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福建农业学报 2024年第9期39卷 1044-1050页

作者：陈炜梁齐章张佳雪焦文龙林永强刘荣昌傅秋玲傅光华朱婷黄瑜福建农林大学动物科学学院福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

【目的】建立新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck parvovirus,N-MDPV)荧光RPA恒温检测方法,为基层提供可视化快速检测技术手段。【方法】以N-MDPV的VP3基因保守片段为靶点,使用EXO荧光探针特定结合VP3基因保守片段,设计特异的... 详细信息

【目的】建立新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck parvovirus,N-MDPV)荧光RPA恒温检测方法,为基层提供可视化快速检测技术手段。【方法】以N-MDPV的VP3基因保守片段为靶点,使用EXO荧光探针特定结合VP3基因保守片段,设计特异的RPA扩增引物并利用重组酶聚合酶扩增技术扩增目的基因,从而建立一种荧光RPA恒温检测N-MDPV的方法,确定反应体系的最佳反应时间和温度,分析该方法特异性和灵敏性;对收集的病料进行核酸检测,并与传统PCR和病毒分离鉴定方法检测结果进行比较。【结果】建立的荧光RPA恒温检测方法最佳反应温度为39℃,最佳反应时间为30 min;灵敏性高,最低核酸检测限度可达10 fg·μL^(−1);对新型番鸭细小病毒核酸进行特异性扩增,结果显示对鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)、禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)、鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)、鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)和新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的核酸均未有发生交叉反应,特异性良好。利用本研究建立的RPA快检方法、传统PCR方法以及病毒分离鉴定方法对收集的38份鸭组织病料核酸样品进行检测,结果显示阳性率分别为36.8%(14/38)、36.8%(14/38)和31.6%(12/38);RPA检测后呈阳性的样品经PCR方法检测与病毒分离鉴定方法检测均呈现阳性,阳性符合率为100%。【结论】该方法可以很好地应用于缺乏相应检测设备的基层进行新型番鸭细小病毒的大规模临床样本检测,为新型番鸭细小病毒的可视化快速检测提供技术手段。

关键词：新型番鸭细小病毒 RPA恒温检测重组酶聚合酶扩增技术

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新型番鸭细小病毒Rep蛋白羧基端亚片段的原核表达及多克隆抗体制备

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福建农业学报 2023年第8期38卷 889-893页

作者：胡非凡梁齐章黄瑜福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

【目的】获得特异性识别新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck Parvovirus,N-MDPV)Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【方法】通过蛋白序列分析,选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487~627 aa,后全基因合成序列,并在其C末端添加His... 详细信息

【目的】获得特异性识别新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck Parvovirus,N-MDPV)Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【方法】通过蛋白序列分析,选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487~627 aa,后全基因合成序列,并在其C末端添加His-tag标签,利用无缝克隆的方法,将该段基因克隆至pET-28a(+)载体,随后转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,诱导表达得到重组蛋白。利用镍柱亲和层析技术纯化表达重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备针对Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【结果】构建了pET-28a-Rep-487-627原核表达质粒,纯化表达了该重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白分子大小约24 kDa,主要以可溶性形式表达。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明制备的多克隆抗体能与细胞内过表达的N-MDPV Rep蛋白特异性反应。【结论】制备的Rep多克隆抗体具有良好反应特异性,可识别Rep蛋白的构象表位和线性表位,满足进一步研究的需要。

关键词：新型番鸭细小病毒 Rep蛋白间接免疫荧光试验免疫印迹试验

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新型番鸭细小病毒的发现及其感染的临床表现

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福建农业学报 2015年第5期30卷 442-445页

作者：黄瑜万春和傅秋玲陈红梅傅光华陈翠腾程龙飞程小兵施少华林建生福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地部分鸭场或养鸭户的雏半番鸭和台湾白鸭出现低病死率,约于40日龄起脚易断、上喙变短占近30%,至出栏时残次鸭达60%;免疫接种了雏番鸭细小病毒弱毒活疫苗的雏番鸭依然发生类雏番鸭&qu... 详细信息

2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地部分鸭场或养鸭户的雏半番鸭和台湾白鸭出现低病死率,约于40日龄起脚易断、上喙变短占近30%,至出栏时残次鸭达60%;免疫接种了雏番鸭细小病毒弱毒活疫苗的雏番鸭依然发生类雏番鸭"三周病",除出现死亡外,幸存鸭的番鸭翅脚易断、上喙变短,83%感染鸭成为僵鸭,对我国养鸭业造成了较大的直接经济损失。经病原学检测、病毒分离鉴定和实验室感染试验,发现其病原为与原经典的雏番鸭细小病毒(MDPV)在基因组上、感染宿主范围和致病性存在较大差异的番鸭细小病毒,鉴于此,将之暂定名为新型番鸭细小病毒(NMDPV)。

关键词：新型番鸭细小病毒雏番鸭雏半番鸭临床感染上喙变短

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新型番鸭细小病毒对骨形态发生蛋白的影响

新型番鸭细小病毒对骨形态发生蛋白的影响

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作者：胡非凡福建农林大学

学位级别：硕士

番鸭细小病毒(Muscovy Duck Parvovirus,MDPV)是细小病毒科细小病毒亚科依赖细小病毒属成员,仅侵害番鸭,主要引起3周龄内雏番鸭发病死亡。于2008年,在福建地区的雏半番鸭出现“短喙、生长迟缓”的疫病,本研究室等对该类病例开展了流行... 详细信息

番鸭细小病毒(Muscovy Duck Parvovirus,MDPV)是细小病毒科细小病毒亚科依赖细小病毒属成员,仅侵害番鸭,主要引起3周龄内雏番鸭发病死亡。于2008年,在福建地区的雏半番鸭出现“短喙、生长迟缓”的疫病,本研究室等对该类病例开展了流行病学调查和病原学研究,确定其病原为与MDPV在基因组、感染宿主范围、抗原性和致病性上存在较大差异的新型番鸭细小病毒(Newgenotype Muscovy Duck Parvovirus,N-MDPV)。在感染宿主上,该病毒不仅侵害番鸭,还侵害半番鸭和白改鸭;在致病性上,不仅引起经典番鸭细小病毒所致病变,还引起感染鸭短喙和生长迟缓,对我国养鸭业造成了巨大的经济损失。N-MDPV引起的番鸭、半番鸭和白改鸭短喙、软脚、翅脚易断和生长发育不良与骨骼的异常发育有着紧密的联系。骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)是转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)家族分泌的细胞外基质(ExtracellμLar Matrix,ECM)相关蛋白。BMPs在骨的形成和发育方面尤为重要。相关研究表明,BMP1蛋白酶家族的编码基因发生突变可导致伴有成骨发育不全,BMP2与骨再生有关已被用于骨的再生与重建和骨缺损的修复,BMP3和BMP4参与成骨细胞分化,还与生长减慢、骨骼特征、牙齿异常和独特的头面部外观为特征的发育障碍有关。BMP2、BMP4和BMP7与鸟类喙形状的多样化相关,各项研究证明可以通过调节BMPs途径改变喙的大小和形状。NMDPV感染番鸭、半番鸭和白改鸭短喙、软脚、翅脚易断和生长发育不良的发病机制尚不清楚,国内外尚未报道。在N-MDPV感染引起的此临床症状是否与BMPs相关信号传导机制有关和N-MDPV感染对宿主BMPs的基因表达水平是否存在一定的影响等方面的研究未见报道。本研究运用了实时荧光定量RT-qPCR(Reverse transcriptionquantitative polymerase chain reactions)、免疫共沉淀(CoImmunoprecipitation,Co-IP)和蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)等实验方法,从mRNA水平和蛋白水平探究了N-MDPV对BMPs表达的影响。结果如下:1.通过在6、8、10、14、18日龄等不同时间的番鸭胚分离并培养原代鸭胚成纤维细胞(Muscovy Duck Embryo Fibroblast,MDEF),在24、48、72、96小时等不同培养时间进行实时荧光定量RT-PCR检测的BMPs基因表达水平的差异。结果显示,在番鸭胚10日龄分离MDEF培养24 h时,BMPs基因的表达量最高,是我们进行病毒感染的最佳时间点。筛选出了BMPs表达量较高的鸭胚日龄和细胞培养时间,在该时间点制备MDEF,可为后续N-MDPV感染与BMPs表达量的检测提供较好的细胞模型。2.N-MDPV FJM3和MDPV GDCC感染MDEF后,随着时间的延长BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7基因的表达水平整体下调,其中96 h、120 h最为显著。表明了N-MDPV对MDEF宿主因子BMPs基因表达量存在影响,为筛选N-MDPV潜在BMPs家族互作蛋白和在细胞层面初步探究N-MDPV结构蛋白调控BMPs信号传导机制奠定了坚实基础。3.将BMP2、BMP4、BMP5、BMP7和N-MDPV的Rep蛋白的真核表达质粒分别共转染293T细胞,通过免疫共沉淀实验鉴定出BMP2、BMP4、BMP5和N-MDPV的Rep在细胞内存在明显的相互作用,该结果提示N-MDPV结构蛋白Rep可能与BMPs信号传导机制有关。4.通过Rep蛋白羧基端亚片段487aa-627aa的表达与纯化、NMDPV的间接免疫荧光检测和N-MDPV感染细胞中Rep蛋白的鉴定等实验。结果显示目的蛋白主要以可溶性形式表达,目的蛋白纯化后作为免疫原免疫兔制备了多克隆抗体,以该抗体进行免疫印迹实验和间接免疫荧光实验,在过表达Rep蛋白的293T细胞裂解液中可检测到明显目的条带,在胞内可观察到明显荧光,表明该多抗可识别Rep蛋白的线性表位,且与天然构像的蛋白也具有很好的反应特异性。上述结果表明,N-MDPV感染MDEF后,BMP2、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7基因的表达水平整体下调,BMP2、BMP4、BMP5与N-MDPV的Rep蛋白在细胞存在明显相互作用,表明了在N-MDPV感染过程中N-MDPV的Rep蛋白与BMPs信号传导机制存在一定的关系。在现有研究基础上,关于部分BMPs和N-MDPV的Rep蛋白在鸭体内是否存在相互作用还需待验证,N-MDPV结构蛋白是否能

关键词：骨形态发生蛋白新型番鸭细小病毒基因表达水平 Rep蛋白

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半番鸭共感染鸭圆环病毒和新型番鸭细小病毒的诊断

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福建畜牧兽医 2020年第4期42卷 65-66页

作者：张瑞刘荣昌黄瑜福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013

2020年3月,广东湛江某养鸭场饲养的65日龄半番鸭群发病,根据其流行病学特点、临床症状和剖检病变,结合实验室病原学检测、基因序列测定,确定其为鸭圆环病毒和新型番鸭细小病毒共感染。该文报道这起病例的诊断方法,以期为同行提供参考。

关键词：半番鸭鸭圆环病毒新型番鸭细小病毒共感染诊断

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一起番鸭感染鸭瘟、新型番鸭细小病毒、鸭圆环病毒的诊断

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云南畜牧兽医 2021年第2期 16-17页

作者：严红亚李珂王传禹张信艳杨绍昌云南省畜牧兽医科学院云南昆明650224 水富市农业农村局云南水富657800 双江县畜牧兽医技术推广中心云南双江677399

对昆明郊县的番鸭病例诊断,根据发病情况、临床症状、剖检病变,结合实验室细菌分离培养、病原学检测、基因序列测定等实验方法,确定养殖场该批次番鸭为鸭瘟(DP)、新型番鸭细小病毒(N-MDPV)、鸭圆环病毒(DuCV)感染。

关键词：番鸭鸭病毒性肠炎新型番鸭细小病毒鸭圆环病毒

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一起番鸭感染新型细小病毒的诊断报告

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福建畜牧兽医 2019年第2期41卷 44-45页

作者：王艺萍刘荣昌黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013

2018年11月,江西省南城县某鸭场饲养的30日龄番鸭群发病,发病率约为50%,病死率约为10%,感染后耐过鸭呈现典型的"短喙-侏儒综合征"症状。经实验室检查,确诊引起该场鸭群发病的病原为新型番鸭细小病毒,该文主要报道该起病例的... 详细信息

2018年11月,江西省南城县某鸭场饲养的30日龄番鸭群发病,发病率约为50%,病死率约为10%,感染后耐过鸭呈现典型的"短喙-侏儒综合征"症状。经实验室检查,确诊引起该场鸭群发病的病原为新型番鸭细小病毒,该文主要报道该起病例的诊断情况。

关键词：番鸭新型番鸭细小病毒诊断

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检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条的研制

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中国预防兽医学报 2017年第9期39卷 722-726页

作者：程龙飞张长弓傅秋玲何琼贾志娟陈慧敏傅光华万春和林群群刘荣昌黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室福建福州350013 厦门市波生生物技术有限公司福建厦门360121

为建立水禽源细小病毒的快速检测方法,本研究采用纯化的小鹅瘟病毒(GPV)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,筛选到21株能够稳定分泌抗GPV的单克隆抗体(MAb),将1株MAb纯化后与胶体金结合,喷涂金标垫,与另一株纯... 详细信息

为建立水禽源细小病毒的快速检测方法,本研究采用纯化的小鹅瘟病毒(GPV)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,筛选到21株能够稳定分泌抗GPV的单克隆抗体(MAb),将1株MAb纯化后与胶体金结合,喷涂金标垫,与另一株纯化的MAb配对,制成检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条。特异性试验表明,鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒的检测结果均为阳性,猪细小病毒、1型鸭甲肝病毒、坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒、H9N2亚型禽流感病毒、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒等的检测结果均为阴性。该方法对鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型番鸭细小病毒的最低检出量分别为10^(4.7) ELD50/mL、10^(4.7)ELD50/mL和10^(5.7) ELD50/mL。重复性试验良好。对临床粪便样品的检测,该方法比PCR方法简单快速,但是存在漏检的情况。上述结果表明,本实验建立的方法可用于水禽源细小病毒病的初步快速筛查。

关键词：鹅细小病毒番鸭细小病毒新型番鸭细小病毒胶体金试纸条单克隆抗体

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“短喙侏儒综合征”半番鸭病原学检测及病理组织学特征

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中国兽医学报 2018年第1期38卷 51-58页

作者：刘荣昌黄瑜卢荣辉傅秋玲万春和傅光华程龙飞施少华陈红梅福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室福建福州350013 福建农林大学动物科学学院福建福州350002

旨在明确福建省漳州地区3个“短喙侏儒综合征”半番鸭群的病原及病理组织学特征。对患病半番鸭体质量、喙长、喙宽进行测定及统计分析，采集患病半番鸭肝、脾、胰腺组织进行病原学检测、病毒分离鉴定和基因序列测定与分析，同时采集心... 详细信息

旨在明确福建省漳州地区3个“短喙侏儒综合征”半番鸭群的病原及病理组织学特征。对患病半番鸭体质量、喙长、喙宽进行测定及统计分析，采集患病半番鸭肝、脾、胰腺组织进行病原学检测、病毒分离鉴定和基因序列测定与分析，同时采集心、肝、脾、肺、肾等10种组织进行病毒分布及病理组织学研究。结果表明，患病半番鸭喙长，体质量与同场正常未感染半番鸭相比，发病鸭体质量减少达49．00％，喙长缩短达32．00％，喙宽缩短达22．00％；经PCR或RT—PCR检测显示，所采样品禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、呼肠孤病毒、鸭圆环病毒、鸭疫里默氏菌、鸭大肠杆菌、鸭沙门菌均为阴性，均为水禽细小病毒阳性；对组织匀浆液致死的鸭胚尿囊液检测表明，分离毒株均为水禽细小病毒，经进一步基因序列分析显示所分离3株病毒与番鸭细小病毒病（MDPV）各代表株核苷酸同源性达97．7％以上，与新型MDPVSAAS—SHNH株核苷酸同源性高达98．9％。组织病毒分布检测结果显示，患病半番鸭心、肝、脾、肺、肾等10种组织均不同程度带毒，其中以胸腺、法氏囊、心、脾和胰腺病毒含量最高，肝、肺、脑、小肠次之，肾脏最低；病理组织学研究可见心肌颗粒变性，肝脏水泡变性，胸腺出血，骨骼肌出血、坏死。以上结果表明，福建省漳州地区的3个半番鸭群发生的“短喙侏儒综合征”由新型MDPV所致，且与经典的MDPV在感染宿主、临床症状、病变特征等方面存在较大差异，为新型MDPV病的诊断提供了科学依据和借鉴。

关键词：半番鸭短喙侏儒综合征新型番鸭细小病毒病毒分布病理组织学

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一例番鸭短喙与侏儒综合征的诊断

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福建畜牧兽医 2023年第4期45卷 110-111页

作者：付环茹赵敏万春和福建农林大学生命科学学院福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013

2023年1月,福建漳州某番鸭养殖场番鸭(约65日龄)生长迟缓,临床表现为短喙与侏儒综合征,剖检主要脏器无明显病理变化。对该病例进行常规实验室病原核酸检测发现,该病例为新型番鸭细小病毒与鸭圆环病毒共感染。现将该病例的诊断情况做一... 详细信息

2023年1月,福建漳州某番鸭养殖场番鸭(约65日龄)生长迟缓,临床表现为短喙与侏儒综合征,剖检主要脏器无明显病理变化。对该病例进行常规实验室病原核酸检测发现,该病例为新型番鸭细小病毒与鸭圆环病毒共感染。现将该病例的诊断情况做一简要报道,供同行参考。

关键词：番鸭短喙与侏儒综合征新型番鸭细小病毒鸭圆环病毒

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