检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：石强强中国科学技术大学

学位级别：博士

聚合物纳米粒子作为药物载体在疾病的诊断及治疗中有着广泛的应用,为满足不同情况的实际需求,越来越多的具有不同物理,化学和生物特性的纳米粒子被研发出来。在复杂的生物环境下对这些纳米粒子的运输,代谢及生物分布进行定量对于进一步... 详细信息

聚合物纳米粒子作为药物载体在疾病的诊断及治疗中有着广泛的应用,为满足不同情况的实际需求,越来越多的具有不同物理,化学和生物特性的纳米粒子被研发出来。在复杂的生物环境下对这些纳米粒子的运输,代谢及生物分布进行定量对于进一步推进纳米医药设计及转化至关重要。而基于传统的荧光探针标记技术只能提供定性的结果,序列可控精准聚合物的出现为解决上述问题提供了机会。基于以上科学问题,本论文聚焦于精准序列可控数码高分子的模块化合成,测序,及数码纳米粒子在复杂生物环境中的定量研究。论文工作主要分为以下三个部分:1.在过去十多年的时间内,单分散序列可控合成大分子领域得到了飞速的发展,各种新的精准聚合物被创制出来,对于聚合物结构-性能关系的阐述也更加明确。我们通过模块化逐步迭代的合成策略,发展了“正向”和“反向”两种合成方法,得到了一系列可降解数码高分子。以苯酰基叠氮通过Curtius重排转换成异氰酸酯与羟基的高效偶联作为基元反应,正向合成得到了由紫外光响应模块,序列可控且可级联解聚的精准聚N-芳基氨基甲酸酯模块以及亲水的树枝状PEG(PEG dendron)模块组成的两亲性数码高分子。通过改变N-芳基氨基甲酸酯上的取代基完成对精准两亲性数码高分子的编码。我们还验证了 Curtius重排和Hofmann重排的反应正交性,并设计合成了同时含有羟基和苯基酰基叠氮或苯基酰胺的单体及二聚体,利用正交化学反向合成得到了精准序列可控的聚N-芳基氨基甲酸酯嵌段,最后将光响应基元安装到聚合物链末端获得完整的可降解数码高分子。2.生物大分子(如蛋白质,DNA)中单体序列的调控是生物学的中心概念,在生物化学和生物物理中已经深入研究了几十年,也开发出了成熟的测序方法,推动了结构生物学的蓬勃发展。然而合成聚合物的测序还是比较新的一个研究领域,其中很大程度受制于传统聚合物本身不够精确,多分散性的固有性质。随着近年来精准聚合物概念及相应合成策略的提出,单分散聚合物的测序得到很大的发展。我们在数码高分子成功合成的基础上,进一步探究了其序列的测定。基于两亲性数码高分子可紫外光触发后逐级解聚的性质,在温和水溶液环境中对数码高分子进行触发,并在不同时间内利用基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱(MALDI-TOFMS)监测数码高分子降解中间体,对两亲性数码高分子序列进行了测定。进一步地,通过碱金属离子(如钠离子)与PEG dendron的高亲和力结合及苄基-氨基甲酸酯连接键的选择性断裂,利用MALDI-TOF串联质谱(MALDI-TOF MS/MS)实现两亲性数码高分子序列直读。3.基于以上对数码高分子物理化学性质的详细研究,我们进一步发现精准两亲性聚合物能够组装成由低聚氨基甲酸酯序列严格控制的数码胶束(digital micelles)。四种数码胶束的混合物可以通过MALDI-TOF MS和MALDI成像对活体内给药后在细胞、器官和组织切片水平上进行识别、序列解码和无标记定量分析,从而直接比较同一动物上不同数码胶束的相应生物行为。通过对脾脏中的免疫细胞及基质细胞进行分选,利用(HESI)-FTMS深入研究了脾脏中不同类型细胞中数码高分子的含量。为了探索由编码的两亲性高分子自组装形成数码胶束的设计通用性,设计并合成了数码脂质分子(digital lipids)用于数码脂质纳米粒子的构筑并应用于活细胞内siRNA的递送及定量;通过微流控对两亲性数码高分子和传统两亲性嵌段共聚物进行共组装得到条形码胶束(barcoded micelles),并用于探究聚乙二醇化的纳米粒子生物行为的尺寸效应。

关键词：两亲性数码高分子序列数码胶束数码脂质纳米粒子条形码胶束无标记定量

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蛋白质的毛细管阵列液相色谱分离及相互作用新方法研究

蛋白质的毛细管阵列液相色谱分离及相互作用新方法研究

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作者：关霞复旦大学

学位级别：博士

随着人类基因组计划的完成,生命科学研究进入了后基因组时代,即蛋白质组学的研究。蛋白质组学中有两条技术路线：一条是基于肽段的"bottom-up",另一条是基于蛋白质水平的"top-down"。基于蛋白质水平的分离鉴定能够... 详细信息

随着人类基因组计划的完成,生命科学研究进入了后基因组时代,即蛋白质组学的研究。蛋白质组学中有两条技术路线：一条是基于肽段的"bottom-up",另一条是基于蛋白质水平的"top-down"。基于蛋白质水平的分离鉴定能够获得蛋白质完整的信息,使蛋白质的定量、蛋白与蛋白相互作用以及翻译后修饰研究更加高效可靠。因此,对蛋白质水平的分离鉴定成为近几年的研究主流方向。然而,蛋白质比肽段复杂得多。如何采用高效、高通量、高分辨的分离手段,实现对一个复杂蛋白质组在蛋白质水平上的有效分离给色谱工作者提出了一个新的挑战。构建高通量的阵列式多维液相色谱平台成为极具潜力的大规模蛋白质组学样品分析的关键。在蛋白质组学研究中,阐明蛋白质间的相互作用是最有挑战性而又重要的任务之一。研究蛋白质相互作用的方式和程度,将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗以及新型药物的开发等众多难题的解决,因此,确定蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点。现有的技术研究周期长、成本高、代价昂贵,限制了对蛋白质相互作用高通量、高效的研究。本论文针对蛋白质组学研究领域的热点难点问题,研制了新型的蛋白质捕集柱,搭建了蛋白质水平分离的两维阵列式毛细管液相色谱平台,建立了基于蛋白质固定与蛋白质荧光标记的研究蛋白质相互作用的新方法,对正常及高脂大鼠的鼠肝提取蛋白进行了基于质谱的无标记定量分析。全文共分五章,主要内容如下：第一章,文献综述。本章总结了整体柱的发展概况及整体柱在微分离分析领域的应用,概述了多维液相色谱技术在蛋白质组学领域的进展,介绍了蛋白质相互作用的研究方法。阐述了本论文的选题意义。第二章,商品捕集柱以及我们已研制的捕集柱主要用于肽水平样品的捕集,无法满足蛋白质水平的样品馏分高效捕集与洗脱。论文采用溶胶凝胶法制备了新型的蛋白质捕集柱并成功地对实际鼠肝蛋白质进行了高效捕集与洗脱。首先通过优化溶胶凝胶的配方及改善工艺条件,制得了由薄层溶胶凝胶涂覆的蛋白质捕集柱。柱与柱之间,批次与批次之间重现性好,同时捕集柱保持了较高的机械强度。然后将该捕集柱应用于在线捕集-分离检测的毛细管液相色谱系统,以四种标准蛋白质的混合物为研究对象,考察了捕集柱对标准蛋白质的回收率、最大上样量、柱子的重现性等参数。一根5mm长的捕集柱对标准蛋白质的平均回收率为99.3%,对四种蛋白质混合物的最大上样量为30μg。最后该在线捕集-分离检测的毛细管液相系统成功用于实际鼠肝提取蛋白的在线除盐、捕集,获得了满意的结果。第三章,搭建了蛋白质水平分离的阵列式毛细管二维液相色谱分离技术平台,将上述研制的蛋白质捕集柱应用于蛋白的在线除盐、富集,对鼠肝组织的蛋白质组进行了高效分离。在此基础上,采用本实验室发展的靶上酶解技术,对分离后的蛋白质进行酶解,将蛋白质高通量的分离与MALDI-TOF-TOF-MS检测有效的结合起来,从而实现了蛋白质从分离、酶解到鉴定这样一个完整的"top-down"路线分析。该平台以强阴离子交换色谱(SAX)为第一维色谱分离模式,以十八根并行式的反相液相色谱(RPLC)为第二维分离模式,可快速完成进样、除盐富集、分离、酶解及鉴定,实现真正的蛋白质组学研究所需的高通量分析。SAX柱采用阶梯式盐梯度洗脱,蛋白质样品经过0.5mm内径SAX柱分离之后,洗脱下来的馏分通过两个十通阀的切换被依次保留在18根自制蛋白捕集柱的柱头,对样品进行在线除盐、捕集。馏分经捕集柱捕集除盐后,通过一个十八通道分流器,被并行反冲到阵列式的毛细管反相柱上进行第二维分离。样品分析通量提高了18倍。利用自动点样仪将经过RPLC的洗脱液直接收集到MALDI靶板上,点样频率为1分钟/,经过靶上单点酶解之后用MALDI-TOF-TOF-MS鉴定。整个系统对鼠肝蛋白进行了分离鉴定,共鉴定出1030种蛋白质。第四章,探索了研究蛋白质相互作用的新方法。将目标蛋白质固定在氨基材料上,将与之发生相互作用的蛋白质进行固相荧光衍生,然后将两者孵育,洗脱后,用荧光显微镜进行检测。应用谷胱甘肽转移酶(GST)及其抗体对该方法的可行性进行了验证,该方法有望应用于研究蛋白质相互作用,实现对大量蛋白质高通量的筛选。首先合成了氨基纳米磁性微球,通过化学反应在氨基磁球上连接上戊二醛,然后将蛋白质连接到戊二醛上,实现了在氨基纳米磁球上固定蛋白质。通过比较蛋白质溶液与材料反应前后对280nm紫外光的吸收强度,可以估算出磁球表面固定蛋白的量。然后采用本实验室发展的固相荧光衍生法,在毛细管中制备了用于蛋白荧光标记的固相载体填充床,以荧光素异硫氰酸酯(FITC)作为荧光衍生试剂,实现了蛋白的固相荧光衍生。并白行填充了毛细管体积排阻色谱柱,对过量荧光试剂进行了有效去除。将固定在氨基材

关键词：蛋白质捕集柱阵列式多维色谱蛋白质相互作用无标记定量

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结直肠癌转移差异分泌蛋白质组学研究

结直肠癌转移差异分泌蛋白质组学研究

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作者：薛花浙江大学

学位级别：博士

结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤。2008年,美国结直肠癌的发病率和死亡率在男、女性中均列恶性肿瘤的第三位。数十年来,随着我国人民生活方式和膳食结构的改变,结直肠癌的发病率和死亡率也呈逐年上升的趋势。虽然现代癌症研... 详细信息

结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤。2008年,美国结直肠癌的发病率和死亡率在男、女性中均列恶性肿瘤的第三位。数十年来,随着我国人民生活方式和膳食结构的改变,结直肠癌的发病率和死亡率也呈逐年上升的趋势。虽然现代癌症研究和医疗技术不断发展,结直肠癌患者的预后并没有明显改善。转移是影响结直肠癌患者治疗效果和导致死亡的主要原因。因此,研究转移发生过程中的关键分子,早期预测结直肠癌的转移潜能,是提高结直肠癌患者生存率的关键。目前医疗界公认,检测肿瘤标志物是实现肿瘤转移预测的最佳手段。二十余年以来,在分子生物学和免疫学检测技术不断发展的带动下,已有不少重要的肿瘤标志物如癌胚抗原、甲胎蛋白、前列腺特异性抗原等被开发应用。虽然这些肿瘤标志物已经广泛应用于临床诊断和病情监测。但遗憾的是,它们的敏感性和特异性却往往不尽人意。寻找更加敏感和特异的肿瘤标志物势在必行。在后基因组时代,逐渐发展成熟的蛋白质组学技术使得大规模的肿瘤标志物筛选成为可能。但是,传统的组织蛋白质组学策略在应用于肿瘤标志物筛选方面存在缺陷。因为,理想的肿瘤标志物理应能够从血液或尿液中被无创性的方法检测出来,而通过组织蛋白质组学策略筛选得到的肿瘤相关分子却不一定能满足这一基本要求。与之相对,近年来兴起的血蛋白质组学策略更加诱人,因为其可以通过对血中蛋白表达谱的比较而直接获取肿瘤相关的血清标志物。不过,该策略却有其难以逾越的技术障碍。这是因为,血液的成份非常复杂,其中大量高丰度蛋白的存在会对其它重要蛋白产生致命的掩盖效应,从而大大降低血蛋白质组学筛选的效能。所以,现在越来越多的研究者开始关注一个全新的领域一肿瘤分泌蛋白质组学。分泌蛋白质组这一概念最早是由Tjalsma等于2000年在对枯草杆菌分泌蛋白的研究中提出的。从广义上说,分泌蛋白质组是指细胞、组织或器官释放到胞外的全部蛋白质,既包括由经典的蛋白分泌途径所分泌的蛋白质,也包括非经典分泌性蛋白质,还包括通过胞外体(exosome)分泌的蛋白质。肿瘤的形成是一个长期的多因素参与的复杂过程,在该过程中,肿瘤细胞能够分泌多种蛋白质;这些蛋白质不仅能够以自分泌、旁分泌的形式调控肿瘤的发生和发展,还可以进入血液、尿液等体液中,易于被临床无创性的方法检测出来。所以,肿瘤分泌蛋白质组学研究为肿瘤标志物的开发开辟了一条崭新、充满希望的道路。由于起步较晚,有关肿瘤分泌蛋白质组学的研究目前还为数不多,但取得的成果已经足以证明其是筛选肿瘤标志物的有效方法。迄今为止,与结直肠癌转移相关的分泌蛋白质组学研究尚未有报导。在本研究中,我们利用非标记定量鸟枪法蛋白质组学技术,分析比较了具有相同遗传背景、不同转移潜能的人结直肠癌细胞株SW480和SW620的分泌蛋白质组,并对感兴趣的差异分泌蛋白进行了较为全面的验证,以期发现对结直肠癌转移有预测价值的血清标志物。首先,我们以来自同一亲本的人结直肠癌原发灶细胞株SW480和淋巴结转移.灶细胞株SW620作为体外研究的模型系统,通过条件的反复优化,从这两株细胞的无血清培养上清中成功的收集了高质量的分泌蛋白样本。随后,用特异性的胰酶消化蛋白质,酶解后的肽段经变性、脱盐等处理后经高效液相色谱分离,最后用Finnigan

关键词：结直肠癌转移分泌蛋白质组肿瘤标志物鸟枪法蛋白质组学无标记定量

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蛋白质组学质谱数据深度解析关键问题研究

蛋白质组学质谱数据深度解析关键问题研究

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作者：徐长明国防科学技术大学

学位级别：博士

质谱已经成为蛋白质组学研究的核心技术。质谱数据是蛋白质组信息挖掘的主要源头,质谱数据解析则是蛋白质组生物信息学的研究重点。如何从相对简单的物理信号解析出肽段和蛋白质的各种信息,并且延伸至具体的生物学问题,是蛋白质组质谱... 详细信息

质谱已经成为蛋白质组学研究的核心技术。质谱数据是蛋白质组信息挖掘的主要源头,质谱数据解析则是蛋白质组生物信息学的研究重点。如何从相对简单的物理信号解析出肽段和蛋白质的各种信息,并且延伸至具体的生物学问题,是蛋白质组质谱数据解析必须要面对的巨大挑战。本文围绕蛋白质组质谱数据解析中的关键问题做了如下几方面工作:(1)肽段同位素峰检测的基本特性研究。肽段母离子的同位素峰存在于一级图谱中,研究其单个同位素峰和同位素峰簇的基本特性是深刻认识和准确解析质谱数据的基础。本文以高分辨率质谱平台产出的数据为研究对象,经过大量的探索性分析,摸清了离子采样、峰宽和峰形,以及同位素峰簇的组成和丰度表示等肽段同位素峰的基本特性,为后续进一步的质谱数据解析奠定了良好的基础。这包括:给定质谱平台上离子峰宽与其质荷比呈多条二次曲线分布;在同一质谱平台上两者之间的函数关系具有可重复性,但在不同质谱平台上不具备可重复性;所有离子采样点数的频率分布与同一质荷比的多个母离子采样点数的频率分布均接近高斯分布;就同一质荷比的母离子而言,母离子峰的采样点数与其峰强度呈正相关,而与RT时间呈比较弱的负相关;应用考虑背景噪声时的高斯函数与单个同位素峰的峰形拟合效果最好;同位素峰簇组成峰个数与肽段的丰度、质量和RT时间等属性均呈正相关;最高峰强度表示的肽段同位素峰分布更接近理论同位素分布。(2)肽段同位素峰丰度分布误差研究。肽段同位素峰丰度测量精度是反映质谱仪器性能的一个重要指标。对肽段同位素峰丰度分布误差的研究有助于揭示质谱数据产出过程中存在的问题,从而为提高现有的数据解析方法和改进仪器性能提供线索。本文通过选取峰最大值作为单个同位素峰的定量指标,从不同角度考察了肽段同位素峰丰度误差分布,掌握了包括单个同位素峰归一化误差、局部平均误差和所有同位素峰总体误差,以及不同同位素峰丰度误差之间的相关性等在内的肽段同位素峰的丰度误差特性。这包括:与加和误差和乘积误差模型相比,归一化误差模型灵敏度更高;局部平均误差的计算减小了随机误差,凸显了系统误差的存在;利用两个核函数的混合高斯分布能够有效拟合所有肽段同位素峰丰度误差分布;不同次序的肽段同位素峰之间存在不同程度的相关性;高丰度同位素峰对低丰度同位素峰的抑制作用可能是系统误差和同位素峰之间相关性存在的内在原因。(3)肽段同位素峰丰度误差校正及应用。由于肽段同位素峰丰度值代表了肽段的定量信息,所以肽段同位素峰丰度测量误差也必然影响肽段定量精度。本文从不同角度出发,提出了两种同位素峰丰度误差校正算法,即比值误差校正算法和多元线性回归的迭代校正算法。利用多个实验数据集评估了两种校正算法的性能,结果表明比值误差校正算法能够很好地消除系统误差,但是对定量性能的提高比较有限;多元线性回归迭代算法在消除系统误差方面不如前者,但是对定量性能的提高更加有效。(4)泛素/类泛素修饰位点鉴定方法的改进优化研究。泛素/类泛素与靶标蛋白质结合以后,经过蛋白质酶的酶切作用,通常在修饰位点上残留一个氨基酸长链,给其修饰位点鉴定带来了很大的困难。本文总结了现有方法的不足,提出了一种改进的Ub/Ubl修饰位点鉴定工作流。利用两个公开的类泛素修饰数据集评估了改进后的工作流,结果表明相比原始Chop NSpice方法,改进后的工作流能够更无偏和灵敏地鉴定类泛素修饰肽段和位点;组合库策略既能够节省人工验证所需的时间,又能够减少假阳性鉴定结果;可变修饰策略能够自动地对修饰位点进行精确定位。因此,改进后的工作流更适合分析大规模泛素/类泛素修饰数据。(5)应用改进后的工作流实现了对类泛素FAT10修饰位点的首次鉴定。本文在建立改进的泛素/类泛素修饰鉴定工作流以后,与北京蛋白质组研究中心合作,将改进的工作流应用到大规模FAT10修饰数据分析,在国际上首次实现了对FAT10修饰位点的鉴定。FAT10修饰位点倾向位于亲水性氨基酸富集的区域,而仅在+2位置与类泛素SUMO修饰序列的保守性较一致。基于标准数据库搜索和无标记定量技术共鉴定到175个FAT10靶标蛋白质。对鉴定到的靶标蛋白质进行功能分类,发现FAT10靶标蛋白质在蛋白质转运、折叠、RNA加工、复杂大分子组装、基因表达的转录后调控、蛋白质定位、细胞凋亡调控和高尔基体囊泡出芽等生物学过程中发挥着重要作用。

关键词：生物信息学蛋白质组学质谱数据解析肽段同位素峰丰度误差无标记定量类泛素修饰改进工作流 FAT10修饰位点

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小鼠圆形精子细胞蛋白组学鉴定及mINCA1基因真核表达载体的构建

小鼠圆形精子细胞蛋白组学鉴定及mINCA1基因真核表达载体的构建

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作者：杨丽娟山西医科大学

学位级别：硕士

研究目的：1.通过无标记定量蛋白质组学策略结合质谱技术鉴定小鼠睾丸组织中圆形精子细胞的蛋白质组表达谱,并利用生物信息学对所鉴定的蛋白进行分析；2.构建小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1的真核表达质粒,并且筛选、鉴定其RNA干扰靶点,... 详细信息

研究目的： 1.通过无标记定量蛋白质组学策略结合质谱技术鉴定小鼠睾丸组织中圆形精子细胞的蛋白质组表达谱,并利用生物信息学对所鉴定的蛋白进行分析； 2.构建小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1的真核表达质粒,并且筛选、鉴定其RNA干扰靶点,为进一步研究mINCA1基因在精子发生过程中的功能奠定基础。研究方法： 1.利用重力沉降法分离纯化小鼠睾丸圆形精子细胞,并用免疫荧光染色法鉴定分离的圆形精子细胞； 2.提取圆形精子细胞总蛋白,经全自动2D-Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱分析； 3.利用生物信息学分析质谱检测到的肽段,确定蛋白的IPI；然后用DAVID分析工具,根据GeneOntology数据库的注释对蛋白质的分子功能和参与的生物学过程进行分析；并对蛋白质参与的代谢通路进行分析。 4.提取小鼠睾丸组织总RNA, RT-PCR扩增获得mINCA1的全长cDNA序列,将其与真核表达载体pMSCVpuro连接,构建重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1; 5.将重组质粒pMSCVpuro-mINCA1转染HEK293T细胞后,分别采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中mINCAl基因mRNA的转录及蛋白表达 6.设计4个针对mINCA1基因的RNA干扰序列,并构建干扰质粒,然后分别与重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1共转染HEK293T细胞,采用Westernblotting筛选mINCA1基因的干扰靶点。研究结果： 1.重力沉降法分离了小鼠睾丸组织圆形精子细胞,并利用免疫荧光染色对纯化的细胞进行鉴定； 2.无标记的定量分析策略结合液质谱联用的技术在圆形精子细胞中共鉴定到2331个蛋白并用DAVID分析工具,根据GeneOntology数据库的注释对蛋白质的分子功能和参与的生物学过程以及各种蛋白在细胞中的定位进行分析； 3.经PathawayKEGG注释对蛋白质的代谢通路注释进行分析,有370种蛋白质涉及能量代谢通路,68种蛋白涉及核糖体代谢,28种参与蛋白酶体途径,40种参与溶酶体途径,60种蛋白与mRNA的剪接有关。 ***、双酶切及测序结果证实重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1构建正确； 5.重组质粒转染HEK293T细胞后,经PCR和Western blotting检测有mINCA1基因mRNA和蛋白得以表达； 6.干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNAl和PGPU6/GFP/Neo-shRNA3可显著降低mINCA1蛋白的表达量。研究结论： 1.利用无标记蛋白质组学分析策略获得了小鼠圆形精子细胞的蛋白质表达谱,为深入研究精子发生的分子机制提供了丰富的信息。 2.成功构建了mINCA1基因真核表达质粒,并筛选出mINCA1基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究mINCA1基因的功能及作用机制奠定了实验基础。

关键词：圆形精子细胞无标记定量蛋白组学 mINCA1 RNA干扰

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蛋白质组的定量质谱分析的方法学研究

蛋白质组的定量质谱分析的方法学研究

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作者：刘姗姗南开大学

学位级别：硕士

细胞内蛋白质丰度动态的变化对生命过程有重要影响。精确的对生物体蛋白质进行定量研究，对于探索以及发现疾病标志物是非常重要的。定量蛋白质组学研究的最终目的是对某体系不同状态下的所有复杂蛋白进行鉴定和定量，这一方向是当前生... 详细信息

细胞内蛋白质丰度动态的变化对生命过程有重要影响。精确的对生物体蛋白质进行定量研究，对于探索以及发现疾病标志物是非常重要的。定量蛋白质组学研究的最终目的是对某体系不同状态下的所有复杂蛋白进行鉴定和定量，这一方向是当前生物科学领域研究的重要内容。\n 目前，研究定量蛋白质组学的方法主要分两类:一类是无标记定量方法，主要是通过比较质谱峰的强度和质谱分析的次数，从而实现分析不同来源的蛋白样品的量的变化。在本课题中，我们利用Skyline结合Diffprot软件对Waters公司的Q-TOF仪器的MSE数据进行进一步的蛋白质组定量分析。通过数据分析证明，与商用软件和手动分析方法相比，Skyline软件的计算结果更加可靠省时，这使得蛋白质通过MSE方法进行无标定量的研究变的更加快速方便;另一类定量蛋白质组学研究方法是基于标记技术的定量方法，是用针对某一类蛋白所具有的特异性化学探针标记目的肽段或蛋白，从而实现对表达蛋白质差异性以及修饰蛋白的差异进行精确的定量和进一步的分析。在本文中我们利用双甲基标记的技术对HDAC6基因敲除的小鼠细胞和正常小鼠细胞中的乙酰化蛋白进行定量比较，该研究工作不仅展示了基于双甲基同位素标记的质谱定量方法在蛋白质组学研究中的应用价值，更为挖掘HDAC6参与的多条信号通路中可能的新药物靶点提供了探索的方向。

关键词：无标记定量双甲基标记蛋白质组质谱分析

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小鼠圆形精子细胞蛋白质鉴定及mINCA1基因真核表达载体的构建

小鼠圆形精子细胞蛋白质鉴定及mINCA1基因真核表达载体的构建

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作者：杨丽娟山西医科大学

学位级别：硕士

研究目的:\n 1.通过无标记定量蛋白质组学策略结合质谱技术鉴定小鼠睾丸组织中圆形精子细胞的蛋白质组表达谱，并利用生物信息学对所鉴定的蛋白进行分析;\n 2.构建小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1的真核表达质粒，并且筛选、鉴定其... 详细信息

研究目的:\n 1.通过无标记定量蛋白质组学策略结合质谱技术鉴定小鼠睾丸组织中圆形精子细胞的蛋白质组表达谱，并利用生物信息学对所鉴定的蛋白进行分析;\n 2.构建小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1的真核表达质粒，并且筛选、鉴定其RNA干扰靶点，为进一步研究mINCA1基因在精子发生过程中的功能奠定基础。\n 研究方法:\n 1.利用重力沉降法分离纯化小鼠睾丸圆形精子细胞，并用免疫荧光染色法鉴定分离的圆形精子细胞;\n 2.提取圆形精子细胞总蛋白，经全自动2D-Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱分析;\n 3.利用生物信息学分析质谱检测到的肽段，确定蛋白的IPI;然后用DAVID分析工具，根据GeneOntology数据库的注释对蛋白质的分子功能和参与的生物学过程进行分析;并对蛋白质参与的代谢通路进行分析。\n 4.提取小鼠睾丸组织总RNA，RT-PCR扩增获得mINCA1的全长cDNA序列，将其与真核表达载体pMSCVpuro连接，构建重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1;\n 5.将重组质粒pMSCVpuro-mINCA1转染HEK293T细胞后，分别采用RT-PCR和Westernblotting法检测细胞中mINCA1基因mRNA的转录及蛋白表达6.设计4个针对mINCA1基因的RNA干扰序列，并构建干扰质粒，然后分别与重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1共转染HEK293T细胞，采用Westernblotting筛选mINCA1基因的干扰靶点。\n 研究结果:\n 1.重力沉降法分离了小鼠睾丸组织圆形精子细胞，并利用免疫荧光染色对纯化的细胞进行鉴定;\n 2.无标记的定量分析策略结合液质谱联用的技术在圆形精子细胞中共鉴定到2331个蛋白并用DAVID分析工具，根据GeneOntology数据库的注释对蛋白质的分子功能和参与的生物学过程以及各种蛋白在细胞中的定位进行分析;\n 3.经PathawayKEGG注释对蛋白质的代谢通路注释进行分析，有370种蛋白质涉及能量代谢通路，68种蛋白涉及核糖体代谢，28种参与蛋白酶体途径，40种参与溶酶体途径，60种蛋白与mRNA的剪接有关。\n ***、双酶切及测序结果证实重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1构建正确;\n 5.重组质粒转染HEK293T细胞后，经PCR和Western blotting检测有mINCA1基因mRNA和蛋白得以表达;\n 6.干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1和PGPU6/GFP/Neo-shRNA3可显著降低mINCA1蛋白的表达量。\n 研究结论:\n 1.利用无标记蛋白质组学分析策略获得了小鼠圆形精子细胞的蛋白质表达谱，为深入研究精子发生的分子机制提供了丰富的信息。\n 2.成功构建了mINCA1基因真核表达质粒，并筛选出mINCA1基因的2个有效干扰靶点，为进一步研究mINCA1基因的功能及作用机制奠定了实验基础。

关键词：睾丸组织圆形精子细胞蛋白质鉴定无标记定量 mINCA1基因真核表达载体质谱鉴定

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利用半随机抽样模型进行蛋白质概率计算方法的评估等质谱信息学研究

利用半随机抽样模型进行蛋白质概率计算方法的评估等质谱信息学研...

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作者：薛晓芳中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

Shotgun技术是大规模蛋白质鉴定的重要方法，能在一次实验中获得大量的数据，而这些数据的可靠性是蛋白鉴定的一个重要问题。当前关于鉴定结果质量控制的研究主要集中在肽段水平上，而对于蛋白质水平上的鉴定结果可靠性研究比较少，且... 详细信息

Shotgun技术是大规模蛋白质鉴定的重要方法，能在一次实验中获得大量的数据，而这些数据的可靠性是蛋白鉴定的一个重要问题。当前关于鉴定结果质量控制的研究主要集中在肽段水平上，而对于蛋白质水平上的鉴定结果可靠性研究比较少，且这些研究中的评估方法所用的数据量都比较小，不足以说明方法的有效性。我们在对现有shotgun蛋白质鉴定过程充分理解的基础上，建立了一个半随机抽样模型模拟大量数据搜索后鉴定结果，以期用该模型评估蛋白质概率计算过程中可能涉及到的影响因素，同时评估现有的蛋白质概率计算方法。为了验证所建立的半随机抽样模型的可靠性，我们对一批标准蛋白质数据进行模拟，比较不同肽段数上的模拟的和真实的蛋白质或肽段数，发现两种结果基本相似，证明了该模型能基本代表真实的蛋白质鉴定过程。基于一批人肝脏的数据，我们利用半随机抽样模型模拟的34批数据，对鉴定结果的数据量大小、搜索数据库大小和去高丰度蛋白质等影响蛋白质概率计算的因素进行了评估，发现随着数据库和数据量的增大蛋白质的总体阳性率都会下降，而去除高丰度的蛋白质在一定程度上能够提高蛋白质的真阳性率。同时，利用这些模拟数据，我们对目前常用的4种蛋白质概率计算方法进行了评估，发现PROTPROBE能较好地区分鉴定结果中假阳性和真阳性蛋白质；ProteinProphet计算的蛋白质概率高于真实结果且区分度不佳；取双肽段以上（≥2个非冗余肽段）蛋白质的方法效果较好，但会受到数据库和数据量大小的影响：HPPP所采用的泊松模型在一定程度上能较准确地计算假阳性蛋白质鉴定数，但这种方法强烈依赖于单肽段的假阳性率。因此，总体而言，现有的各种方法在部分解决蛋白质水平质量控制的同时，都存在着各自的缺陷，至今尚无较成熟可靠的方法。另外，随着蛋白质组学的发展，以及系统生物学研究的逐渐开展，需要高通量地进行蛋白质的相对定量。我们在目前所用的无标记定量方法的基础上，用EM算法进行了方法的改进，并利用已有研究发表的数据进行验证。结果表明，改进

关键词：蛋白质鉴定蛋白质概率无标记定量鸟枪法印算法 Mascot

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肝癌细胞侵袭转移相关的蛋白质组和泛素化蛋白质组研究

肝癌细胞侵袭转移相关的蛋白质组和泛素化蛋白质组研究

引用

作者：孙颖福建农林大学

学位级别：硕士

肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在各种恶性肿瘤中高居第二位。虽然目前肝细胞癌的治疗水平正不断提高,但肝癌患者预后差的状况并未得到明显改善。肝癌5年转移复发率仍然高达57.2%,是影响肝癌远期疗效的瓶颈。因此,寻找新的... 详细信息

肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在各种恶性肿瘤中高居第二位。虽然目前肝细胞癌的治疗水平正不断提高,但肝癌患者预后差的状况并未得到明显改善。肝癌5年转移复发率仍然高达57.2%,是影响肝癌远期疗效的瓶颈。因此,寻找新的高特异性和高灵敏度的肝细胞癌预后生物标志物是目前进一步提高肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率、提高肝癌远期生存率的关键。本课题运用无标记定量蛋白质组学技术(Label-free)联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析 Hep3B、MHCC97L、MHCC97H 以及HCCLM3四组具有不同侵袭转移潜能的肝癌细胞系的蛋白质组和泛素化蛋白质组,筛选与肝癌侵袭转移相关的差异表达蛋白及泛素化修饰位点,以期寻找可以预测肝细胞癌复发转移潜在的生物标志物,并初步探讨其参与肝细胞癌复发转移的分子机制。定量蛋白质组学研究中,以侵袭转移潜能最低的Hep3B细胞系为对照,设定差异倍数>2.0为上调蛋白,差异倍数<0.5为下调蛋白。在四组肝癌细胞系中共筛选到218个差异表达蛋白,其中上调蛋白有43个,下调蛋白有175个。对差异表达蛋白进行GO分析发现差异表达蛋白主要参与细胞粘附生物过程,分子功能涉及与细胞粘附相关的钙黏蛋白结合活性和Ran鸟苷三磷酸酶活性;KEGG信号通路分析发现差异表达蛋白主要涉及碳代谢信号通路;差异表达蛋白的互作网络主要以HSPA9为中心。泛素化修饰定量蛋白质组学分析对四组细胞株进行双甘氨酸(di-Gly)抗体亲和纯化泛素化肽段,比较不同侵袭转移潜能的肝癌细胞系的泛素化修饰蛋白及修饰位点的差异。以侵袭转移潜能最低的Hep3B细胞系为对照,设定差异倍数>2.0为上调,差异倍数<0.5为下调,挑选泛素化差异表达蛋白及位点。在四组肝癌细胞系中共筛选到235个差异表达的泛素化蛋白和1919个泛素化修饰位点。其中上调泛素化蛋白有70个,下调泛素化蛋白有165个。GO分析发现差异的泛素化蛋白主要参与细胞粘附和乳酸代谢生物过程,主要涉及与细胞粘附相关的钙黏蛋白结合活性分子功能;KEGG信号通路分析发现泛素化差异表达蛋白主要涉及糖酵解和糖质新生信号通路;蛋白互作网络主要以CTNND1为中心。另外,在表达差异的泛素化肽段中推测到最可能的基序(motif)是:IALAEEAKAAGAPKE。主要的泛素化位点为:DESTK19;FLNBK1955。本文定量分析了不同侵袭转移潜能肝癌细胞株的蛋白质组以及泛素化修饰组,深入探讨了肝癌细胞的侵袭转移在蛋白质组和泛素化修饰组层面的主要特征,并筛选了 DEST和FLNB2个潜在的可能作为肝癌预后的生物标志物,为后续肝癌转移复发的研究提供了理论基础。

关键词：肝细胞癌泛素化侵袭转移无标记定量液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)

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中国境内4种常见蛇毒的蛋白质组学研究

引用

蛇志 2019年第2期31卷 175-177,183页

作者：张经硕向平沈敏上海市法医学重点实验室(司法部司法鉴定科学技术研究所) 上海200063 苏州大学医学部江苏苏州215123

目的研究中华眼镜蛇毒、尖吻蝮蛇毒、银环蛇毒和金环蛇毒的蛋白构成。方法采用鸟枪蛋白质组学策略结合无标记定量方法检测4种蛇毒的蛋白种类及丰度。结果金属蛋白酶Aculysin-2、金属蛋白酶前体H4、心脏毒素1e、磷脂酶B81b、Thaicobrin... 详细信息

目的研究中华眼镜蛇毒、尖吻蝮蛇毒、银环蛇毒和金环蛇毒的蛋白构成。方法采用鸟枪蛋白质组学策略结合无标记定量方法检测4种蛇毒的蛋白种类及丰度。结果金属蛋白酶Aculysin-2、金属蛋白酶前体H4、心脏毒素1e、磷脂酶B81b、Thaicobrin、乙酰胆碱酯酶在多种毒液中均被检出,可能成为影响免疫鉴定方法准确度的因素。结论揭示不同蛇毒的蛋白构成的异同可以为蛇伤鉴定方法的开发与蛇伤救治提供基础。

关键词：蛇毒蛋白质蛋白质组学无标记定量蛋白质丰度

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