检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：闫洁华中科技大学

学位级别：硕士

人主要组织相容性抗原HLA I类分子广泛分布于几体内各种有核细胞表面，主要由重链（Hc）、轻链（Lc）与抗原肽非共价结合而成，可提呈特定的表位供特异性T细胞识别。利用HLA I类分子与单链抗体的融合可将特定的抗原肽／HLA复合物加载到... 详细信息

人主要组织相容性抗原HLA I类分子广泛分布于几体内各种有核细胞表面，主要由重链（Hc）、轻链（Lc）与抗原肽非共价结合而成，可提呈特定的表位供特异性T细胞识别。利用HLA I类分子与单链抗体的融合可将特定的抗原肽／HLA复合物加载到目的细胞表面，目前研究主要应用于加载HLA分子到肿瘤表面。cD35分子又名补体受体1（cRl），是一种单链膜结合蛋白，主要分布于红细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等细胞表面。利用几红细胞表面的cD35分子作为靶点，有可能通过HLA分子与cD35单链抗体的融合将HLA分子加载到红细胞表面，将其作为单一表位的抗原提呈细胞或者几工靶细胞。其中cD35单链抗体是由免疫球蛋白的重链可变区（vH）和轻链可变区（vL）通过一段链接肽连接而成的重组蛋白，具有分子量小，免疫原性低，半衰期短，穿透力强的优点。在本实验室的前期工作中已经成功构建HLA．A2／cD35scFv融合基因，但前期的研究结果显示原核表达的HLA．A2／cD35scFv融合蛋白由于其结构的复杂性，很难在体外正确复性，直接限制了HLA-A2／cD35scFv融合蛋白的获得与应用。本研究拟利用杆状病毒表达系统，通过双表达载体pFaStBaTMDua1在草地贪夜蛾卵巢细胞sf9中表达HLA-A2胞外段（a1，a2.a3区）和cD35单链抗体融合基因（HLA-A2／cD35scFv）及B2m基因，利用真核细胞的修饰体系，使HLA-A2／cD35scFv正确折叠，并通过离子交换层忻的方法进行纯化，以获得具有正确空间构象且纯度较高的HLA-A2／cD35scFv融合蛋白。主要实验内容和结果如下：一、pFastBacTMDual+[p2m+HLA-A2／cD35scFv]昆虫杆状病毒表达载体的构建。利用PCR技术从pET-28a+[HLA-A2／CD35scFvl中扩增HLA-A2／CD35scFv融合基因，并通过两端酶切位点（salI和Hindlll）插入pFastBacTMVDual启动子PH下游，构建形成pFaStBacTMDua1+[HLA-A2／cD35scFv]质粒。同样的方法从pET-22b+[B2m]质粒中以B2-微球蛋白的cDNA为模板进行扩增，获得的产物经（Sma I、Nhe I）双酶切后插入到pFastBacTMDual+[HLA-A2／cD35scFv]质粒中，获得pFastBacTMDual+[B2m+HLA-A2／CD35scFv]质粒。经酶切鉴定和测序分忻，昆虫杆状病毒表达载体构建成功。二、重组穿梭质粒的获得与鉴定，重组蛋白的表达、纯化与鉴定将重组质粒pFastBacTMDual+[p2m+HLA-A2／CD35scFv]转化*** DHl0BacTM，PCR鉴定结果显示穿梭载体Bacmid含B2m与HLA-A2／CD35scFv目的基因。提取鉴定正确的重组质粒Bacmid DNA，利用脂质体转染昆虫sf9细胞，收获转染后重组病毒用于sf9细胞扩增感染。病毒感染后的sf9细胞分泌重组蛋白到培养上清中，用仅与天然构象的HLAI类分子结合的单克隆抗体W6／32与抗几B2m抗体进行双抗夹心ELISA检测，证实获得具有正确空间构象的HLA-A2／CD35scFv融合蛋白。由pI/Mw批量计算器[expasy]得知，重组蛋白HLA-A2／CD35scFv的理论等电点（pI）为6.12，BSA的等电点（pI）为4.7，因此选择阴离子交换层忻的方法对收获的含融合蛋白上清进行纯化，利用W6／32与抗几B2m抗体进行双抗夹心ELISA检测到纯化后的蛋白浓度（14ug／m1），变性Western blotting显示分子量为70kD，与预期结果一致。HLA-A2／CD35scFv融合蛋白能够与红细胞表面CD35分子结合，但结合率较低，约为4.4％。本研究显示，昆虫杆状病毒表达载体系统可以有效的表达出具有空间构象的HLA-A2／CD35scFv重组蛋白，通过阴离子交换层忻的方法可以使含重组蛋白的培养上清有效纯化，且纯化后的融合蛋白与红细胞具有一定的结合能力。使HLA-A2／CD35scFv融合蛋白通过CD35分子作为靶点与红细胞有效结合成为可能，为以后制备几工抗原递呈细胞或者几工靶细胞奠定了基础。

关键词： HLA-A2/CD35scFv 单链抗体杆状病毒载体表达系统离子交换层忻

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猪流行性腹泻病毒串联表位亚单位疫苗的免疫原性

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华东理工大学学报（自然科学版） 2022年第5期48卷 624-630页

作者：杨灿灿吴诗璟张峒张元兴刘琴华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海海洋动物疫苗工程技术研究中心上海200237

将纤突蛋白S的COE区域(E1)、S1D区域(E2)、C末端区域(E3)以及膜蛋白M的M3区域(E4)设计成串联表位亚单位(EC),以报道的COE和S1亚单位作为对照,构建了不同亚单位疫苗的杆状病毒载体表达系统。杆状病毒载体表达系统生产的目标蛋白采用镍柱... 详细信息

将纤突蛋白S的COE区域(E1)、S1D区域(E2)、C末端区域(E3)以及膜蛋白M的M3区域(E4)设计成串联表位亚单位(EC),以报道的COE和S1亚单位作为对照,构建了不同亚单位疫苗的杆状病毒载体表达系统。杆状病毒载体表达系统生产的目标蛋白采用镍柱亲和层析进行纯化。在BALB/c小鼠上,不同亚单位疫苗的免疫原性初步评价结果表明,EC、COE和S1序列分别成功插入杆状病毒基因组,EC、COE和S1蛋白均能在Sf9细胞中分泌表达,但是纯化条件依蛋白不同而有差异。与COE和S1亚单位疫苗相比,EC亚单位疫苗能激发小鼠产生更多的特异性免疫球蛋白IgG、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。结果表明,各个亚单位疫苗均能激发小鼠的体液免疫与细胞免疫,与COE和S1亚单位疫苗相比,EC亚单位疫苗能更好地激发小鼠的体液免疫与细胞免疫。

关键词：猪流行性腹泻病毒串联表位亚单位疫苗杆状病毒载体表达系统

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重组杆状病毒感染悬浮昆虫细胞及重组蛋白表达策略的优化

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河南农业科学 2018年第8期47卷 118-122页

作者：李文丽刘霞刘在新卢曾军范朋举甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为确定嵌合口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白在昆虫细胞(Sf-9)中的最佳表达条件。通过对比悬浮培养和贴壁培养2种培养条件,探究Sf-9细胞的最佳培养方式;利用血球计数板每隔24 h进行细胞计数,绘制Sf-9细胞生长曲线;将P... 详细信息

为确定嵌合口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白在昆虫细胞(Sf-9)中的最佳表达条件。通过对比悬浮培养和贴壁培养2种培养条件,探究Sf-9细胞的最佳培养方式;利用血球计数板每隔24 h进行细胞计数,绘制Sf-9细胞生长曲线;将P1代重组病毒传代至P3代,提取重组病毒基因组DNA,进行PCR鉴定,检测插入目的基因的完整性;通过研究感染复数(MOI)和感染时间的关系来摸索重组病毒最佳感染条件,以获得高滴度的重组病毒;利用Western blot检测目的蛋白的表达量并探究重组蛋白的最佳表达条件。结果表明,悬浮培养的Sf-9细胞大小均一、边缘整齐,生长状态良好;PCR鉴定结果表明,插入的FMDV中和表位基因完整,可以进行重组蛋白的表达;Western blot结果显示,重组蛋白同时与FMDV阳性血清和PPV阳性血清产生特异性反应,进一步证明了插入的FMDV中和表位的存在;重组蛋白最佳表达条件是以10个MOI病毒液感染悬浮Sf-9细胞,在72 h时重组蛋白表达量最大。

关键词：口蹄疫病毒猪细小病毒中和表位杆状病毒载体表达系统昆虫细胞

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猪流行性腹泻病毒蛋白疫苗的设计、制备与评价

猪流行性腹泻病毒蛋白疫苗的设计、制备与评价

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作者：杨灿灿华东理工大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可感染不同年龄的猪,引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED),给世界各国的养猪产业带来了惨重的经济损失。目前没有针对PEDV的有效治疗药物,疫苗接种是其关键的防治... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可感染不同年龄的猪,引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED),给世界各国的养猪产业带来了惨重的经济损失。目前没有针对PEDV的有效治疗药物,疫苗接种是其关键的防治手段。本研究针对PEDV开展了亚单位疫苗的设计与分子构建、制备工艺建立与免疫评价工作,同时也开展了 PEDV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗的初步探索。(1)本研究根据PEDV抗原表位的研究,设计了表位串联的亚单位疫苗并构建了杆状病毒表达体系。选择了纤突蛋白S的COE区域(E1)、S1D区域(E2)、C末端区域(E3),以及膜蛋白M的M3区域(E4),将上述抗原表位通过Linker串联在一起组成串联表位疫苗(EC)。同时将研究较多的COE区域和S1区域分别作为对照形式的亚单位疫苗。分别将EC、COE、S1片段分别插入杆状病毒载体中,用不同重组杆状病毒载体转染Sf9细胞获取目标重组杆状病毒,并进行了初步表达测试,结果证实各个蛋白能在Sf9细胞中分泌表达。(2)本研究在杆状病毒表达体系下,建立了 PEDV亚单位疫苗的制备工艺。首先,对比了不同的感染复数(Multiple ofinfection,MOI)和感染时间(Time ofinfection,TOI)对各个目标蛋白表达水平的影响,确定了最佳的表达条件。接着,用镍柱亲和层析的方式纯化各个目标蛋白,探索目标蛋白的最佳洗脱条件。结果证实EC蛋白和COE蛋白在MOI为0.5～1和TOI为4～5 d的条件下表达水平较高,S1蛋白在MOI为1～5和TOI为2d的条件下表达水平较高。大部分EC蛋白可在50mmol/L咪唑的条件下被洗脱,大部分COE蛋白可在10 mmol/L咪唑的条件下被洗脱,大部分S1蛋白可在50 mmol/L和100mmol/L咪唑的条件下被洗脱。在8L表达体系下,EC、COE和S1蛋白的产量分别达到 0.5 mg/L,1.7 mg/L 和 2.8 mg/L。(3)本研究在BALB/c小鼠上对不同亚单位疫苗进行了免疫效果评价。结果证实以铝胶为佐剂时,亚单位疫苗EC激发小鼠产生更高水平的特异性抗体IgG以及免疫相关细胞因子IFN-γ和TNF-α。接着,比较了不同佐剂下S1亚单位疫苗的免疫效果,结果证实添加ISA 61 VG矿物油佐剂与Poly(I:C)免疫增强剂组合的S1亚单位疫苗激发小鼠产生更高水平的特异性抗体IgG以及免疫相关细胞因子IFN-γ和TNF-α。(4)本研究开展了 PEDV VLPs疫苗的初步探索。首先从用于杆状病毒载体表达系统(Baculovirus expression vector systems,BEVS)的启动子中筛选出 pSeL120、p10 和actin3三个启动子,并用上述启动子分别启动纤突蛋白S、膜蛋白M和包膜蛋白E基因的表达。接着将上述基因序列构建到杆状病毒基因组中,用制备的重组杆状病毒感染Sf9细胞以制备PEDVVLPs。结果证明S、M和E蛋白可以在Sf9细胞中表达,并自发组成VLPs。但VLPs产量较低,还需在提高产量上做出努力。在本研究中,证实了串联表位疫苗EC能更好的激发小鼠的体液免疫和细胞免疫应答,具有作为PEDV亚单位疫苗的潜力,ISA 61 VG矿物油佐剂与Poly(I:C)免疫增强剂组合有更好的免疫增强效果,具有作为PEDV疫苗佐剂的价值。本研究对PEDV亚单位疫苗开发有一定的参考价值。

关键词：猪流行性腹泻病毒杆状病毒载体表达系统亚单位疫苗病毒样颗粒免疫评价

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猪传染性胃肠炎病毒S基因片段的表达及鉴定

猪传染性胃肠炎病毒S基因片段的表达及鉴定

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作者：李森南阳师范学院

学位级别：硕士

猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的猪的一种以腹泻、呕吐、脱水等为主要症状的高度接触性消化道传染病,对两周龄以内的仔... 详细信息

猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的猪的一种以腹泻、呕吐、脱水等为主要症状的高度接触性消化道传染病,对两周龄以内的仔猪致死率可达100%,给全球养猪业造成了巨大危害。在TGEV基因组中,ORF2编码的S蛋白携带有主要的B细胞抗原识别决定簇,经研究证实S蛋白N端的543个氨基酸残基内含有A、B、C、D四个抗原位点,是唯一能诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白。因此,S蛋白的表达对TGEV基因工程疫苗和疾病诊断试剂的研制具有重要意义。本研究根据已发表的TGEVS基因cDNA序列,设计并合成了3对特异性引物,通过PCR扩增得到4个含有不同抗原位点的S基因片段：含D位点的S2基因,含A位点的S3基因,含A和D位点的S(2+3)基因以及含有A、B、C和D位点的Sfull基因。将S基因分别克隆到pMD19-Tsimple载体并进行测序鉴定。用DNA　star软件将测序结果中不同S基因与Genebank中收录的TGEV　S基因参考序列相比较,其核苷酸同源性为100%。将测序验证正确的S基因的不同片段分别克隆到杆状病毒转移载体pFBDMY-IM中,随后将获得的阳性重组转移载体通过Tn7转座重组至杆状病毒Bacmid中,然后将重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞获得重组病毒。将重组病毒感染Sf9昆虫细胞,72小时后用荧光显微镜进行观察,发现Sf9细胞出现明显的细胞病理变化和红色荧光,说明重组杆状病毒已经成功构建。提取重组杆状病毒基因组DNA并用TGEV S基因的特异性引物进行PCR鉴定,结果证实TGEV S基因已经成功重组至杆状病毒基因组中。用SDS-PAGE和Western Blot分析蛋白表达产物,结果表明：S2、S3、Sfull基因在杆状病毒表达系统中成功得到表达,表达的重组蛋白大小分别为25.9 KDa、27.5KDa和85.1KDa;S(2+3)基因在杆状病毒表达系统中没有表达。因此,本研究将含不同抗原位点的S基因片段在杆状病毒表达系统中进行表达,为以后利用S蛋白开发TGEV基因工程疫苗和疾病诊断试剂奠定了基础。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒杆状病毒载体表达系统荧光报告系统 S蛋白表达

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昆虫杆状病毒在生物技术研究中的应用

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常熟高专学报 2001年第4期15卷 52-58页

作者：郭锡杰吴友良中国农业科学院蚕业研究所江苏镇江212018 常熟高等专科学校江苏常熟215500

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入 ,昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体 ,在昆虫细胞和虫体内表达外源基因 ,形成了昆虫杆状病毒载体表达系统 ,利用杆状病毒携带外源基因 ,通过同源重组将外源基... 详细信息

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入 ,昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体 ,在昆虫细胞和虫体内表达外源基因 ,形成了昆虫杆状病毒载体表达系统 ,利用杆状病毒携带外源基因 ,通过同源重组将外源基因导入到家蚕的基因组构建了转基因家蚕 ;通过向杆状病毒基因组中插入毒素、激素、酶抑制剂等的基因或从杆状病毒基因组中删除某个基因 ,或通过不同杆状病毒间的杂交 ,使子代病毒的宿主域扩大 ,从而提高了杆状病毒作为生物杀虫剂的杀虫效果。

关键词：昆虫杆状病毒生物技术杆状病毒载体表达系统杆状病毒杀虫剂基因表达应用

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无血清悬浮培养昆虫细胞表达人纤溶酶原Kringle5的研究

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汕头大学医学院学报 2006年第1期19卷 1-5页

作者：刘戈飞黄东阳汕头大学医学院分子生物学中心广东汕头515041

目的:使用杆状病毒载体表达系统在无血清悬浮培养的条件下进行Kringle5的表达。方法:对草地夜蛾卵巢细胞(Sf9)进行无血清培养驯化。构建Kringle5重组杆状病毒,通过三级扩增的方法制备重组病毒贮存液。Western方法确定Krin-gle5在Sf9细... 详细信息

目的:使用杆状病毒载体表达系统在无血清悬浮培养的条件下进行Kringle5的表达。方法:对草地夜蛾卵巢细胞(Sf9)进行无血清培养驯化。构建Kringle5重组杆状病毒,通过三级扩增的方法制备重组病毒贮存液。Western方法确定Krin-gle5在Sf9细胞中的表达形式和表达条件。在培养体积为500 mL的无血清悬浮培养条件下对Kringle5进行表达。应用Ni2+亲合层析纯化了表达的重组蛋白,去除了氨基端融合的His-tag。应用原代培养人脐静脉内皮细胞测定了重组Kringle5的活性。结果:重组Kringle5蛋白的产量为1.7 mg/L,半数有效剂量(ED50)为109.2 nmol/L,去除氨基端His-tag序列后获得的Kringle5ED50为59.59 nmol/L。结论:Kringle5可以在无血清悬浮培养Sf9细胞中进行高效表达,研究结果为进行Kringle5的大规模高效表达奠定了基础。

关键词：无血清培养昆虫细胞杆状病毒载体表达系统 Kringle5

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重组人干细胞因子在家蚕培养细胞和虫体内表达

重组人干细胞因子在家蚕培养细胞和虫体内表达

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中国蚕学会第三届青年学术研讨会暨浙江省第二届青年学术论坛—蚕桑分论坛

作者：郭锡杰金勇丰杨明观张耀洲中国农业科学院蚕业研究所浙江大学生物化学研究所浙江大学动物科学学院浙江大学生物化学研究所

将人干细胞因子(hSCF)cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacSCF,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒(BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hSCF基因的重组病毒.Dot blotting杂交表明重组病毒基因组中含有hSCF基因片... 详细信息

将人干细胞因子(hSCF)cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacSCF,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒(BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hSCF基因的重组病毒.Dot blotting杂交表明重组病毒基因组中含有hSCF基因片段,RNA斑点杂交表明hSCF基因得到了转录.重组病毒感染BmN细胞株、家蚕幼虫,在细胞抽提物、幼虫的体液样品中,SDS-PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带:采用MTT法和TF-1细胞株测定SCF与白细胞介素3的协同作用,表明hSCF基因分别在培养细胞和蚕体内得到了表达.

关键词：人干细胞因子杆状病毒载体表达系统家蚕细胞与虫体表达

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猪瘟E2亚单位疫苗及其应用

猪瘟E2亚单位疫苗及其应用

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作者：石艳丽张国庆刘长辉周景云刘培培王贵华赵亚荣 100098 北京市海淀区杏石口路西杉创意园四区(益园文创基地C区)8号楼

本发明提供一种猪瘟E2亚单位疫苗及其制备方法，具体为：利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组猪瘟E2蛋白，研制出具有良好免疫效果的猪瘟E2亚单位疫苗。采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac Baculovirus Expressio... 详细信息

标准号: CN106139139A

本发明提供一种猪瘟E2亚单位疫苗及其制备方法，具体为：利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组猪瘟E2蛋白，研制出具有良好免疫效果的猪瘟E2亚单位疫苗。采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac Baculovirus Expression System)表达猪瘟病毒E2蛋白。猪瘟病毒E2蛋白与佐剂201R乳化制成一种新型亚单位疫苗，通过仔猪免疫攻毒试验，验证该亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用。

关键词：亚单位疫苗猪瘟病毒猪瘟杆状病毒载体表达系统杆状病毒表达系统免疫保护作用猪瘟E2蛋白昆虫细胞免疫效果仔猪佐剂乳化制备验证试验

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猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法

猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法

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作者：张许科孙进忠乔荣岑 471000 河南省洛阳市洛南新区政和路15号

本发明的主要目的在于提供一种PCV2亚单位疫苗及其制备方法，具体地说是，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗。采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac Baculovirus E... 详细信息

标准号: CN101884787A

本发明的主要目的在于提供一种PCV2亚单位疫苗及其制备方法，具体地说是，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗。采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionSystem)对猪圆环病毒2型的ORF2基因进行全基因扩增，并在5′端引入蜂毒素信号肽核苷酸序列，构建含有蜂毒素信号肽核苷酸序列和PCV2ORF2基因序列的开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达出具有高效良好PCV2抗原性的重组ORF2蛋白，制备成含有PCV2重组ORF2蛋白的亚单位疫苗。通过仔猪攻毒试验，验证该亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用。

关键词：亚单位疫苗核苷酸序列蛋白蜂毒素信号肽杆状病毒载体表达系统杆状病毒表达系统猪圆环病毒2型感染昆虫细胞免疫保护作用重组杆状病毒基因序列开放阅读昆虫细胞免疫效果制备方法基因仔猪抗原扩增验证试验研制

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