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文献类型

2 篇 学位论文

馆藏范围

2 篇 电子文献
0 种 纸本馆藏

日期分布

学科分类号

2 篇 理学
- 2 篇 生物学
2 篇 工学
- 2 篇 轻工技术与工程
- 2 篇 生物工程
- 1 篇 化学工程与技术
2 篇 农学
- 2 篇 作物学

主题

2 篇 无抗生素表达
1 篇 启动子
1 篇 转录后调控
1 篇 肝素裂解酶
1 篇 σ因子
1 篇 隐性质粒
1 篇 非编码srna
1 篇 枯草芽孢杆菌
1 篇 毒素-抗毒素系统
1 篇 大肠杆菌nissle 1...

机构

2 篇 江南大学

作者

1 篇 赵琳琳
1 篇 徐雅晴

语言

2 篇 中文

检索条件"主题词=无抗生素表达"

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排序：

益生菌大肠杆菌Nissle 1917的新型基因表达平台构建与应用

益生菌大肠杆菌Nissle 1917的新型基因表达平台构建与应用

引用

作者：赵琳琳江南大学

学位级别：硕士

作为代谢工程中应用最多的异源蛋白表达宿主,大肠杆菌具有遗传背景清晰、蛋白表达能力强、培养成本低等优点。大肠杆菌Nissle 1917（EcN）被用作非处方益生菌药物已有超过100年的历史,它具有增强肠道免疫功能,保护肠黏膜屏障,抑制病理... 详细信息

作为代谢工程中应用最多的异源蛋白表达宿主,大肠杆菌具有遗传背景清晰、蛋白表达能力强、培养成本低等优点。大肠杆菌Nissle 1917（EcN）被用作非处方益生菌药物已有超过100年的历史,它具有增强肠道免疫功能,保护肠黏膜屏障,抑制病理性炎症等功能。EcN作为益生菌药物的商业使用使其在生物安全性方面优于大肠杆菌常用菌株BL21（DE3）和MG1655。本研究通过对EcN基本性能的表征以及对启动子元件和EcN内源隐性质粒的开发,构建了基于益生菌EcN的新型基因表达平台。主要的研究结果如下:（1）EcN与大肠杆菌菌株BL21（DE3）和MG1655比较分析。我们在不同条件下培养了EcN、BL21（DE3）和MG1655,发现EcN在无机盐培养基中生长具有一定的优势,而副产物乙酸产量低于MG1655。比较基因组学和转录组数据表明,EcN拥有1404个独有的编码序列（CDSs）,对其独有的CDSs进行分类表明:EcN具有额外的VI型分泌系统,精氨酸脱氨途径,铁转运系统等。我们的实验也证明了EcN对低铁离子浓度的环境更具有耐受性。通过表达异源荧光蛋白GFP,EcN的蛋白表达水平低于BL21（DE3）和MG1655,这为我们提供了将EcN用于代谢工程宿主的一个改造方向。（2）EcN内源启动子表征以及人工合成启动子构建。基于转录组数据对EcN转录组表达量最高的前30个基因启动子强度进行了表征。之后根据σ70和σ38结合位点设计了人工合成启动子,并通过流式细胞仪和摇瓶筛选最终得到了肝素裂解酶BhepⅢ和GFP强度分别比J23119强度高20%和35%的组成型启动子,以及一系列梯度强度的启动子。（3）隐性质粒敲除菌株的构建。鉴于隐性质粒pMUT1和pMUT2的存在可能对异源质粒或是重组隐性质粒的表达造成干扰,我们基于CRISPR/Cas9对隐性质粒进行敲除,分别得到了敲除了单个质粒的EcNΔP1（敲除质粒pMUT1）和EcNΔP2（敲除质粒pMUT2）。将pMUT1-amp R转入EcNΔP2,通过不断增加抗生素浓度,使pMUT1-ampR完全取代内源pMUT1。pMUT1-amp R质粒基于CRISPR/Cas9进行敲除,进而得到了EcNΔP12（同时敲除质粒pMUT1和pMUT2）。（4）EcN隐性质粒截短表征。分别对pMUT1和pMUT2进行截短表征,获得了14个隐性质粒重组质粒,分析了重组质粒上各个元件的删除对于菌体生长、质粒拷贝数、蛋白表达强度以及传代稳定性的影响。在不添加抗生素的条件下传代培养,隐性质粒衍生质粒最多可以在宿主菌中稳定存在13天。（5）将隐性质粒截短质粒与合成启动子同时应用于肝素裂解酶BhepⅢ的生产,最终pMUT1衍生质粒BhepⅢ的酶活是对照菌株的2.16倍,pMUT2衍生质粒BhepⅢ的酶活是对照菌株的1.4倍。

关键词：大肠杆菌Nissle 1917 启动子 σ因子隐性质粒无抗生素表达

来源：评论

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枯草芽孢杆菌表达调控系统的构建与应用

枯草芽孢杆菌表达调控系统的构建与应用

引用

作者：徐雅晴江南大学

学位级别：硕士

枯草芽孢杆菌是一种常见的革兰氏阳性菌模式生物,被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）确认为安全的菌（Generally recognized as safe,GRAS）。枯草芽孢杆菌因其生长速度快、蛋白分泌能力强等特点,被广泛应... 详细信息

枯草芽孢杆菌是一种常见的革兰氏阳性菌模式生物,被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）确认为安全的菌（Generally recognized as safe,GRAS）。枯草芽孢杆菌因其生长速度快、蛋白分泌能力强等特点,被广泛应用于工业酶制剂的制造、代谢产品的合成和基础研究中。但是目前枯草芽孢杆菌转录后调控工具缺乏,而且目的基因的表达大多依赖基于抗生素的表达系统,这严重制约了其在食品及医药领域的应用。本研究通过改造枯草芽孢杆菌I型毒素-抗毒素系统,成功构建了同时适用于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的新型转录后调控系统;基于I型毒素-抗毒素系统bsrG/SR4成功构建了枯草芽孢杆菌无抗生素表达系统。主要研究结果如下:（1）基于bsrE/SR5的转录后调控系统的构建。通过SR5与SR4的序列进行比对分析,发现二者同时在核酸序列和二级结构上都有着很高的相似度,基于此成功构建了一套以I型毒素-抗毒素系统bsrE/SR5为基础的s RNA介导的转录后调控系统(Modulation via the small RNA（s RNA）‐dependent operation system,MS-DOS),基因的抑制效率可达到88.8%。通过对SR5进行了截短表达,结果表明SR5在仅保留终止子序列的情况下也能保持较高的抑制效率（83.8%）。（2）MS-DOS系统的优化与跨宿主应用。通过对OPR区域进行截短,实现了靶基因表达水平的梯度抑制（抑制效率0%—90%左右）。利用截短的OPR即可实现同时对不同基因实现不同强度的表达抑制的效果。接着成功将MS-DOS调控系统应用于大肠杆菌中。通过在大肠杆菌中异源表达枯草芽孢杆菌来源的RNase III,可显著提高MS-DOS系统的抑制效率。同时对OPR进行初步截短研究,同样实现了在大肠杆菌中对于靶基因的梯度抑制。（3）枯草芽孢杆菌无抗生素表达系统的构建与应用。在基因组上整合组成型启动子Pxpa C表达毒素Bsr G,并利用表达质粒组成型表达抗毒素SR4,只有当质粒稳定存在时,细胞才能正常生长;当质粒丢失时,毒素Bsr G形成筛选压力,影响细胞生长。将目的基因构建至表达质粒,即可实现目的基因的无抗生素稳定表达。本研究所构建的无抗生素表达系统,质粒遗传稳定性较好,连续传代100次无明显质粒丢失。该系统成功应用于肝素裂解酶I的高效表达,避免了肝素裂解酶在发酵时受到抗生素污染。

关键词：毒素-抗毒素系统枯草芽孢杆菌转录后调控无抗生素表达肝素裂解酶非编码sRNA

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