检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：王金黎南京大学

学位级别：博士

基于适配体检测蛋白的传感器得益于适配体的优点-稳定、易合成、易修饰、体积小、亲和力强等特点，并成功与多种分析检测方法联用。在适配体和蛋白相互作用中，由于适配体能成为部分抗体识别与结合目标蛋白的替代物而具有重要的研究价值... 详细信息

基于适配体检测蛋白的传感器得益于适配体的优点-稳定、易合成、易修饰、体积小、亲和力强等特点，并成功与多种分析检测方法联用。在适配体和蛋白相互作用中，由于适配体能成为部分抗体识别与结合目标蛋白的替代物而具有重要的研究价值。\n 本论文在广泛查阅了适配体传感器及无标记检测方法的文献报道的基础上，结合本实验室的研究方向和技术基础，开展了以电化学阻抗法和表面等离子共振技术等无标记检测技术进行适配体传感器和适配体芯片的研究，以hIgE和其D17.4适配体作为核心研究体系，开展了适配体-蛋白相互作用方式研究、SPR的亲合常数研究、DNA芯片定向固定检测适配体-蛋白相互作用研究和电辅助杂交固定适配体研究等几个方面的工作，对反应方式考察和传感方法进行了创新和尝试。\n 第一部分：基于SPR技术的人IgE与适配体相互作用检测研究\n 本部分以SPR技术对人IgE与其DNA适配体的相互作用进行了考察。首先证明了以SPR可以通过固定适配体特异性地对人IgE定性、定量检测；另外，通过对SPR定量检测目标蛋白的数据进行拟合，并用软件估算了人IgE与其适配体的亲和常数，发现其比抗体和人IgE的亲和常数稍高，说明适配体可以取代人IgE的抗体作为识别分子制作传感器，具有更好的亲和力、更稳定的性质和更易得的传感界面。\n 另外，通过不同反应方式，在SPR芯片上进行了连续反应，得出如下结论：人IgE可以和其适配体及抗体同时结合，揭示了抗体和适配体对人IgE的结合位点不同，为进行人IgE的夹心法检测提供了可能。最后，就人IgE与多个适配体的作用进行了考察，通过生物素偶联亲和素蛋白进行适配体检测信号的放大，并进一步发现人IgE可以结合多个适配体。\n 第二部分：DNA定向引导的适配体芯片制备与检测方法研究\n 本部分发展了一种用DNA阵列检测蛋白的新方法。不同于在芯片表面直接固定适配体的方法，我们首先让人IgE和适配体在溶液中均相反应，然后将混合物加到芯片上进行反应，使人IgE-适配体的复合物通过适配体的衍生链杂交到DNA芯片表面，然后电化学阻抗法(EIS)进行测定，通过对电极杂交前后的电子转移阻抗(Rct)的比较对样品进行检测。为了考察该方法的选择性，我们在芯片上固定四种不同的探针序列，其中一条与适配体的衍生链完全互补，另外三条链与之相比分别在中段有1至3个碱基错配，然后用适配体和人IgE反应后加在芯片上，发现可以在固定了互补链的电极上检测出来，而在其余电极上的信号则随着错配数的增加而下降。另外，当混合适配体反应时，可以在有互补序列的电极上检测到目标蛋白，说明该方法适合于阵列式芯片检测。\n 第三部分：电化学控制寻址固定的适配体阵列芯片制备和检测研究\n 本部分描述了一种用电化学控制的方法制作适配体传感阵列的方法。适配体通过与芯片表面以S-Au键自组装固定的DNA探针杂交的方式进行固定，这一过程以控制电位方法进行加速。首先，在杂交体系中加入循环扫描电压，将人IgE的适配体定向杂交到芯片上的DNA探针上，然后将人IgE结合到适配体上，结合过程通过电化学阻抗法和SPR进行检测。结果证明循环扫描电压可以促进杂交以形成适配体识别界面。以此方法制成的适配体传感界面，可以对人IgE进行定量检测，证明此方法可以用作适配体传感界面形成的控制方法。除此之外，将带有不同延伸序列的适配体杂交到DNA阵列上，通过加电控制可以使带有不同延伸序列的适配体同时杂交到各自互补的DNA探针上，证明该方法可以用于阵列式适配体传感界面的制备。\n 第四部分：SPR结合蛋白芯片技术检测抗原-抗体亲和常数的研究\n 本部分以高通量的蛋白质芯片技术进行了一系列抗原抗体相互作用亲和常数的测定，利用蛋白芯片高通量、高灵敏度和平行性好以及相关点样、扫描技术自动化的特点，简化了多样品平行测定的过程，并采用SPR方法进行人白蛋白与其抗体的亲和常数测定，发现两者测定具有一致的结果，并进一步采用ELISA技术进行了验证，为大量抗原抗体亲和常数的比较提供了方法基础。\n 综上所述，本论文具有以下创新点和意义：\n 1.通过对适配体与hIgE反应过程的设计，利用SPR的实时表征和连续检测性能，建立了考察人IgE与其抗体和适配体的相互作用的新方法，研究中发现了人IgE可以和其适配体和抗体同时作用，而且二者具有不同的作用位点，另外，并发现了人IgE具有多个适配体作用位点。本文的发现不仅给人IgE给出更多的相互作用信息，可以用作分析检测的扩展，也为SPR检测核酸-蛋白相互作用提供了新的反应模式。\n 2.利用适配体作为一种DNA分子可以进行杂交的特点，通过序列识别将适配体定向引导到相应阵列位点上进行固定；同时，让人IgE与其适配体先在溶液中进行结合，以便

关键词：适配体检测蛋白表面等离子共振电化学阻抗适配体阵列无标记技术

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胞外囊泡异质性无标记表征技术研究进展

引用

中国科学：化学 2022年第9期52卷 1636-1648页

作者：戴一川于亚军王献立江仔玲储开芹 Zachary J.Smith 中国科学技术大学精密机械与精密仪器系安徽省教育部精密科学仪器安徽普通高校重点实验室合肥230027 中国科学技术大学苏州高等研究院苏州215127

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞在信息传递和环境调控时产生的磷脂双分子层膜包裹的囊泡(尺寸为30~1000 nm).近十五年,其生物及临床相关研究发展迅猛,已被视为是细胞间信息传递、癌宿主调节等动态过程的关键因素之一.尽管... 详细信息

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞在信息传递和环境调控时产生的磷脂双分子层膜包裹的囊泡(尺寸为30~1000 nm).近十五年,其生物及临床相关研究发展迅猛,已被视为是细胞间信息传递、癌宿主调节等动态过程的关键因素之一.尽管胞外囊泡具有重要的生物学功能,但其尺寸小、结构脆弱且易聚集,传统生化分析和检测技术难以对其实现精准表征.目前,EVs相关的大多数表征技术采用“批量分析”形式,仅提供大量外泌体的平均结果.为了加深对胞外囊泡异质性的认识,以单个EVs为目标的表征技术将成为新的趋势.本文概述了单颗粒水平胞外囊泡表征的光学和非光学的无标记表征方法,包括拉曼显微、等离激元技术、原子力显微和电子显微技术等.相比于传统整体分析方法,单颗粒水平胞外囊泡表征能够提供更加丰富的信息,在生物医药基础研究领域有着广阔前景.

关键词： EVs 外泌体细胞外囊泡无标记技术光学表征技术

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