检索结果-内蒙古大学图书馆

首都医科大学学报 2004年第2期25卷 159-161页

作者：孙丽翠王雅梅祁雅慧闫豫东张静宜首都医科大学实验中心

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有... 详细信息

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。

关键词：人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体构建噬斑筛选

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

含有Etp28基因昆虫杆状病毒表达载体的构建

引用

中山大学学报论丛 1996年第S1期16卷 170-174页

作者：杨林朱维何建国龙綮新曲士芮王珣章江静波谢明权吴惠贤谢宏料中山大学生命科学学院广州510275 广东省农业科学院兽医研究所

以含有柔嫩艾美耳球虫（广东株）子孢子折光体抗原Etp28基因的重组质粒pGEM－T－Etp28为材料，分别构建了可表达GST／6×His－Etp28融合蛋白和Etp28非融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体质粒pAcGHLT－A－Etp28和pSXIVVI＋X3-Etp28，并... 详细信息

以含有柔嫩艾美耳球虫（广东株）子孢子折光体抗原Etp28基因的重组质粒pGEM－T－Etp28为材料，分别构建了可表达GST／6×His－Etp28融合蛋白和Etp28非融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体质粒pAcGHLT－A－Etp28和pSXIVVI＋X3-Etp28，并探讨了两种重组转移载体质粒的特点和应用前景．

关键词：柔嫩艾美耳球虫 p28基因昆虫杆状病毒表达载体

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

H5亚型AIV HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因重组杆状病毒表达载体的构建及其表达

H5亚型AIV HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因重组杆状病毒表达载体的...

引用

作者：孔娜山东农业大学

学位级别：硕士

白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）是Okamura等（1995）从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等（2003）研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着... 详细信息

白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）是Okamura等（1995）从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等（2003）研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着畜牧业的发展,禽病特别是禽流感呈上升趋势,迫切需要新型疫苗与疫苗佐剂的研发,而禽流感病毒的主要抗原决定簇位于HA1基因,故HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。鉴于此,本实验室对鸡白介素18成熟蛋白基因（mature Chicken interleukin-18,mChIL-18）与HA1基因进行了真核双表达,旨在探索利用mChIL-18能促进机体免疫功能的特性,将其应用于禽流感的预防及临床治疗。本试验针对如何获得高效表达且具有生物学活性的mChIL-18蛋白这些问题进行了探讨,主要包括以下两部分: 试验一H5亚型AIV HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建参考GenBank上发表的H5亚型禽流感（AIV）血凝素（HA）基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白（mChIL-18）的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的两对引物。然后分别以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dual-HA1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。试验二H5亚型AIVHA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因在昆虫杆状病毒表达载体中的表达将试验一构建好的pFastBacTM dual-IL-18-HA1质粒转化DH10Bac感受态细胞,将转化混合物涂到LB琼脂平板上,用小量法从培养物中提取质粒DNA,在此基础上通过一对通用引物M13(该引物扩增重组质粒Bacmid LacZα互补区域内的mini-attTn7位点两端的片段,任何外源性基因片段插入pFastBacTM dual质粒内都会使PCR产物增大)进行PCR扩增,鉴定pFastBacTM dual-IL-18-HA1质粒克隆到杆状病毒表达载体,通过转染昆虫细胞sf9,收获重组杆状病毒,得到了共表达IL-18和HA1的高效表达产物。

关键词：禽流感病毒 HA1基因鸡白细胞介素18成熟蛋白基因昆虫杆状病毒表达载体真核表达

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

重组杆状病毒:一种新型哺乳动物细胞基因转移载体

引用

中国生物工程杂志 2007年第1期27卷 126-130页

作者：彭伍平仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

昆虫杆状病毒表达载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。近年来研究显示,含有哺乳动物细胞启动子元件的重组杆状病毒可有效地转导多种哺乳动物原代和传代细胞。借助于杆状病毒载体,已成功实现了外源基因在哺乳动物细胞内的瞬时或稳定表达... 详细信息

昆虫杆状病毒表达载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。近年来研究显示,含有哺乳动物细胞启动子元件的重组杆状病毒可有效地转导多种哺乳动物原代和传代细胞。借助于杆状病毒载体,已成功实现了外源基因在哺乳动物细胞内的瞬时或稳定表达。而在体内,杆状病毒可被血清中的补体成份所灭活,从而抑制了转导效率,但是通过对杆状病毒进行修饰(如伪型杆状病毒),可以抵抗补体的灭活作用,杆状病毒转导机制至今尚未完全弄清。杆状病毒基因转移系统的最大特点是,杆状病毒能在昆虫细胞内大量繁殖,而不能在哺乳动物细胞内复制,因而具有很高的生物安全性;同时,此系统还具有操作简便、插入外源基因容量大等优点,使得杆状病毒作为哺乳动物细胞的基因传递载体,具有广泛的应用前景。

关键词：昆虫杆状病毒表达载体非复制型载体基因转移哺乳动物细胞

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备

牛IL-18成熟蛋白基因的表达、生物学活性测定及其单克隆抗体的制备

引用

作者：田兆菊山东农业大学

学位级别：博士

白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是Okamura等(1995)从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等(2003)研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着奶牛业... 详细信息

白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是Okamura等(1995)从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等(2003)研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着奶牛业的发展,奶牛病特别是奶牛乳腺炎呈上升趋势,迫切需要新型疫苗与疫苗佐剂的研发。鉴于此,本实验室对牛白介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)进行了克隆表达,旨在探索利用BoIL-18能促进机体免疫功能的特性,将其应用于奶牛病的预防及临床治疗。本试验针对如何获得高效表达且具有生物学活性的BoIL-18蛋白及利用表达的蛋白如何制备BoIL-18单克隆抗体这些问题进行了探讨,主要包括以下四部分: 第一部分:牛IL-18成熟蛋白基因的原核表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,转化至大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21(DE3)感受态细胞中获得重组菌株,将该重组菌在IPTG的诱导下进行表达,用SDS-PAGE、Western blot分析表达情况;用谷胱甘肽琼脂糖(GST)亲和层析树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳分析获得了一条表达条带,分子量约为44KD,凝胶薄层扫描分析显示,表达的蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;生物学活性测定表明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对外周血单个核细胞(PBMC)有明显的增殖作用;BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强;BoIL-18融合蛋白诱导脾淋巴细胞产生的IFN-γ有抑制水泡性口炎病毒(VSV)产生细胞病变的作用,且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第二部分:牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫杆状病毒表达载体中的表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb中,构建重组转移载体质粒pFastBac HTb-BoIL18,将其转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid(Bacmid-BoIL18)。在转染试剂Cellfectin的作用下,将Bacmid-BoIL18转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后在不同时间收获sf9细胞及培养上清,应用SDS-PAGE电泳、Western blot分析表达情况;用Ni-NTA树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞sf9中获得了表达,表达的目的条带分子量为26KD,经薄层凝胶扫描分析证实,表达量占总蛋白的21.3%;生物学活性分析表明,BoIL-18蛋白浓度大于0.05 mg/L时,具有明显加强PBMC的增殖的作用;当其浓度大于0.10 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着BoIL-18蛋白浓度的增加,诱导产生IFN-γ的量随之增加;通过诱导牛脾细胞产生IFN-γ,间接地抑制VSV产生细胞病变, 且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第三部分:BoIL-18单克隆抗体的制备。本试验将第一部分中获得的BoIL-18的原核表达产物作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾与骨髓瘤细胞sp2/0在PEG的作用下进行融合;将第二部分中获得的BoIL-18在昆虫细胞sf9中的表达产物作为筛选抗原,利用间接ELISA方法反复筛选,应用有限稀释法进行多次克隆化后,最终获得了两株可分泌BoIL-18单克隆抗体的阳性细胞克隆。Western-blot证实,获得的单克隆抗体具有良好的特异性;间接ELISA试验检测单克隆抗体5G8和7B3的效价分别为1×105和1×106。对已经冻存的杂交瘤细胞株分别在第3月复苏,用间接ELISA检测杂交瘤细胞株的抗体效价不变,表明所获得的杂交瘤细胞株具有良好的稳定性。两株细胞克隆亚类均为IgG l。第四部分:牛IL-18成熟蛋白基因在家蚕幼虫中的表达。

关键词：牛白细胞介素-18 原核表达昆虫杆状病毒表达载体生物学活性测定单克隆抗体制备家蚕生物反应器

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

黄瓜（Cucumis sativus L.）酸性α-半乳糖苷酶的离体表达与酶学性质研究

黄瓜（Cucumis sativus L.）酸性α-半乳糖苷酶的离体表达与酶学...

引用

作者：张宗东扬州大学

学位级别：硕士

黄瓜(Cucumis sativus L.)以水苏糖作为体内同化物的主要运输形式,而α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是催化黄瓜体内水苏糖分解的关键酶。为研究黄瓜体内水苏糖卸出的分子机制,本实验室前期克隆了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的cDNA全长序... 详细信息

黄瓜(Cucumis sativus L.)以水苏糖作为体内同化物的主要运输形式,而α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是催化黄瓜体内水苏糖分解的关键酶。为研究黄瓜体内水苏糖卸出的分子机制,本实验室前期克隆了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的cDNA全长序列。为验证这2个基因克隆的正确性,研究它们的酶学性质,指导后续的分离纯化实验,探索它们在黄瓜水苏糖代谢中的生理功能,本实验采用昆虫杆状病毒表达载体系统离体表达了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因。为此,本实验设计了2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶基因的特异引物,运用聚合酶链式反应(PCR)技术,扩增其编码区序列,经连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选重组子,构建杆状病毒表达载体。利用野生型杆状病毒和表达载体共转染健康的昆虫细胞系Sf9,生产重组病毒,离体表达了2个待验证基因。经检测表明2个基因在昆虫细胞中的表达产物均具有酸性α-半乳糖苷酶活性,证明这2个基因确实为酸性α-半乳糖苷酶基因。进一步研究了离体表达的2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对人工底物pNPG的最佳反应pH值、最适反应温度、米氏常数(Km)、最大反应速度(Vm)、D-半乳糖对活性的抑制效应以及对水苏糖、棉籽糖的催化活性。结果表明:黄瓜α-半乳糖苷酶Ⅰ对pNPG的最佳反应pH值为4.8,最适反应温度为30℃,对pNPG的Km为8.99×10-4mol/L,Vm为3.34×10-2mol/L·min;黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅱ对pNPG的最佳反应pH值为6.1,最适反应温度为35-40℃,对pNPG的Km为1.35×10-3mol/L,Vm为3.36 mol/L·min。低浓度的D-半乳糖对2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶活性均具有显著的抑制作用。2种黄瓜酸性α-半乳糖苷酶对棉籽糖均具有较高的亲和性,对水苏糖的亲和性相对较低。

关键词：黄瓜酸性α-半乳糖苷酶昆虫杆状病毒表达载体 Km

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

人重组乙型干扰素的高效表达及其应用

人重组乙型干扰素的高效表达及其应用

引用

作者：秦莹 116001 辽宁省大连市民意街40号海景花园大厦25楼

本发明人重组乙型干扰素的高效表达及其应用涉及采用生物基因工程的方法在真核细胞系统中表达重组人乙型干扰素，以及重组人乙型干扰素的用途。本发明人重组乙型干扰素的高效表达系通过真核细胞表达载体来转化宿主细胞，使之生产重组人... 详细信息

标准号: CN1325651C

本发明人重组乙型干扰素的高效表达及其应用涉及采用生物基因工程的方法在真核细胞系统中表达重组人乙型干扰素，以及重组人乙型干扰素的用途。本发明人重组乙型干扰素的高效表达系通过真核细胞表达载体来转化宿主细胞，使之生产重组人乙型干扰素，所述真核细胞表达载体是昆虫杆状病毒表达载体时，所述宿主细胞是昆虫细胞；所述真核细胞表达载体是酵母菌表达载体时，所述宿主细胞是酵母菌。本发明利用具有糖基化功能的昆虫杆状病毒表达系统和酵母菌表达系统来表达人乙型干扰素基因，所表达和生产的蛋白量相对量大、纯度高。本发明中所描述的表达高产量重组人乙型干扰素的方法可以使临床应用所需要的重组蛋白药物的制备简单化和廉价化。

关键词：干扰素真核细胞重组人表达载体宿主细胞高效表达昆虫杆状病毒表达系统昆虫杆状病毒表达载体酵母菌酵母菌表达系统酵母菌表达载体生物基因工程重组蛋白药物干扰素基因昆虫细胞临床应用蛋白量高产量廉价化糖基化相对量转化

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：