伤细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用溶瘤作用细胞毒效应

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抗TfR-双价抗体的构建、表达及其体外抗瘤效应研究

抗TfR-双价抗体的构建、表达及其体外抗瘤效应研究

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作者：唐红玲华中科技大学

学位级别：硕士

[背景及目的]转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)是细胞摄取铁的主要途径,分为TfR1和TfR2两种。其中TfR1又称为CD71,在正常细胞中表达较低,而在快速增殖的肿瘤细胞表面高表达,且肿瘤细胞表面的TfR与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10... 详细信息

[背景及目的]转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)是细胞摄取铁的主要途径,分为TfR1和TfR2两种。其中TfR1又称为CD71,在正常细胞中表达较低,而在快速增殖的肿瘤细胞表面高表达,且肿瘤细胞表面的TfR与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10～100倍,其表达水平与肿瘤的分期与预后息息相关。在肿瘤的靶向生物治疗中,如何获得特异性高且稳定性强的抗体是有待解决的关键问题。本课题旨在构建新型抗TfR双价抗体,建立稳定的真核表达细胞株,并探究其生物学效应,为其应用于靶向抗瘤研究奠定基础。[实验方法]1.抗TfR双价抗体表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC的构建以本课题组保存的鼠源型抗TfR-VH、TfR-VL为模板,设计引物通过Overlap-PCR的方法获得scFv。酶切后将其插入到pOptiVEC-Fc表达载体的Fc基因片段之前,构建抗TfR二价抗体真核表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC。2.抗TfR双价抗体真核表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC稳转细胞株(1)将TfR-scFv-Fc-pOptiVEC瞬时转染293T细胞,培养3天后,收集上清,ELISA试剂盒检测上清中抗体的含量,用FCM的方法检测3天细胞上清与CT11(稳定表达人TfR的CHO细胞系)及C14(空载对照的CHO细胞系)的结合活性及特异性;(2)将表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC线性化后电转真核细胞DG44(DHFR基因缺陷的CHO细胞),用无血清Opti培养基培养,同时添加甲氨喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选。细胞扩增后通过有限稀释法挑取单克隆,挑选出状态最佳的克隆,扩大培养后,收集上清,FCM检测上清与高表达TfR的细胞系Molt4的结合活性。3.抗TfR双价抗体的纯化及鉴定(1)扩大培养稳定表达抗TfR双价抗体的细胞株,收集上清,0.22μm的滤器过滤后通过Protein A预装柱,纯化获得抗TfR双价抗体;(2)SDS-PAGE检测抗体分子量及纯度;(3)用ELISA的方法检测抗体的浓度;(4)用ELISA的方法检测与TfR的亲和力,计算后得出一个常数。4.抗TfR双价抗体生物学效应的研究(1)FCM 法检测 HepG2.215、HepG2、MDA-MB-231、A549、Molt4、U266、KG-1a表面TfR的表达;(2)将3×104个靶细胞与6×105个PBMCs(效应细胞:靶细胞=20:1)在添加了抗TfR二价抗体(终浓度:6.25pmol/ml)的培养基中孵育5h。7-AAD染色后用FCM的方法检测抗TfR双价抗体联合PBMCs对高表达TfR的肿瘤细胞系介导的ADCC效应;(3)将3×104个靶细胞与补体(用量为20μl/100μl)在添加了抗TfR二价抗体(终浓度:6.25pmol/ml)的培养基中孵育3h。7-AAD染色后用FCM的方法检测抗TfR双价抗体联合补体对高表达TfR的肿瘤细胞系介导的CDC效应。[实验结果]1.抗TfR双价抗体表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC的构建以抗TfR抗体信号肽-VH和VL载体为模板,使用一段短的连接肽(G4S)3通过 Overlap-PCR 扩增获得 VH-Linker1-VL-Linker2(NheI/BamHI)序列,凝胶电泳位置与预测大小 800bp 左右一致。随后将 VH-Linker1-VL-Linker2(NheI/BamHI)序列和目的载体pOptiVEC-hFc用NotI/BamHI双酶切后,用连接酶将两者连接形成TfR-scFv-Fc表达载体,命名为TfR-scFv-Fc-pOptiVEC。通过克隆、酶切和测序鉴定证明抗TfR-scFv-Fc真核表达载体构建成功。TfR-scFv-Fc经哺乳动物细胞表达后可通过Fc段铰链区二硫键作用形成双链抗体(双价抗体),命名为TfR-Diabody。2.抗TfR双价抗体的表达(1)将TfR-scFv-Fc-pOptiVEC瞬时转染293T细胞后,3天后收集上清,ELISA试剂盒检测了上清中抗体的含量,结果显示为13.88mg/L,浓度可观。FCM检测瞬时转染细胞培养上清分别与CT11和C14的结合活性和特异性,结果表明培养上清与CT11的结合率为97.9%,而与C14的结合率仅为3.42%,证明表达上清中的抗体可与表达TfR的细胞株结合,且特异性较好;(2)TfR-scFv-Fc-pOptiVEC线性化后电转DG44细胞,培养过程中MTX加压筛选,一段时间后使用有限稀释法获得多株单克隆细胞株。ELISA检测各单克隆细胞株上清中抗体的浓度后,挑选出状态最好且相对高表达的稳转细胞株2号克隆,将其扩大培养后,收集上清,分别取上清100μl/

关键词：抗TfR双价抗体转铁蛋白受体抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用补体依赖的细胞毒作用

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CD16a对U937细胞联合西妥昔单抗杀伤结直肠癌细胞作用的影响

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重庆医学 2020年第6期49卷 866-871,878页

作者：梁正子曹飞龙颜登国王磊徐伟龙佑萍贵州医科大学附属医院结直肠肛门外科贵阳550004 江西省龙南县人民医院外科 341700

目的探讨CD16a表达变化对U937细胞联合西妥昔单抗杀伤结直肠癌细胞作用的影响。方法将CD16a基因通过慢病毒转染的方法导入U937细胞中,通过检测结肠癌细胞的增殖情况,凋亡情况,细胞周期,迁移、侵袭能力的变化来评价CD16a基因过表达后的U... 详细信息

目的探讨CD16a表达变化对U937细胞联合西妥昔单抗杀伤结直肠癌细胞作用的影响。方法将CD16a基因通过慢病毒转染的方法导入U937细胞中,通过检测结肠癌细胞的增殖情况,凋亡情况,细胞周期,迁移、侵袭能力的变化来评价CD16a基因过表达后的U937细胞对结直肠癌细胞杀伤力的影响。结果西妥昔单抗+CD16a过表达U937细胞组,西妥昔单抗+U937细胞组,西妥昔单抗组,U937细胞组,CD16a过表达U937细胞组,空白对照组乳酸脱氢酶(LDH)活性分别为(159.28±7.92),(126.69±17.62),(120.23±5.67),(124.10±16.44),(123.30±6.86)U/L和(95.90±11.44)U/L,西妥昔单抗+CD16a过表达U937细胞组能明显影响结直肠癌细胞的增殖;各组肿瘤细胞凋亡率分别为90.60%±3.57%,74.00%±7.51%,68.10%±8.03%,73.50%±30.67%,68.10%±8.02%和46.20%±17.27%,西妥昔单抗+CD16a过表达U937细胞组诱导肿瘤细胞凋亡率明显高于其余各组;CD16a过表达U937细胞组能够抑制体外培养结直肠癌细胞的侵袭能力。结论CD16a过表达的U937细胞能够增强西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤作用,能够抑制体外培养结直肠癌细胞的侵袭能力。

关键词：结直肠肿瘤抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用靶向治疗 CD16a

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抗人B7-1人-鼠嵌合抗体体内外抑瘤作用研究

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免疫学杂志 2015年第9期31卷 753-756页

作者：王艳茹邱玉华包头医学院护理学院 014060 苏州大学医学部免疫学系 215123

目的研究抗人B7-1人-鼠嵌合抗体ch-4E5对高表达B7-1分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji的抑瘤作用。方法自行制备ch-4E5,经流式细胞术(FCM)分析ch-4E5对Raji细胞膜型B7-1分子的识别及共育后细胞表面Fas及Fas L表达的改变,继而又经MTT法检测... 详细信息

目的研究抗人B7-1人-鼠嵌合抗体ch-4E5对高表达B7-1分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji的抑瘤作用。方法自行制备ch-4E5,经流式细胞术(FCM)分析ch-4E5对Raji细胞膜型B7-1分子的识别及共育后细胞表面Fas及Fas L表达的改变,继而又经MTT法检测细胞增殖的抑制效应;以人外周血PBMC为效应细胞,Raji为靶细胞,分析ch-4E5介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC);将Raji细胞经ch-4E5处理后接种Balb/c裸鼠,观察裸鼠成瘤时间并计算成瘤率。结果 ch-4E5与Raji细胞的阳性结合率为97.9%;该抗体可上调Raji表面Fas及Fas L的表达,其阳性表达率分别为15.8%及16.9%,与人Ig G1同型对照组5.1%和2.2%比较具有统计学意义(P<0.01);ch-4E5对Raji细胞增殖的抑制率为39.17%(P<0.01);介导的最大杀伤率为56.47%(P<0.01);经ch-4E5处理的Raji细胞接种Balb/c裸鼠,90 d的观察期内均未见肿瘤形成,而对照组成瘤率高达80%。结论抗人B7-1人-鼠嵌合抗体对高表达B7-1的肿瘤细胞具有抑瘤作用。

关键词： B7-1 嵌合抗体 B淋巴瘤抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用抑制作用

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