检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：乔梦想河南工业大学

学位级别：硕士

真菌毒素是一类由特定真菌群所产生的高毒性次生代谢物,其中赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)作为分布最广泛、毒性最强的两种毒素,对人类和动物都存在着严重的危害。目前广泛应用的真菌毒素检测手段虽能准确鉴定这些毒素,却面临... 详细信息

真菌毒素是一类由特定真菌群所产生的高毒性次生代谢物,其中赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)作为分布最广泛、毒性最强的两种毒素,对人类和动物都存在着严重的危害。目前广泛应用的真菌毒素检测手段虽能准确鉴定这些毒素,却面临着成本高、耗时长等挑战。因此,构建快速、高灵敏的OTA和AFB1分析检测方法具有重要意义。本课题利用适配体的高亲和力和高特异性,结合功能性纳米材料优越的性能,同时借助DNA纳米结构的稳定性以及杂交链式反应(HCR)和催化发夹自组装(CHA)等扩增技术,构建新型荧光DNA传感器用于灵敏、简便检测食品中的OTA和AFB1。具体研究内容如下: 1.合成一种新型三维多孔氮硫共掺杂多孔碳(3D N-S-C)片状材料作为荧光适配体传感器的能量受体,HCR作为信号扩增策略,构建用于检测OTA的荧光适配体传感器。与棒状和球状的N-S-C材料相比,片状3D N-S-C材料构建的荧光适配体传感器相对荧光强度最大。同时该荧光传感器对OTA具有良好的稳定性,在0.01～500 ng/mL范围内,传感器的检出限(LOD)低至2.7 pg/mL。此外,将本传感器的检测方法与高效液相色谱法(HPLC)进行对比分析,结果传感器的潜在适用性得到良好验证。 2.制备新型的中空碳掺杂氮纳米球(HCNS)作为猝灭材料首次应用于荧光法检测AFB1,同时设计一种独特且具有刚性的H型DNA纳米结构,构建一种高灵敏的荧光适配体传感器,实现对AFB1的高效检测。在H型DNA纳米结构的构成中,由两条互补链C1和C2组成H型结构的骨架。由羧基荧光素(FAM)标记的S1-FAM作为信号探针,通过碱基互补结合到骨架两侧形成完整的H型DNA纳米结构。当AFB1存在时与适配体特异性结合,此时H型DNA纳米结构较高的稳定性,使传感器保持较高的信号响应。荧光适体传感器在最佳检测条件下的检测范围为0.05～500 ng/mL,LOD低至0.023 ng/mL。该传感器成功应用于花生、玉米粉、小麦、红酒、红茶样品中的AFB1检测。此外,通过对质控样中AFB1的检测,进一步验证传感器的适用性。 3.设计一条双端标记的互补DNA单链,可以同时与两种不同的适配体链结合。将具有纳米分支结构的金纳米花(AuNFs)和猝灭基团(BHQ1)作为荧光适配体传感器的荧光能量受体,用于猝灭荧光能量供体FAM和Cy3的荧光。基于荧光共振能量转移(FRET)效应构建一种双信号输出的荧光适配体传感器,实现对OTA和AFB1的同时检测。与金纳米颗粒(Au NPs)相比,AuNFs具有较尖锐的分支结构,这种结构为AuNFs提供更大的比表面积。在最佳实验条件下,AFB1和OTA的LOD分别为0.014 ng/mL和0.027 ng/mL,LOQ分别为0.046 ng/mL和0.089 ng/mL。用传感器进行实际样品分析,样品中AFB1和OTA的加标回收率分别为94.1%～111.7%和98.7%～112.2%。该传感器成功应用于实际样品,为高灵敏、同时检测真菌毒素提供了一种新思路。 4.将具有高稳定性、生物相容性的金纳米团簇(AuNCs)作为荧光适体传感器的内参比信号,而无标记荧光染料N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)和SYBR Green I(SGI)作为荧光适配体传感器的响应信号,在传感器制备过程中引入HCR和CHA进行信号扩增,构建一种用于同时检测OTA和AFB1的双扩增双比率型传感器。在传感器的最佳检测性能下,OTA和AFB1的线性范围在0.05～200 ng/mL之间,OTA和AFB1的LOD分别为6.7 pg/mL和8.6 pg/mL。同时,以花生、大豆和玉米为研究对象,对传感器进行加标回收实验,加标样品中OTA和AFB1的回收率分别在96.9%～107.9%和97.9%～104.4%之间,且RSD均小于15%。

关键词：赭曲霉毒素A 黄曲霉毒素B1 荧光适配体传感器功能性纳米材料 DNA纳米结构无标记探针比率型传感器

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用于检测黄曲霉毒素B1的DNA荧光传感器构建

用于检测黄曲霉毒素B1的DNA荧光传感器构建

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作者：赵路阳河南工业大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种典型的真菌毒素,在农产品中极易残留,当蓄积到一定量时对人类和动物都有巨大的威胁。因此,准确、快速地测定AFB1对环境分析和食品安全至关重要。本课题利用荧光传感器操作简单、成本低、稳定性好等优势,结合... 详细信息

黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种典型的真菌毒素,在农产品中极易残留,当蓄积到一定量时对人类和动物都有巨大的威胁。因此,准确、快速地测定AFB1对环境分析和食品安全至关重要。本课题利用荧光传感器操作简单、成本低、稳定性好等优势,结合适配体的高亲和力和特异性,并引入磁珠（MBs）、DNA纳米结构、核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）和催化发夹自组装等不同的传感策略,构建了三种用于检测AFB1的DNA荧光适配体传感器。具体研究内容如下:1.合成了一种新型氮掺杂碳负载钯（C-N-Pd）材料,并首次将其作为荧光适配体传感器的能量受体。以C-N-Pd为新型猝灭材料,Exo Ⅲ辅助信号放大,构建了用于检测AFB1的荧光传感器。与不加酶相比,添加Exo Ⅲ的传感器的荧光响应值提高了74.7%。该荧光传感器对AFB1具有良好的选择性,检出限（LOD）低至9 pg/m L。将本传感器对玉米、花生和葡萄酒样品中的AFB1进行了检测,LOD分别为15 pg/m L、13 pg/m L和18 pg/m L。此外,将本方法与高效液相色谱法（HPLC）进行了比较,t值为1.588,小于理论t值4.303,表明在95%的置信区间下两者具有较好的一致性。该方法不仅操作简单,并且从传感器的制备到实现检测仅需2 h,在快速检测方面具有较高的潜力。2.经前期研究发现,单信号在受到环境影响下可能会产生假阳性。且基于Exo Ⅲ的辅助信号放大策略容易受到温度和p H的影响。而本实验设计了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的比率型传感器,以两个不同波长下的荧光强度比值作为响应信号,可以极大地减弱复杂环境对荧光的负面影响,达到内部校正的效果。同时辅以无酶扩增催化发夹自组装实现信号放大,用于食品中AFB1的特异性检测。与单信号模式相比,基于FCy3/FCy5的比率型信号模式对AFB1的检测具有更宽的线性范围（0.1-100 ng/m L）和更高的相关系数（R2=0.991）。对于花生、大豆和葡萄酒样品的加标实验,以FCy3、FCy5和FCy3/FCy5等3条标准曲线回收率的平均值为参考值,比率型信号比单信号具有更高的精度。同时,树枝状支架的存在不仅提高了传感器的稳定性,而且提高了FRET的效率。在整个检测过程中,有树枝状DNA纳米结构的响应信号差是无树枝状DNA纳米结构的5.7倍。此外,引入催化发夹自组装这一无酶扩增策略,通过适配体互补链（c-DNA）的循环实现信号扩增。3.经前期研究发现,基于比率型的传感器具有更高的准确性,且自主合成的DNA纳米结构可以提高FRET的效率。本实验引入了具有发夹结构的h-DNA,并首次将金钯纳米颗粒（Au-Pd NPs）作为荧光猝灭基底,自主合成了碳点（CDs）,同时引入SYBR Green I（SG I）染料,构建了以FCDs/FSG I为信号的比率型传感器用于食品中AFB1的特异性检测。h-DNA的加入,极大地提高了其负载适配体（Apt）的效率。Au-Pd NPs对CDs的猝灭效果分别是Au NPs、Pd NPs的1.4倍和3.4倍。与标记型探针相比,本传感器所用的自主合成的CDs和无标记探针SG I具有节省成本的优势。在1-100 ng/m L范围内,FCDs/FSGI与AFB1的浓度对数具有良好的线性关系,LOD低至0.07 ng/m L。同时,本传感器对花生和葡萄酒样品中的AFB1进行了加标检测,回收率在91%-115%之间,表明本传感器在实际样品检测中具有较高的应用潜力。

关键词：黄曲霉毒素B1 荧光适配体传感器核酸外切酶Ⅲ 树枝状DNA纳米结构比率型传感器金钯纳米颗粒无标记探针

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基于硫黄素T荧光调控的生化分析新方法研究

基于硫黄素T荧光调控的生化分析新方法研究

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作者：李燕云华东师范大学

学位级别：硕士

荧光分子探针的设计及其应用是当前国内外的研究热点。荧光分子探针具有操作简单、响应迅速、选择性好、不受电场、磁场的影响、分析结果准确可靠等优点,具有超高灵敏度、可实现单分子分析、可原位检测和实时检测。开发新型的荧光分子探... 详细信息

荧光分子探针的设计及其应用是当前国内外的研究热点。荧光分子探针具有操作简单、响应迅速、选择性好、不受电场、磁场的影响、分析结果准确可靠等优点,具有超高灵敏度、可实现单分子分析、可原位检测和实时检测。开发新型的荧光分子探针,对于医疗、农业、食品安全和环境科学等领域而言是一项重要内容。本论文基于硫黄素T的荧光调控及其生化分析为研究目标,结合当前这一领域的发展趋势,进一步利用不同封闭系统如简单阴阳离子、DNA、稀土有机配位聚合物等构建硫黄素T荧光调控新策略,以此开发了简单高效、灵敏度高、选择性好的荧光分子探针,应用于快速检测金属离子(Ag+)、阴离子(Ⅰ-)及环境参数(温度),为环境监测与保护、食品和药物安全分析、医学诊断及临床治疗和生化分析等重要领域提供了新的设计思路和方法。本论文由四个部分组成,具体如下：第一章绪论首先,介绍几种常见的荧光分子探针及其当前的研究进展,然后着重论述了硫黄素T荧光染料分子,包括硫黄素T的光学性质、硫黄素T荧光调控策略以及硫黄素T荧光探针的研究进展。最后阐述了本论文研究的意义和主要内容。第二章简单阴阳离子调控硫黄素T荧光的分析策略构建及银离子检测应用本章利用银离子(Ag+)、碘离子(Ⅰ-和硫黄素T(ThT)在水溶液中形成ThT@AgI超微粒设计出一种检测Ag+的比率型荧光探针,该探针对Ag+具有良好的选择性和灵敏度,在Ag-浓度为0.1-10μM时,该方法呈现很好的线性,最低检测限约为50 nM。ThT水溶液荧光很弱,主要以ThT单分子形式存在,荧光发射峰位于49011m处；然而,在ThT@AgI超微粒中,ThT以二聚体的形式存在,荧光增强,荧光发射峰红移至546 n1T1处。该方法还可用于逻辑门的设计和实际样中Ag+的检测,在自来水样中得到了很好的回收率。通过往ThT溶液加入简单阴阳离子Ag+、Ⅰ-或S2-可以调控ThT的荧光,开辟了用简单阴阳离子调控ThT荧光的新途径,对ThT在受限环境下的荧光增强机制的研究大有帮助。第三章DNA调控硫黄素T荧光的分析策略构建及碘离子检测应用本章基于DNA调控硫黄素T(ThT)荧光开发了一种简单、快速的无标记分子信标荧光探针,并将其成功应用于碘离子(Ⅰ--)的检测。我们通过“一锅法”将ThT、一段特定序列的DNA(记为MSD)和汞离子(Hg2+)混合得到ThT/MSD/Hg2+无标记荧光探针,并考察该探针检测Ⅰ-的选择性、线性以及最低检测限。结果表明,在干扰离子浓度是Ⅰ-浓度十倍的混合样品中,该探针对Ⅰ-仍具有良好的选择性,因为Ⅰ-可以将Hg2+从"T-Hg2+-T"结构中剥夺出来。我们引入了常用的生物巯基屏蔽剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)来消除生物巯基对Ⅰ-检测的影响,以提高ThT/MSD/Hg2+无标记分子信标探针的选择性。在Ⅰ-浓度为0.5-6μM时,该方法呈现很好的线性,最低检测限为158 nM。该方法还可用于逻辑门的设计和实际样中Ⅰ-的检测,在人体尿样和人工尿样中得到了很好的回收率,这表明ThT/MSD/Hg2+无标记分子信标荧光探针在实际应用中展现出巨大的潜力。第四章稀土有机配位聚合物调控硫黄素T荧光的分析策略构建及温度检测应用本章基于硫黄素T(ThT)和稀土有机配位聚合物开发了一种简单、快速的无标记荧光探针并成功应用于温度的检测。我们通过“一锅法”将ThT、硝酸铕(Eu(NO3)3)和鸟苷酸(GMP)混合得到ThT/Eu/GMP无标记荧光探针,Eu(NO3)3和GMP在自组装形成Eu/GMP稀土有机配位聚合物时,可以将ThT包被进去,造成ThT荧光增强。我们考察该探针作为温度传感器的可行性,结果表明,ThT/Eu/GMP无标记荧光探针可以实现对温度的可视化、可逆检测,该探针不需要化学修饰和荧光标记,合成简单、成本低。第五章总结与展望本章总结了本论文研究的意义和主要内容的创新特色之处,并阐述了今后本研究方向的展望与设想。

关键词：硫黄素T 荧光调控生物分析比率型探针无标记探针

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无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性

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第四军医大学学报 2009年第16期30卷 1484-1487页

作者：郜莉娜尤崇革潘云燕李光迪王芳芳兰州大学第二医院检验科甘肃兰州730030

目的:探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性(SNP)的实用性.方法:采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型.以其-597G>A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物... 详细信息

目的:探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性(SNP)的实用性.方法:采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型.以其-597G>A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg2+浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化.并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证.结果:结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是最适Mg2+浓度为2.5mmol/L,不对称PCR引物比例为0.1/0.5μmol/L,模板浓度为10ng/10μL的两步法不对称PCR.该体系对100例样本进行IL-6基因-597G>A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致.结论:无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法.

关键词：白细胞介素6 EvaGreen 无标记探针多态性,单核苷酸

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无标记探针检测单核苷酸多态性分子诊断技术的建立和应用

无标记探针检测单核苷酸多态性分子诊断技术的建立和应用

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作者：郜莉娜兰州大学

学位级别：硕士

目的:建立无标记探针分子诊断技术检测基因SNP。方法:采用新型荧光染料建立无标记探针分子诊断技术进行基因的SNP分型。设计IL-1B基因-511T＞C、-31T＞C、3954C＞T和IL-6基因-174G＞C、-597G＞A以及IL-6R基因外显子358A＞C等SNP位点的... 详细信息

目的: 建立无标记探针分子诊断技术检测基因SNP。方法: 采用新型荧光染料建立无标记探针分子诊断技术进行基因的SNP分型。设计IL-1B基因-511T＞C、-31T＞C、3954C＞T和IL-6基因-174G＞C、-597G＞A以及IL-6R基因外显子358A＞C等SNP位点的扩增引物和无标记探针。以其中IL-6基因-597G＞A位点为例,按PCR扩增效率和产物特异性进行不同染料Mg2+浓度、DNA聚合酶、不对称PCR引物比例、模板浓度以及退火温度等扩增条件的优化。并以此优化体系为基础建立各位点聚合酶链反应-无标记探针（PCR-UP）技术分子诊断方法,同时用所建立的扩增体系对100例临床标本进行IL-6基因-597G＞A和-174G＞C位点的基因分型,分型后的杂合型和突变型PCR产物以测序金标准进行验证。结果: 结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系最适Mg2+浓度为2.5mmol/L,金思特realstartTaq DNA polymerase扩增效率和PCR产物特异性最佳,模板最低浓度可达10ng/10μL;IL-1B基因-511T＞C、-31T＞C、3954C＞T的引物不对称比例为0.02/0.3umol/L,IL-6基因-174G＞C和-597G＞A位点的引物比例为0.1/0.5umol/L,IL-6R基因外显子358A＞C位点不对称PCR引物比例为0.05/0.5μmol/L时PCR扩增效率和产物特异性最好;用无标记探针分子诊断技术对100例门诊体检者进行IL-6基因-597G＞A和-174G＞C位点基因分型,其结果与测序结果一致。结论: 应用EvaGreen荧光染料建立PCR-UP分子诊断技术检测基因SNP是一种简单易行、快速准确并可常规化的基因分型方法。

关键词： DNA荧光染料不对称PCR 无标记探针

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基于高分辨率熔解分析的基因分型新技术

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现代检验医学杂志 2011年第6期26卷 159-161页

作者：李菲菲尤崇革兰州大学第二医院中心实验室兰州730030

目的综述基于高分辨熔解分析（HRM）的基因分型新技术.方法介绍无标记探针、弹回引物、隐蔽探针、温度开关PCR、等位基因特异延伸PCR和低变性温度下共扩增PCR等技术的基本原理并评价其适用性.结果这些新技术不仅避免了产物污染,提高... 详细信息

目的综述基于高分辨熔解分析（HRM）的基因分型新技术.方法介绍无标记探针、弹回引物、隐蔽探针、温度开关PCR、等位基因特异延伸PCR和低变性温度下共扩增PCR等技术的基本原理并评价其适用性.结果这些新技术不仅避免了产物污染,提高了HRM基因分型的准确性和敏感度,而且拓展了HRM的应用范围.结论基于HRM的基因分型新技术有望成为临床分子诊断的新方法.

关键词：高分辨熔解无标记探针弹回引物隐蔽探针温度开关PCR

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IL1和TNF基因启动子SNP高分辨熔解分子诊断新技术的建立及临床应用评价

IL1和TNF基因启动子SNP高分辨熔解分子诊断新技术的建立及临床应...

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作者：尤崇革呼志斌王丽萍郜莉娜施鑫鹤王芳芳李菲菲兰州大学第二医院

(1)课题来源与背景：甘肃省科技厅科技支撑项目,项目编号：090NKCA094。 (2)技术原理及性能指标：基本原理是利用双链DNA分子热变性时嵌入其中的荧光染料释放发生减色效应形成特征熔解曲线,由于DNA序列的长度,GC含量以及碱基互补... 详细信息

标准号: 1100500475

(1)课题来源与背景：甘肃省科技厅科技支撑项目,项目编号：090NKCA094。 (2)技术原理及性能指标：基本原理是利用双链DNA分子热变性时嵌入其中的荧光染料释放发生减色效应形成特征熔解曲线,由于DNA序列的长度,GC含量以及碱基互补性的差异在运行高分辨率熔解后会形成不同的特异熔解曲线,其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。相比传统的SNP或突变分析法和定量探针法,HRM简化了操作时间和步骤,大大降低了使用成本,并且实现了闭管操作,使其用于临床常规化检测成为可能。性能指标：建立高分辨熔解曲线分析技术平台,拥有适合qPCR仪检测分析的荧光染料和酶系统,形成检测IL-1和TNF以及IL-6基因启动子SNP的PCR-HRM或PCR-UP-HRM临床分子诊断方法和评价其性能指标如特异性、灵敏度和重复性等。 (3)技术的创新性与先进性：本项目是引进国外新技术进行本土化再创新,通过筛选、优化酶系统和荧光染料研制本土化的PCR-HRM检测反应体系,其检测性能接近国外商品化PCR-HRM检测反应体系(EvaGreen MasterMix)。引进消化吸收国外最新技术,再创新建立本土化高分辨熔解分析技术平台,尤其是对荧光染料和酶系统的最佳组合和搭配研究以及与无标记探针技术的结合。将HRM技术用于临床分子诊断,制定其质量控制措施是对传统昂贵的探针法提出挑战,孕育新一代廉价基因分型分子诊断试剂。 (4)技术的成熟程度、适用范围和安全性：基本成熟,适用基因突变检测和扫描。 (5)应用情况及存在问题：正在推广应用。

关键词：高分辨熔解技术无标记探针 PCR

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GATA4基因多态性与中国西北人群室间隔缺损的关联研究

GATA4基因多态性与中国西北人群室间隔缺损的关联研究

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作者：李静兰州大学

学位级别：硕士

研究背景：室间隔缺损(Ventricular septal defect, VSD)是先天性心脏缺损(Congenital heart defects, CHDs)中最为常见的一种类型,且具有较高的发病率。近来一些研究表明GATA4突变能够导致VSD。本研究旨在讨论GATA4基因中两个3’-非翻... 详细信息

研究背景：室间隔缺损(Ventricular septal defect, VSD)是先天性心脏缺损(Congenital heart defects, CHDs)中最为常见的一种类型,且具有较高的发病率。近来一些研究表明GATA4突变能够导致VSD。本研究旨在讨论GATA4基因中两个3’-非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphisms, SNPs)和中国西北人群中室间隔缺损的易感性之间的关系。方法：针对西北地区203例室间隔缺损患者和201例健康对照样本,我们使用无标记探针的方法对GATA4基因中的两个SNPs进行病例-对照研究。统计VSD病例组和对照组中每个位点基因型频率进行卡方检验并构建单倍型进行分析。结果：rs867858 (G/T)位点基因型分布频率中,与纯合G／G基因型相比,病例组杂合型G／T基因型能显著增加罹患VSD的风险[odds ratio(OR)=1.879,95% Confidence interval (95%CI):1.173-3.010, p=0.008]。rs904018 (A/G)位点纯合G／G基因型能降低患VSD的风险性(OR=0.491,95%CI:0.254-0.948, p=0.032),并且单个等位基因分析,rs904018位点G等位基因是一个弱的保护因素(OR=0.727,95%CI：0.540-0.979,p=0.036)。单倍型分析rs867858G/rs904018G存在能显著降低罹患室间隔缺损的几率(OR=0.748,95%CI:0.567-0.986, p=0.039)。结论：我们首次运用无标记探针的方法报道了GATA4基因中3’-非翻译区的基因多态性是中国人群室间隔缺损的致病因素,其结果表明GATA4基因的rs867858位点和rs904018位点与中国西北人群室间隔缺损相关。同时,运用无标记探针的方法进行基因分型是一种简单、快速和经济的方法。

关键词：先天性心脏缺损室间隔缺损 GATA4基因无标记探针基因多态性单倍型

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