检索结果-内蒙古大学图书馆

菌物学报 2022年第7期41卷 1044-1054页

作者：李波邹根周思池尹昕杨占山鲍大鹏李晓玲汪滢长春工业大学化学与生命科学学院吉林长春130012 梧州学院食品与制药工程学院广西梧州543002 上海市农业科学院食用菌研究所食用菌工程技术研究中心农业部南方食用菌资源利用重点实验室上海201403

传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本... 详细信息

传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究利用CRISPR/Cas9技术对蛹虫草的Cmura5基因进行编辑,通过内源5S-1、5S-2和U6启动子对gRNA进行转录,结果表明使用U6启动子对Cmura5基因的编辑效率达到了100%。在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5–中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即野生型菌株可以在基础培养基上生长。利用设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。以尿嘧啶缺陷型Cmura5–为出发菌株,利用无抗性标记转化技术,导入一个重组质粒效率为75%;连续导入2个重组质粒效率为80%;连续导入3个重组质粒效率为100%;连续导入4个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达。

关键词： CRISPR/Cas9 蛹虫草无抗性标记 ura5 营养缺陷型标记

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无抗性标记转化技术在蛹虫草中的建立及应用

无抗性标记转化技术在蛹虫草中的建立及应用

引用

作者：李波长春工业大学

学位级别：硕士

蛹虫草是非常重要的一种食药同源的可食用真菌,含有丰富的活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、和提高人体免疫力等功效,一直是广大消费者非常喜爱的功能保健食品。近年来,蛹虫草优异功能基因挖掘和定向培育高活性新菌种,一度成为热点研究领... 详细信息

蛹虫草是非常重要的一种食药同源的可食用真菌,含有丰富的活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、和提高人体免疫力等功效,一直是广大消费者非常喜爱的功能保健食品。近年来,蛹虫草优异功能基因挖掘和定向培育高活性新菌种,一度成为热点研究领域。但由于传统的真菌遗传改造方法需要使用抗性标记,而目前可使用的抗性标记基因非常有限。导致蛹虫草遗传改造面临着可用抗性基因数量不足的问题,进而限制了多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究选择乳清酸磷酸核糖转移酶基因（ura5）为筛选标记基因,该基因编码表达尿嘧啶合成途径中关键酶—乳清酸磷酸核糖转移酶。首先,构建了在Cmura5基因两端具有同源臂的重组质粒,Npxbthg-Cela、Npxbthg-Ctcel7a、Npxbthg-HSP88、Npxbthg-CDV56。利用在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5-中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即回补菌株能在基础培养基上生长。在5-氟乳清酸筛选压力下,设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。转化结果表明,以尿嘧啶缺陷型Cmura5-为出发菌株,利用农杆菌遗传转化技术,本研究导入一个重组质粒效率为75%;连续导入二个重组质粒效率为80%;连续导入三个重组质粒效率为100%;连续导入四个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达,并且转化子可长出子实体,说明此无抗性标记转化技术对蛹虫草的生长发育基本没有影响。本研究又利用无抗性标记转化技术在蛹虫草中转入纤维素酶基因Cela,Ctcel7a,Trcel7a基因,分别获得了Cmcela,Cmctcel7a,Cmtrcel7a,Cmcpl7a（Cela和Ctcel7a）,Cmcptl7a（Cela和Trcel7a）转化子,并对转化子的生长发育、活性物质产量等方面进行了分析。结果表明:转化子的菌丝生长速度与缺陷型菌株Cmura5-没有差异,转化子的分生孢子产量平均是Cmura5-的72.8%。转入纤维素酶基因的转化子中活性物质,如腺苷、虫草素和喷司他丁均有明显提高,转化子菌丝中的腺苷平均产量是Cmura5-的1.2倍,虫草素平均产量是Cmura5-的4.1倍,喷司他丁平均产量是Cmura5-的2.3倍。转化子Cmcptl7a可以利用废弃菌渣（SMS）生产抗癌药物喷司他丁,固体发酵生产达到1.45mg·g-1的喷司他丁,液体发酵可生产434.3mg·m L-1的喷司他丁。综上所述,本研究在蛹虫草中建立的无抗性标记转化技术,让基因的连续敲入或敲除不受抗性基因限制,且避免了抗性基因向环境迁移扩散的可能风险。转入纤维素酶基因的转化子可以利用SMS生产高附加值的抗癌药物喷司他丁。本研究构建的无抗性标记转化平台为探究蛹虫草的生长发育、营养物质利用、子实体发育等方面的生物学功能、基因功能研究及多基因的系统改造提供了技术支持。

关键词：蛹虫草 ATMT 无抗性标记 ura5 营养缺陷型标记虫草素喷司他丁

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无抗性标记多功能降解菌的构建

无抗性标记多功能降解菌的构建

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作者：刘艳中国科学院研究生院

学位级别：硕士

有机磷农药占世界农药总量的80％,其中甲基对硫磷(methylparathion,MP)等高毒农药占总农药用量的一半以上。这些农药都是胆碱酯酶抑制剂,对人具有较高的毒性。甲基对硫磷等在水解酶的作用下水解产生对硝基苯酚(para-nitrophenol,4NP,PN... 详细信息

有机磷农药占世界农药总量的80％,其中甲基对硫磷(methylparathion,MP)等高毒农药占总农药用量的一半以上。这些农药都是胆碱酯酶抑制剂,对人具有较高的毒性。甲基对硫磷等在水解酶的作用下水解产生对硝基苯酚(para-nitrophenol,4NP,PNP),在这个过程中其毒性虽有降低,但是因为对硝基苯酚很强的水溶性,其造成的环境污染和对人畜的危害更严重。因此,有机磷农药降解的研究往往和对硝基苯酚的降解紧密联系。单硝基酚化合物(包括2-硝基酚,3-硝基酚,4-硝基酚)作为硝基酚类化合物中的一类,其结构简单,并且具有毒性和高度水溶性,在环境中易传播易积累,已被美国国家环保总局(EnvironmentalProtectionAgency,EPA)列为优先控制污染物。目前研究报道的硝基酚化合物代谢途径多样,并且在多种菌属中发现。\n 然而,自然界中分离到的能够同时降解邻硝基酚(ortho-nitrophenol,2NP、ONP)、PNP的微生物仅有2株,并且对其降解的分子背景还不了解。虽然已有构建出能同时降解邻硝基酚和对硝基酚的工程菌,但是采用的是转入含有onpAB基因(邻硝基酚单加氧酶基因和邻苯二醌还原酶基因)降解质粒,该菌在不含抗性的培养基多次传代后,转入的降解质粒会逐渐丢失。因此,有必要构建出不含抗性基因且稳定遗传能同时降解这些污染物的工程菌。\n 本研究是根据已有的代谢途径,即来自甲基对硫磷降解菌***-3中的甲基对硫磷水解酶(MPH)能作用MP生成PNP；而对硝基酚降解菌***402是一株PNP降解菌并且该菌也能利用邻苯二酚；***215是一株ONP的降解菌,该菌在邻硝基酚单加氧酶和邻苯二醌还原酶(ONP2-monooxygenasegeneando-benzoquinonereductase,OnpAB)的作用下,氧化ONP至中间代谢物邻苯二酚,接着邻苯二酚开环后进入三羧酸循环(citricacidcycle,TCA)彻底降解。利用染色体整合自杀载体pEXl8Tc,将菌株WBC-3中甲基对硫磷水解酶基因(mph)重组至菌株NyZ402的非必需基因pnpAl上,构建出不含抗性标记、稳定共降解甲基对硫磷、对硝基酚的菌NyZ-M；用同样的方法将菌株NyZ215中onpAB基因及mph基因整合至菌株NyZ402中非必需基因pnpAl上,使得菌株NyZ215和菌株NyZ402代谢途径加以整合,构建出不含抗性标记、稳定共降解甲基对硫磷、邻硝基酚的菌NyZ-MO。将NyZ-MO在不含抗性的LB平板上连续传代30代后,甲基对硫磷水解酶和邻硝基酚单加氧酶活性仍然保留,表明插入的基因是能100％稳定遗传的并且是组成型表达的。降解实验表明,NyZ-M能在19小时彻底降解0.2mM的MP。NyZ-MO能分别彻底降解0.2mM的MP,0.2mM的ONP或者0.1mMMP-0.1mMONP。\n 该论文的创新和特点是:1.首次获得了能同时降解甲基对硫磷、对硝基酚和邻硝基酚3种污染物的降解菌；2.该降解菌不含抗性标记,解决了基因工程菌的带来的安全性问题；3.外源降解基因插入受体菌染色体中,从而达到稳定遗传。

关键词：邻硝基酚对硝基酚甲基对硫磷共降解无抗性标记

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利用双T-DNA载体系统和RNAi培育抗水稻条纹病毒转基因水稻

利用双T-DNA载体系统和RNAi培育抗水稻条纹病毒转基因水稻

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作者：李开东山东农业大学

学位级别：硕士

双T-DNA载体系统是实现筛选完成后删除选择标记基因的一种简便可行的方式。为获得无选择标记抗水稻条纹病毒(RSV)的转基因水稻,本研究通过构建RNAi的双T-DNA植物高效表达载体,采用根癌农杆菌(EHA105)介导的方法转化水稻,经潮霉素抗性筛... 详细信息

双T-DNA载体系统是实现筛选完成后删除选择标记基因的一种简便可行的方式。为获得无选择标记抗水稻条纹病毒(RSV)的转基因水稻,本研究通过构建RNAi的双T-DNA植物高效表达载体,采用根癌农杆菌(EHA105)介导的方法转化水稻,经潮霉素抗性筛选、PCR检测及Southern、Northern杂交分析,获得了无抗生素标记的、高抗RSV水稻新种质,为水稻抗RSV育种奠定了基础。具体结果如下: 1.以双元载体pCAMBIA1300为基础,加入高效表达的玉米泛素基因Ubi启动子;然后以pBI121中的Nos3′+T-DNA LB为模板,设计引物(在引物的两端加上合适的限制性内切酶位点,且在3′端加上T-DNA RB序列),PCR扩增得到含有Nos终止子+LB+RB的cDNA片段,进一步连接于重组载体中,获得含有双T-DNA的表达载体pCAMBIA1300DT。测序验证载体构建的准确性。继而以RSV的SP基因为模板,PCR克隆SP基因3′端400bp的cDNA片段,分别反向插入构建的双T-DNA的表达载体pCAMBIA1300DT中PLD基因内含子的两侧,构建了RNAi植物表达载体pDTRSVSP。 2.将构建的植物表达载体pDTRSVSP利用冻融法导入农杆菌EHA105,转化水稻豫粳6号及抗虫、抗除草剂水稻新材料SK。经潮霉素筛选、PCR检测,分别获得豫粳6号转基因植株20株和SK转基因植株18株。PCR检测的结果表明hpt基因和SP基因的共转化率为44.7%。 3.含hpt基因和SP基因的T0代转基因植株自交后,获得的T1代转基因株系,分子检测表明有13.08%的植株只含有SP基因;这些植株进一步自交,在T2代获得了无hpt基因、而SP基因纯合稳定的豫粳6号转基因株系6个、SK转基因株系5个。. 4.对获得的11个仅含目的基因的T2代纯合株系进行RSV抗性鉴定,结果显示,有3个豫粳6号转基因株系和2个SK转基因株系表现为高抗,植株的感病率在5%以下。另外抗虫鉴定结果还显示,2个SK转基因株系仍高抗螟虫。 5.对5个表现高抗株系的目的基因的Southern杂交结果显示,在所检测的株系中目的基因均以低拷贝整合。Northern杂交结果显示,在RNA上样量大致相等的情况下,抗性植株中RNA的积累量明显低于感病植株,转基因植株中可检测到siRNA,表明转基因植株的抗病性是由RNA介导的。

关键词：双T-DNA RAN干扰水稻条纹病毒转基因水稻无选择标记基因无抗性标记

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