检索结果-内蒙古大学图书馆

药学学报 2021年第6期56卷 1727-1738页

作者：陈赟解可波陈日道陈大伟刘继梅韩耀天刘雨雨戴均贵中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所中国医学科学院酶与天然药物生物催化重点实验室创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室卫健委天然药物生物合成重点实验室天然药物活性物质与功能国家重点实验室北京100050

新药研发过程中候选药物的体外代谢研究十分重要,肝微粒体等传统模型存在诸多不足,而重组人源药物代谢酶系体外模型因其来源便捷、活性稳定且成本较低等优势被认为是重要、有效的手段而获得广泛使用。本研究从人源肝脏cDNA中克隆得到6... 详细信息

新药研发过程中候选药物的体外代谢研究十分重要,肝微粒体等传统模型存在诸多不足,而重组人源药物代谢酶系体外模型因其来源便捷、活性稳定且成本较低等优势被认为是重要、有效的手段而获得广泛使用。本研究从人源肝脏cDNA中克隆得到6条人源葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)基因(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A9和2B7),并分别在酿酒酵母和杆状病毒侵染的昆虫细胞中进行外源表达。UGT1A1、1A3、1A6和1A9在酵母中成功表达,对多种不同结构类型的底物表现出葡萄糖醛酸化活性,但活性较低。以昆虫粉纹夜蛾Trichopolusia ni胚胎细胞系BTI-TN5B1-4(High Five)为宿主时,6条UGT基因均能成功表达,且活性明显高于前者。昆虫细胞表达的重组人源UGTs均能催化其特异性底物进行葡萄糖醛酸化,并首次实现了葡萄糖醛酸化产物的毫克级规模制备,产率为13%~66%,产物结构均经MS、1H NMR和13C NMR等波谱技术确定。上述结果表明,本研究构建的重组人源UGT酿酒酵母与昆虫细胞表达系统可用于新药研发早期阶段的体外代谢评价,同时为药物葡萄糖醛酸化代谢产物的合成提供了新方法。

关键词：人源葡萄糖醛酸转移酶杆状病毒侵染的昆虫细胞表达系统外源表达酶法合成药物代谢

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药物代谢相关人源葡萄糖醛酸转移酶表达系统的构建及应用

药物代谢相关人源葡萄糖醛酸转移酶表达系统的构建及应用

引用

作者：陈赟北京协和医学院

学位级别：硕士

药物体外代谢研究是新药研发过程中的重要组成部分,在新药的早期体外代谢评价中对候选药物进行药物代谢酶、药物-药物相互作用、药物代谢稳定性以及代谢物的活性和毒副作用等研究十分重要。重组人源药物代谢酶系体外模型将药物体外代谢... 详细信息

药物体外代谢研究是新药研发过程中的重要组成部分,在新药的早期体外代谢评价中对候选药物进行药物代谢酶、药物-药物相互作用、药物代谢稳定性以及代谢物的活性和毒副作用等研究十分重要。重组人源药物代谢酶系体外模型将药物体外代谢研究深入到分子水平,是传统的体外代谢模型如组织微粒体、细胞系等的有效补充或替代,因其来源便捷、活性稳定且成本较低,在国际上新药研发中得到广泛应用。葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)是Ⅱ相代谢过程中最主要的酶,在药物的体内代谢、解毒和清除中发挥重要作用。然而肝脏微粒体模型来源困难,且酶系复杂,难以进行单一酶亚型的相关研究。鉴此,本研究构建了酿酒酵母表达系统和杆状病毒侵染的昆虫细胞表达系统对肝脏中主要的7个人源UGT亚型进行外源表达,以多种底物鉴定其活性,并对其在药物代谢研究中的应用进行了探索,结果如下:1.药物代谢相关的人源UGT酵母表达系统的构建从人肝脏cDNA中克隆得到7个主要的UGT亚型基因(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A9、2B7和2B15),利用酿酒酵母INVScl成功表达了 4个人源UGTs(UGT1A1、1A3、1A6和1A9),对非特异性底物如香豆素类、蒽醌类、黄酮类以及简单酚类化合物表现出葡萄糖醛酸化活性。将表达的各UGT亚型的信号肽替换成在酵母中高表达的UGT1A7的信号肽之后,UGT1A1和1A9的葡萄糖醛酸化活性得到明显提高。2.药物代谢相关的人源UGT昆虫细胞表达系统的构建为获得更多具有活性或活性更高的重组人源UGTs,构建了杆状病毒侵染的昆虫细胞表达系统并以粉纹夜蛾Trichopolusia ni胚胎细胞系BTI-TN5B1-4(High Five)为宿主,成功表达了 7个高活性重组人源UGTs(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A9、2B7和2B15)。相比于酵母表达的重组UGTs,昆虫细胞表达的人源UGTs对于非特异性底物表现出更强的葡萄糖醛酸化活性,并且能高效催化各亚型的一种或多种探针底物的葡萄糖醛酸化,且具有各自的催化特点:UGT1A家族亚型偏好或选择性地作用于芳香底物的酚羟基;UGT2B7高效地催化羧酸类药物发生羧基糖酯化反应;UGT1A4特异性地催化叔胺类药物的N-葡萄糖醛酸化。因此,该系统表达的重组人源UGTs可作为人体UGTs的体外模型用于药物葡萄糖醛酸化代谢产物的酶法合成和新药体外代谢评价。3.利用重组人源UGT酶法合成药物葡萄糖醛酸化代谢产物首次利用昆虫细胞表达的重组人源UGTs(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A9、2B7)为生物催化剂,在最佳反应条件下实现了药物β-雌二醇、依替米贝、三氟拉嗪、5-羟色醇、霉酚酸、吉非罗奇对应的6个葡萄糖醛酸化代谢产物毫克级规模的酶法制备,产率为13-66%,并采用质谱和核磁共振波谱技术鉴定了代谢产物的结构,其中首次利用核磁共振波谱技术确定了三氟拉嗪-N-β-D-葡萄糖醛酸苷的结构。4.利用重组人源UGTs对新药体内代谢主要酶亚型进行了归属利用昆虫细胞表达的重组人源UGTs(UGT1A1、1A3、1A4、1A6、1A9、2B7和2B15)对新药IMM-H004和FLZ及其Ⅰ相代谢产物FLZ-M1进行体外代谢评价,对其体内代谢主要UGT亚型进行归属。结果显示参与IMM-H004体内代谢的主要肝脏UGT亚型为UGT1A1、1A3、1A4和1A9,共产生两个葡萄糖醛酸化代谢产物,推测可能分别为O-葡萄糖醛酸苷和N-葡萄糖醛酸苷;参与FLZ体内代谢的主要肝脏UGT亚型为UGT1A1、1A3和1A9,产生一个葡萄糖醛酸化代谢产物;参与FLZ-M1体内代谢的主要肝脏UGT亚型为UGT1A1、1A3、1A9和UGT2B7,共产生三个葡萄糖醛酸化代谢产物,并且各UGT亚型对FLZ-M1的催化具有区域偏好性。综上所述,本研究利用酿酒酵母和杆状病毒侵染的昆虫细胞对7个主要的人源肝脏UGT亚型进行外源表达,并验证其体外代谢活性。活性重组人源UGTs可作为人体内UGTs的体外模型用于药物的葡萄糖醛酸化代谢产物的酶法合成,或用于研究新药体内代谢的主要肝脏UGT亚型归属。此外,重组UGTs还可用于活性化合物的葡萄糖醛酸化结构修饰以发现新的候选化合物。两种表达系统还可用于其他药物代谢酶的表达,以构建完善的代谢酶模型体系用于新药的体外代谢研究。

关键词：人源葡萄糖醛酸转移酶酿酒酵母表达系统杆状病毒侵染的昆虫细胞表达系统外源表达酶法合成药物代谢

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