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湖南师范大学自然科学学报 2006年第2期29卷 93-96页

作者：周延凯聂东宋湖南师范大学生命科学学院中国长沙410081 湖南理工学院化学与化工系中国岳阳414000

运用数据库消减杂交（Digital Differential Display,DDD）分析方法,从大鼠睾丸组织中分离出了一个新基因-Lrrc18（GenBank登录号：BC081908）.该基因定位于大鼠染色体16p16区带,gDNA在染色体上跨度40900bp,含6个外显子,编码一个含256... 详细信息

运用数据库消减杂交（Digital Differential Display,DDD）分析方法,从大鼠睾丸组织中分离出了一个新基因-Lrrc18（GenBank登录号：BC081908）.该基因定位于大鼠染色体16p16区带,gDNA在染色体上跨度40900bp,含6个外显子,编码一个含256个氨基酸的蛋白,带有4个LRR（leucire-rich repeat domain）结构域.Northern杂交结果显示Lrrc18只在睾丸中表达.对出生后3～56 d不同时期的大鼠睾丸的Lrrc18基因的表达进行检测,结果表明在大鼠出生后21 d时开始在睾丸组织中可检测到Lrrc18的mRNA表达,以后其表达量逐步上升,到42 d时达到最大值.该结果提示：Lrrc18基因在精子的发生过程中可能起重要作用.

关键词：精子发生数据库消减杂交亮氨酸串联重复结构 Lrrc18基因

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小鼠睾丸和卵巢特异表达基因Zfp474的克隆与特征分析

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Acta Genetica Sinica 2005年第2期32卷 155-162页

作者：周畅李麓芸卢光中南大学生殖与干细胞工程研究所

运用NCBI中的数据库消减杂交 (DigitalDifferentialDisplay ,DDD)分析方法 ,从小鼠睾丸组织中分离了一个含有C2HC/C3H结构的新型锌指蛋白基因———Zfp4 74 (GenBank登录号 :AY35 0 70 9)。通过推导和进一步的RT PCR实验证实 :该基因含 ... 详细信息

运用NCBI中的数据库消减杂交 (DigitalDifferentialDisplay ,DDD)分析方法 ,从小鼠睾丸组织中分离了一个含有C2HC/C3H结构的新型锌指蛋白基因———Zfp4 74 (GenBank登录号 :AY35 0 70 9)。通过推导和进一步的RT PCR实验证实 :该基因含 4个外显子 ,gDNA在染色体上跨度 2 986 9bp ,定位于小鼠染色体 1 8D1。cDNA编码一个含 347个氨基酸的新蛋白 ,带有C2HC/C3H结构域。Northern杂交结果显示 :该基因含有 2 37kb大小的唯一转录本 ,主要在睾丸中强表达 ,卵巢中有表达 ,而在其他组织中该基因无表达。结果提示 :Zfp4

关键词：数据库消减杂交表达序列标签小鼠Zfp474基因

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一个新的人类睾丸特异基因的cDNA克隆和表达分析

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Acta Genetica Sinica 2004年第6期31卷 545-551页

作者：李丹卢光琇傅俊江莫亚勤邢晓为刘刚中南大学生殖与干细胞工程研究所

运用“数据库消减杂交”(DigitalDifferentialDisplay)方法筛选人类睾丸特异表达新基因 ,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群 ,挑选其中一个克隆重叠群HS .12 9794进行多组织RT PCR ,初步证实该重叠群在人睾丸中有高表达。然后... 详细信息

运用“数据库消减杂交”(DigitalDifferentialDisplay)方法筛选人类睾丸特异表达新基因 ,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群 ,挑选其中一个克隆重叠群HS .12 9794进行多组织RT PCR ,初步证实该重叠群在人睾丸中有高表达。然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发 ,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列 ,其全长 2 4 30bp ,开放阅读框为 6 76～ 12 4 8bp ,定位于 3p2 1 1,编码由 190个氨基酸组成 ,分子量为 2 0 4 17 8Da ,等电点为 5 2 3的一个偏酸性蛋白质 ,该蛋白与已知蛋白质无明显同源性。克隆实验验证该基因阅读框完全正确 ,半定量RT PCR进一步显示该基因在人不同发育时期的睾丸及精子细胞中有表达 ,推测其可能与精子生成相关 ,暂命名为SRG5 (TestisSpermatogenesisRelatedGene 5 ,SRG5 ) (GenBank登录号 :AY2 2 1117)。SRG5基因的成功克隆表明 ,“数据库消减杂交”与实验验证相结合的技术路线是一种快捷高效的发现更多人类功能新基因的新策略。

关键词：基因克隆数据库消减杂交逆转录聚合酶反应睾丸组织特异表达

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一个新的睾丸特异表达基因的克隆及功能的初步分析(英文)

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Acta Genetica Sinica 2005年第4期32卷 337-345页

作者：聂东宋朱文兵向阳王建谭小军邓云卢光琇中南大学生殖与干细胞工程研究所长沙410078

运用'数据库消减杂交'(digital differential display )方法来筛选人类睾丸特异表达新基因,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群.挑选其中一个克隆重叠群HS.326528进行多组织RT-PCR,初步获得该重叠群在人睾丸中有高表达.... 详细信息

运用'数据库消减杂交'(digital differential display )方法来筛选人类睾丸特异表达新基因,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群.挑选其中一个克隆重叠群HS.326528进行多组织RT-PCR,初步获得该重叠群在人睾丸中有高表达.从该重叠群的IMAGE出发,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列,其全长1 044 bp,开放阅读框为214～529 bp,定位于15q26.2,编码由105个氨基酸组成、分子量为11.7 kD、等电点为10.09的一个碱性蛋白,该蛋白与已知蛋白无明显的同源性,克隆实验证明该基因的阅读框完全正确,RT-PCR和Northern blot显示该基因在人类睾丸中特异表达,实时PCR结果表明:该基因在成人睾丸中高表达,在精子中有中度表达,在胚胎睾丸中低表达,推测该基因与精子的生成有关,命名为SRG8(homo sapiens spermatogenesis -related gene 8)(GenBank登录号:AY489187),该基因编码的蛋白定位于细胞核.流式结果分析表明,SRG8基因能够促使HeLa细胞由S期向G2期的转变,从而加速细胞的分裂.这些结果表明SRG8基因可能在睾丸的发育及精子的形成过程中起重要的作用.

关键词：数据库消减杂交睾丸实时定量PCR 组织特异表达

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一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆

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中国男科学杂志 2006年第7期20卷 3-8页

作者：蒋先镇阳建福汤育新谭小军李辉张向阳吴畏中南大学湘雅三医院泌尿外科中南大学生殖与干细胞工程研究中心中南大学肿瘤研究所中南大学湘雅医院泌尿外科

目的克隆一个新的人睾丸特异性基因。方法运用“数据库消减杂交”(Digital Differential Display,DDD)方法筛选人类睾丸特异表达新基囚,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重替群Hs．180197进行多组织RT-PCR验证... 详细信息

目的克隆一个新的人睾丸特异性基因。方法运用“数据库消减杂交”(Digital Differential Display,DDD)方法筛选人类睾丸特异表达新基囚,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重替群Hs．180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达。然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学的方法克隆一个人类新基因的全长cDNA序列。结果新基因全长1197bp,开放阅读框为504～806bp,定位于6p21．1-p21．2,编码由100个氨基酸组成,分子量为10KD,等电点为6．81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性。克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(Testis Development Related Gene 1),GenBank登录号为DQ168992。结论“数据库消减杂交”与实验验证相结合用于发现更多人类功能新基因是行之有效的。

关键词：基因克隆数据库消减杂交逆转录聚合酶反应睾丸组织特异表达

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人类睾丸特异表达新基因septin 12 transcript variant 2的克隆与表达分析

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中国男科学杂志 2008年第3期22卷 6-10页

作者：蒋先镇汪金荣汤育新中南大学湘雅三医院泌尿外科长沙410013

目的克隆一个新的人类睾丸特异表达基因,并分析其组织表达谱。方法运用"数据库消减杂交"(Digital Differential Display,DDD)方法筛选出在人类睾丸组织中显著高表达并代表新基因的克隆重叠群Hs.126780,对该克隆重叠群进行同... 详细信息

目的克隆一个新的人类睾丸特异表达基因,并分析其组织表达谱。方法运用"数据库消减杂交"(Digital Differential Display,DDD)方法筛选出在人类睾丸组织中显著高表达并代表新基因的克隆重叠群Hs.126780,对该克隆重叠群进行同源性搜索、序列匹配、延伸,获得新基因的cDNA全长序列;生物信息学方法分析和预测新基因结构和功能;多组织RT-PCR实验分析新基因的组织表达谱。结果新基因cDNA全长为1524bp,开放阅读框为1077bp,编码蛋白质由358个氨基酸组成,基因定位于16p13.3,多组织RT-PCR证实新基因为人类睾丸特异性基因。新基因暂命名为:septin 12 transcript variant 2(SEPT12),GenBank登陆号为:EF620906.1。结论利用数据库消减杂交等生物信息学方法和实验相结合克隆新的睾丸特异性基因高效、可行,新基因septin 12 transcript variant 2为人类睾丸特异表达基因。

关键词：数据库消减杂交睾丸基因表达谱

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一个人类睾丸特异表达新基因-septin 12 transcript variant 2的克隆与功能初步研究

一个人类睾丸特异表达新基因-septin 12 transcript variant 2的...

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作者：汪金荣中南大学

学位级别：博士

不育影响着大约10-15%的夫妻,不育的原因夫妻双方约各占一半。遗传因素是男性不育的一个重要因素,男性不育患者染色体检查常常发现有基因缺失、突变或易位。因此生精相关基因的研究对男性不育的诊断和治疗有着重要的意义。精子的发生是... 详细信息

不育影响着大约10-15%的夫妻,不育的原因夫妻双方约各占一半。遗传因素是男性不育的一个重要因素,男性不育患者染色体检查常常发现有基因缺失、突变或易位。因此生精相关基因的研究对男性不育的诊断和治疗有着重要的意义。精子的发生是一个非常复杂而又受到精确调控的过程,分为有丝分裂阶段、减数分裂阶段和减数分裂后阶段,其中涉及一系列基因的调控,人类的研究表明有2000个以上的基因参与了生精过程,而参与这一过程的蛋白质更多。随着人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)的实施和生物技术的飞速发展,人类基因组测序数据呈指数增长,各种生物数据库及其分析软件相应建立,极大地促进了生物信息学的发展。利用生物信息学克隆新基因和分析基因功能已成为生物信息学研究的热点,大量的新基因被克隆,其中包括不少生精相关基因。本课题尝试利用生物信息学方法寻找新的生精基因,并对其功能进行预测和初步研究,分析该基因在精子生成过程中的作用,有助于进一步了解精子发生的分子机制。第一章:睾丸特异表达新基因的克隆精子的生成是一个受多基因调控的过程,目前已发现一系列与精子发生相关的基因,但仍有许多未知基因涉及精子的发生,精子发生与调控的机制仍未阐明。利用生物信息学方法发现新基因是寻找新基因的一条捷径,我们尝试通过数据库消减杂交(DigitalDifferential Display,DDD)方法发现一新的睾丸特异表达基因,并以RT-PCR实验验证。以因特网UniGene数据库的人类各组织cDNA文库为实验材料,以DDD软件为工具,比较人类睾丸组织和其它组织的cDNA文库,筛选出在睾丸组织中显著高表达并可能代表新基因的的克隆重叠群,将获得的克隆重叠群内的EST(expressed sequence tag)进行同源搜索、拼接和延伸,得到一较长的新基因序列。根据新基因序列设计引物进行PCR反应验证序列拼接是否正确及新基因的真实性。通过数据库消减杂交(DDD),找到一个在睾丸组织cDNA文库和非睾丸组织cDNA文库中显著差异表达的克隆重叠群Hs.126780,生物信息学分析显示其在睾丸组织中高表达。Hs.126780重叠群包括39条EST,将EST进行拼接、延伸后获得一个新的基因序列,长为1524bp,其中包含一个完整的阅读框架,长1077 bp,编码一358氨基酸的蛋白质,新基因有10个外显子和9个内含子。PCR反应并测序证实新基因序列拼接正确,且在人类睾丸组织中表达。利用生物信息学克隆睾丸特异表达新基因是一种切实可行、高效的新方法,我们运用该方法成功地克隆了一个人类睾丸特异表达新基因,将新基因序列向GenBank数据库提交并被收录,经人类基因命名委员会(Human GeneNomenclature Committee,HGNC)命名为:septin 12 transcriptvariant 2,基因登陆号为:DQ517531。第二章:新基因及其编码蛋白质的生物信息学分析在对新基因(septin 12 transcript variant 2)的功能进行研究前我们先利用网络上各种生物学软件,对新基因及其编码的蛋白质进行分析和预测,初步了解新基因的一些特性,为后继的研究提供指导。利用NCBI的Blast程序对新基因及编码蛋白质进行同源性分析;以BLAST Human Sequences程序进行电子染色体定位;以BioEdit7.0.1软件分析新基因的酶切位点;运用PSORTⅡ软件预测蛋白质细胞内定位;运用ExPASy网站的多个软件对新基因编码蛋白质的理化性质、跨膜区和信号肽序列、疏水性,功能位点进行分析和预测。生物信息学分析显示新基因与Septin家族多个成员的基因和蛋白质序列有同源性,属于Septin家族基因,该基因无EcoRI、SalI和XhoI酶切位点,基因定位于人类染色体16p13.3,其编码蛋白质的氨基酸序列为358个,分子量为40747D,等电点为6.67。蛋白质细胞内定位:线粒体(可能性为56.5%);胞浆(可能性为17.4%)。无明显跨膜序列和信号肽,推测为非分泌蛋白,有多个磷酸化位点和其它翻译后修饰位点。第三章:新基因功能的初步研究基因研究的最终目的是了解其功能,我们进行了多组织RT-PCR(multi-tissue RT-PCR)、Northern印迹杂交(Northern Blots)和原位杂交(in situ hybridization)实验,对新基因的组织表达谱和功能进行了初步研究,并构建了新基因的真核表达载体。多组织RT-PCR和Northern印迹杂交结果显示新基因在成年男性睾丸组织中高表达,在其它组织中不表达;胎儿除睾丸组织外,在其它少数组织中有微弱表达。新基因在成年睾丸组织中表达最强,在老年睾丸组织中表达

关键词：生物信息学电子克隆数据库消减杂交精子发生睾丸特异性表达基因

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人类精子发生相关新基因SPATA12的分子克隆及功能初步研究

人类精子发生相关新基因SPATA12的分子克隆及功能初步研究

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作者：李丹中南大学

学位级别：博士

摘要越来越多的研究表明,生精障碍是导致男性不育的重要因素之一.精子生成是一个复杂的细胞发育与分化的过程,受一个由多个基因参与的基因网络的高度调控,这些基因可能既存在性染色体上,也存在常染色体上.分离生精相关基因是男性不育研... 详细信息

摘要越来越多的研究表明,生精障碍是导致男性不育的重要因素之一.精子生成是一个复杂的细胞发育与分化的过程,受一个由多个基因参与的基因网络的高度调控,这些基因可能既存在性染色体上,也存在常染色体上.分离生精相关基因是男性不育研究中的一个重要课题,研究和发现这些基因,对于阐明精子发生的机制具有重要的生理和病理学意义.该研究运用数据库消减杂交方法这一新策略结合实验手段成功克隆了一个人类睾丸生精细胞相关的新基因SPATA12,并采用Northern blot、SYBR Real-Time RT-PCR、组织原位杂交、Western blot、免疫组化及流式细胞仪技术等多种方法联合对SPATA12基因的表达特征及可能的功能进行了综合研究,各方法之间相互印证,结果可靠.我们认为,SPATA12基因是一个具有重要生理功能的新基因,它可能在人类精子的发生以及抑制睾丸生殖细胞肿瘤的形成中具有重要作用.

关键词：数据库消减杂交基因克隆 Real-time RT-PCR 睾丸特异性表达基因精子生成功能研究

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一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆及表达分析

一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆及表达分析

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作者：阳建福中南大学

学位级别：博士

越来越多的研究表明，生精障碍是导致男性不育的重要因素之一。精子生成是一个复杂的细胞发育与分化的过程，受一个由多个基因参与的基因网络的高度调控，这些基因可能既存在性染色体上，也存在常染色体上。分离生精相关基因是男性不育... 详细信息

越来越多的研究表明，生精障碍是导致男性不育的重要因素之一。精子生成是一个复杂的细胞发育与分化的过程，受一个由多个基因参与的基因网络的高度调控，这些基因可能既存在性染色体上，也存在常染色体上。分离生精相关基因是男性不育研究中的一个重要课题，研究和发现这些基因，对于阐明精子发生的机制具有重要的生理和病理学意义。本课题运用了一种发现人类新基因的新策略“数据库消减杂交”（Digital Differential Display，DDD）——即通过计算机对不同文库进行比较来发现在统计学意义上存在明显转录差异基因的定量分析方法，结合RT-PCR、Northern杂交等实验验证成功克隆了一个人类睾丸组织特异性表达的新基因，并探讨了其与精子发生的关系。本研究分为2个部分，其主要实验方法及实验结果如下：第一部分：数据库消减杂交方法克隆人类睾丸组织特异性表达新基因TDRG1 1 新基因的电子克隆美国NCBI的Unigene数据库中拥有大量的表达序列标签（EST），它们来源于不同组织、不同细胞、不同病理状态下所构建的cDNA文库，已成为人们寻找新基因的重要标志物。Digital DifferentialDisplay（DDD）是一种利用Unigene数据库中的ESTs进行数种平行材料之间的比较的方法。运用该方法，我们进行了两种平行材料之间的比较：挑选9个人类睾丸组织来源的cDNA序列文库作为检测子，并将之归为pool A;将76个人类其他组织或细胞株来源的cDNA文库序列作为驱赶子，并将之归为pool B;通过pool A：pool B之间的比值来计算倍数差异，并以≥10倍的差异为筛选标准，经数据库杂交筛选获得在统计学意义上存在差异显示的克隆重叠群。在获得的29个全新克隆重叠群中，Hs.180197是其中一个其差异表达最显著的克隆重叠群，生物信息学分析显示其代表一个新基因，我们将之作为本课题的研究重点。Hs．180197包括3个EST，运用EST拼接工具进行序列匹配、整合，获得了一个新的未知序列contig1。将contig1与EST Human数据库比较，发现该序列包含另

关键词：基因克隆数据库消减杂交逆转录聚合酶反应睾丸特异性表达基因精子生成

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一个新的人类锌指蛋白基因ZNF474的cDNA克隆和表达分析

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生命科学研究 2004年第4期8卷 306-313,343页

作者：周畅李麓芸卢光琇湖南师范大学生命科学学院中南大学生殖与干细胞工程研究所中国湖南长沙410078 中南大学生殖与干细胞工程研究所

数据库消减杂交就是利用NCBI中的Unigene数据库中大量的数据资源,收集各种细胞或组织的基因表达谱进行两两比较或多重比较,获得两组文库间有统计学意义的差异表达基因.运用NCBI中的数据库消减杂交分析方法,从人睾丸组织中分离了一个含有... 详细信息

数据库消减杂交就是利用NCBI中的Unigene数据库中大量的数据资源,收集各种细胞或组织的基因表达谱进行两两比较或多重比较,获得两组文库间有统计学意义的差异表达基因.运用NCBI中的数据库消减杂交分析方法,从人睾丸组织中分离了一个含有C2H2结构的新型锌指蛋白基因—ZNF474(GenBank登录号:AY461732).通过推导和进一步的RT-PCR实验证实:该基因含2个外显子,gDNA在染色体上跨度30065bp,定位于人染色体***编码一个含364个氨基酸的新蛋白,分子质量是40.3kDa,等电点为***杂交结果显示:该基因含有2.37kb大小的唯一转录本,主要在睾丸中很强表达,卵巢中有弱表达,而其他组织中该基因无表达.结果提示:ZNF474基因对精子发生和卵母细胞的发育可能起重要作用.

关键词：数据库消减杂交表达序列标签人类ZNF474基因

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