血管新生是一个动态的、多步骤的过程,现在已知大约70种疾病与血管新生紊乱相关。作者前期研究及文献报道均表明苦参黄酮类成分有明显抑制血管新生的作用,但其药效物质基础和作用机制尚未明确。该研究应用分子对接技术虚拟筛选苦参黄酮抑制血管新生的药效物质,搜集现已分离鉴定的126个苦参黄酮类化合物组成配体数据库,选择VEGF-a,TEK,KDR等6个与血管新生密切相关的靶点组成受体数据库,以DrugBank中对各靶点有抑制作用并已上市的小分子药物为参照,设定各靶点对应的已上市小分子药物最低打分为阈值,应用Discovery Studio 2.5(DS2.5)软件的LibDock模块进行分子对接,虚拟筛选出打分高于阈值且排名前10%的化合物共37个。对比分析了原配体、已上市药物和苦参黄酮作用于各靶点的主要活性位点,初步揭示了苦参黄酮抑制血管新生的作用机制,为研发血管新生抑制剂类药物提供了一定的参考。
乳腺癌是一种侵袭性较强的恶性肿瘤,临床治疗策略以手术切除为主,放化疗为辅。临床研究表明,手术切除后有1/3的患者发生复发和转移,其主要原因可能包括手术切除导致部分肿瘤细胞外溢、手术创伤引起的免疫抑制微环境及术后炎症诱导的局部血管新生。因此,通过解除手术部位的免疫抑制微环境从而激活机体的免疫杀伤活性,同时抑制肿瘤局部血管新生有望抑制乳腺癌的术后复发及转移的发生。目前针对肿瘤免疫治疗及抑制肿瘤血管新生的药物研究已经取得了一定的进展,但是仍有很多方面亟待改进,如药物的靶向性、体内循环时间、毒副作用等。多肽纳米药物的发展为解决这些问题提供了思路。多肽纳米药物由于具有(1)改善药物的溶解性和化学稳定性;(2)延长药物的血液循环时间;(3)通过靶向作用提高药物在肿瘤部位的蓄积等优势,在抗肿瘤领域具有广阔的应用前景。本课题针对乳腺癌术后易复发和转移这一临床问题,通过文献总结,采取免疫检查点阻断联合肿瘤新生血管抑制的策略,构建了一种多功能的多肽纳米药物,用于治疗乳腺癌的术后复发和转移。该多肽纳米药物由两亲性分子C18-C16Y-AAN-PPA-1通过分子自组装形成,其构成单元包括免疫检查点阻断肽PPA-1、疏水化改造的新生血管抑制肽C18-C16Y及酶切序列AAN。该纳米药物在高表达豆荚蛋白酶的肿瘤微环境中可被响应性切割,释放抗血管多肽C18-C16Y和免疫检查点阻断剂PPA-1。在实现抑制肿瘤血管新生的同时,调节免疫抑制微环境,激活T细胞,促进T细胞的增殖、分化及功能,实现增强免疫治疗的效果,从而抑制乳腺癌的术后复发和转移。本工作对设计构建的多肽纳米药物进行了理化性质表征、体外生物学效应、小鼠体内代谢和分布、体内抑制乳腺癌术后复发转移及安全性评价的研究,主要内容包括以下几个方面:多肽纳米药物的表征。通过芘荧光探针法测定两亲性分子C18-C16Y-AAN-PPA-1的临界胶束浓度约为8.1±1.1μM。随后通过透射电子显微镜和激光纳米粒度分布仪对形成的纳米药物(CAD)的形貌、粒径分布以及表面电势等情况进行了分析,结果显示CAD形貌为均一的球形结构,粒径为26.86±6.21 nm,表面电势为-13.63±1.79 m V,且稳定性良好。通过对豆荚蛋白酶处理前后CAD的形貌分析,验证了CAD对豆荚蛋白酶敏感的响应性。多肽纳米药物的体外生物学效应评价。首先通过划痕实验、Transwell侵袭实验和小管形成实验探讨了纳米药物对人脐静脉内皮细胞HUVEC的影响,结果表明多肽纳米药物CAD可明显抑制HUVEC的迁移及血管形成能力。通过蛋白免疫印迹实验分析了CAD对整合素下游信号通路的调控作用,结果显示多肽纳米药物通过下调PI3K-AKT下游蛋白的表达,抑制内皮细胞的迁移。此外,本工作采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测了CAD对肿瘤细胞的调控作用,结果显示CAD可明显抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。最后,通过流式细胞仪检测了CAD对于程序性死亡受体-配体(PD-1与PD-L1)的亲和力,结果表明CAD具有与PD-1竞争性结合PD-L1的能力。多肽纳米药物的体内分布及代谢研究。以脂溶性染料分子吲哚菁绿(ICG)标记纳米药物,通过采集不同时间点小鼠血液及主要脏器中荧光信号的强度,用于研究不同纳米药物在小鼠体内的分布及代谢行为。结果显示,和游离的ICG相比,纳米药物装载的ICG显著延长了游离ICG的血液半衰期。小鼠主要脏器的荧光分布统计结果显示,纳米药物在肿瘤部位有效富集,且富集量显著高于游离的ICG。多肽纳米药物体内抑制乳腺癌术后复发的疗效及机制研究。以荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞系4T1-Luc为对象,构建小鼠乳腺癌术后复发模型,用于评价纳米药物的疗效及机制研究。小鼠肿瘤体积变化曲线及离体肿瘤质量等结果显示纳米药物CAD具有显著的抑制小鼠乳腺癌术后复发的效果。此外,小鼠主要脏器的H&E染色结果显示纳米药物CAD可以显著减少乳腺癌术后远端转移灶的数量。小鼠肿瘤组织的免疫组化染色结果显示,纳米药物CAD可以有效抑制肿瘤血管的新生。本工作进一步采用流式细胞术分析了术后复发的肿瘤组织中免疫微环境的变化。与对照组相比,CAD显著增加了肿瘤组织中CD8T细胞的比例,同时分泌IFN-γ的CD8T细胞和NK细胞的量也明显增加。CAD可以显著上调肿瘤组织中干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)等免疫因子的水平。以上结果表明经过纳米药物CAD的治疗,有效激活了小鼠肿瘤部位的免疫应答,从而有效抑制了术后肿瘤的复发和转移。多肽纳米药物介导肿瘤治疗的安全性评价。通过监测治疗周期内小鼠的体重变化、治疗结束后小鼠的血清生化指标及主要脏器的H&E染色结果评价纳米药物CAD介导的肿瘤治疗的安全性。结果显示,治疗周期内,小鼠体重无明显下降;治疗结束后,小鼠肝脏和肾脏的血清生化
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