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抗siglec-9抗体fab段对LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应的作用研究

免疫学杂志 2022年第7期38卷 563-567,573页

作者：褚萨萨高峰张东辉付美丽刘兴徐成张乃春汪茂荣临沂市人民医院感染科 276000 东部战区总医院秦淮医疗区南京210002

目的初步探讨抗siglec-9抗体fab段在小鼠巨噬细胞上对LPS诱导的炎症反应的作用及其机制。方法将小鼠巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS+Ab组、Ab组,采用实时荧光定量PCR技术检测TNF-α、IFN-β、IL-1、IL-6等炎性细胞因子的mRNA水平;采用E... 详细信息

目的初步探讨抗siglec-9抗体fab段在小鼠巨噬细胞上对LPS诱导的炎症反应的作用及其机制。方法将小鼠巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS+Ab组、Ab组,采用实时荧光定量PCR技术检测TNF-α、IFN-β、IL-1、IL-6等炎性细胞因子的mRNA水平;采用ELISA检测炎性细胞因子的蛋白水平;通过Western blot初步探讨抗siglec-9抗体fab段影响炎性细胞因子表达量的作用机制。结果与LPS组相比,抗siglec-9抗体fab段抑制炎性细胞因子的mRNA和蛋白水平,降低TLR4信号通路磷酸化水平。结论抗siglec-9抗体fab段通过阻断TLR4信号传导通路抑制炎性细胞因子的m RNA和蛋白水平,在感染性疾病中具有潜在的应用价值。

关键词： siglec-9 抗siglec-9抗体fab段巨噬细胞炎性细胞因子

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抗siglec-9抗体fab段抑制脂多糖诱导的炎性反应的体外研究

抗Siglec-9抗体Fab段抑制脂多糖诱导的炎性反应的体外研究

引用

作者：褚萨萨安徽医科大学

学位级别：硕士

siglec-9属于免疫球蛋白超家族的成员,归属于CD33相关的siglec,通过识别含有唾液酸的糖链结构,在细胞增殖、活化以及凋亡和自噬方面发挥重要作用,同时参与调控机体的固有免疫和适应性免疫。siglec-9主要表达于免疫细胞,如中性粒细胞和... 详细信息

siglec-9属于免疫球蛋白超家族的成员,归属于CD33相关的siglec,通过识别含有唾液酸的糖链结构,在细胞增殖、活化以及凋亡和自噬方面发挥重要作用,同时参与调控机体的固有免疫和适应性免疫。siglec-9主要表达于免疫细胞,如中性粒细胞和单核细胞,在淋巴细胞和树突状细胞上也可表达。脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征,细菌内毒素刺激巨噬细胞产生大量的炎性因子,引起机体的抗炎因子和促炎因子失衡,严重时导致脓毒性休克和多器官功能衰竭。本课题主要是通过基因工程技术,制备、表达抗siglec-9fab段,并对其进行生物特性鉴定,通过体外活性实验进一步探讨该抗体在炎症方面发挥的作用。研究方法:1.制备抗siglec-9抗体fab利用前期筛选得到的阳性噬菌体,通过PCR技术扩增抗体轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）,经测序得到核酸和氨基酸序列并与数据库比对。根据核酸序列设计引物,通过重叠延伸PCR技术将抗体轻链恒定区（CL）和重链恒定区（CH1）分别与轻链可变区和重链可变区连接,获得重组轻链（L）和重链（Fd）。经过限制性核酸内切酶酶切,L和Fd与表达载体pETDUET-1连接,构建重组质粒pETDUET-1-fab。将重组质粒pETDUET-1-fab转入大肠杆菌BL21,加入IPTG诱导表达,经蛋白纯化系统得到抗siglec-9抗体fab段。2.抗Siglc-9抗体fab段与抗原结合能力的鉴定和抗体亲和力分析采用SDS-PAGE和Western blot鉴定抗siglec-9抗体fab段,ELISA、流式细胞仪和Biacore X100分别检测抗siglec-9抗体fab与siglec-9的特异性结合能力和抗体的亲和力。3.抗siglec-9抗体fab的体外实验抗siglec-9抗体fab作用于THP-1细胞分化的巨噬细胞和人单核外周血单核细胞来源的巨噬细胞,通过Q-PCR和ELISA分别检测炎性细胞因子的表达量,通过Western blot检测TLR4信号通路上蛋白磷酸化水平的变化。研究结果:1.通过PCR技术成功扩增抗体可变区,经测序验证未产生无功能基因或发生基因突变,利用重叠延伸PCR技术连接抗体的可变区和恒定区,得到重组重链Fd和轻链L,重组原核系统表达质粒pETDUET-1-fab成功构建。转入大肠杆菌BL21表达,经蛋白纯化系统纯化得到抗siglec-9抗体fab。***-PAGE和Western blot结果显示抗siglec-9抗体fab主要表达于上清中,分子量约27KD。ELISA、流式细胞仪结果显示抗siglec-9抗体fab特异性结合siglec-9。Biacore X100检测得亲和常数为6.58×10-7。3.Q-PCR和ELISA显示抗siglec-9抗体fab可有效的抑制促炎性细胞因子和促进抑炎性细胞因子的表达量,Western blot显示抗siglec-9抗体fab可抑制TLR4信号通路上蛋白的磷酸化水平。研究结论:本实验研究成功制备抗siglec-9抗体fab段,该抗体特异性结合siglec-9,并具有较高的亲和力,体外实验研究表明可明显抑制促炎性细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6和促进抗炎性细胞因子IL-10的mRNA水平和蛋白水平表达量,并且可抑制TLR4信号通路上蛋白的磷酸化,发挥抗炎保护作用。本研究通过基因工程得到的单克隆抗体,可能成为新的预防和治疗炎性相关疾病的方法。

关键词：抗siglec-9抗体fab段 siglec-9 LPS TLR4 炎性反应炎性细胞因子巨噬细胞

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