检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2017年第7期37卷 1225-1233页

作者：闫飞虎赵梓淇王化磊赵永坤邱泊宁王建忠王铁成黄耕高玉伟冯娜杨松涛夏咸柱军事医学科学院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 吉林大学动物医学学院吉林长春130062 河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了构建具有天然构象的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒,本试验扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分别克隆至双启动子载体pFastBac^(TM) Dual中,构建含有双目的基因的重组供体质粒pFastBac^(TM) Dual-2M、pFastBac^(TM) Dual... 详细信息

为了构建具有天然构象的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒,本试验扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分别克隆至双启动子载体pFastBac^(TM) Dual中,构建含有双目的基因的重组供体质粒pFastBac^(TM) Dual-2M、pFastBac^(TM) Dual-2F和pFastBac^(TM) Dual-2H;测序正确后转化至DH10Bac^(TM) 感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-2M、rBacmid-2F和rBacmid-2H;将其分别转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒rpFB-2M、rpFB-2F和rpFB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38 000,59 000,68 000左右的条带,表明基质膜蛋白与2种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。本试验为后续小反刍兽疫病毒(PPRV)病毒样颗粒疫苗的进一步研发奠定了基础。

关键词：小反刍兽疫病毒基质膜蛋白血凝素蛋白融合蛋白杆状病毒-昆虫细胞表达系统

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人源化氨基端脂多糖结合蛋白（NH－LBP）基因工程抗体的构建及其生物学活性研究

人源化氨基端脂多糖结合蛋白（NH－LBP）基因工程抗体的构建及其...

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作者：王长松第三军医大学

学位级别：博士

背景: 内毒素血症（endotoxemia）是临床创（烧）伤病人最常见的并发症之一。LPS是G-细菌细胞壁外膜的主要成分,当细菌死亡时LPS释放入血,由肝细胞产生的LBP将其传递给靶细胞膜上的CD14（mCD14）或血液循环中的可溶性CD14（sCD14）,... 详细信息

背景: 内毒素血症（endotoxemia）是临床创（烧）伤病人最常见的并发症之一。LPS是G-细菌细胞壁外膜的主要成分,当细菌死亡时LPS释放入血,由肝细胞产生的LBP将其传递给靶细胞膜上的CD14（mCD14）或血液循环中的可溶性CD14（sCD14）,三者形成LPS/LBP/CD14三联复合体,再经过TLR4-MD2-MYD88跨膜受体识别复合物向靶细胞内传递信号,促使胞浆内的NF-κB易位至胞核,导致一系列转录因子的活化,进而释放大量炎性介质和细胞因子,诱发全身炎症反应综合征（SystematicInflammatory Response Syndrome,SIRS）、多器官功能不全综合征（Multiple OrganDysfunction Syndrome,MODS）。在生理状态下循环血液中只有5—10μg/ml的LBP,在内毒素血症时LBP的浓度可以增高10倍左右,低浓度的LBP可将LPS与CD14的结合放大3-4个数量级。经定点突变以及LBP衍生肽的竞争性抑制研究,提示LBP结合LPS的位点定位于LBP氨基末端部分的第91-100位氨基酸残基。因此推测阻断LBP与LPS的结合有可能中断或减弱LPS活化靶细胞的效应,能够阻断这种保留与LPS结合序列的截断型人氨基末端LBP（NH-Lipopolysaccharide bmdmg protein,NH-LBP）的抗体对全长LBP可能具有同样的阻断效应。目前针对拮抗LBP的研究如动物源性的单克隆抗体,小分子多肽等还处于实验室阶段,研究结果显示动物源性的抗体存在以下局限性:制备工艺复杂,难以大量生产;杂交瘤细胞的稳定性较差;容易产生人抗鼠抗体（HAMA）;难以制备融合蛋白等。全长抗体由于分子量较大,在组织内的渗透性较差,从血液循环中清除速度慢。近年来随着分子生物学和分子免疫学的迅速发展出现了基因工程抗体,使人们得以对动物源性的单克隆抗体进行改造,构建人鼠嵌合抗体或全人源化抗体,而且抗体的形式也多样化如scFv,dsFv,双功能抗体,Fab',Fab'2和miniantibody等。基因工程抗体既可从杂交瘤细胞中制备,也可从未经免疫的脾淋巴细胞或人外周血单核细胞中产生:可

关键词：杆状病毒-昆虫细胞表达系统人源化氨基末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP) 脂多糖结合蛋白基因工程抗体单链抗体核糖体展示嗜甲醇毕赤酵母细胞生物学活性

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中华蜜蜂、意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A<,2>和透明质酸酶基因的克隆与表达

中华蜜蜂、意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A<,2>和透明质酸酶基因的克隆与...

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作者：沈立荣浙江大学

学位级别：博士

蜜蜂蜂毒（honeybeevenomorBv,下称蜂毒）是重要的蜂产品和古今中外应用广泛的天然药物,具有重要的开发利用价值.蜂毒磷酸脂酶A<,2>（BvPLA<,2>）和透明质酸酶（BvHya）是蜜蜂蜂毒的2个主要功能性蛋白,是... 详细信息

蜜蜂蜂毒（honeybeevenomorBv,下称蜂毒）是重要的蜂产品和古今中外应用广泛的天然药物,具有重要的开发利用价值.蜂毒磷酸脂酶A<,2>（BvPLA<,2>）和透明质酸酶（BvHya）是蜜蜂蜂毒的2个主要功能性蛋白,是医学、细胞分子生物学研究等方面具有重要价值的有效药用成分和工具酶,也是具有杀虫和抗菌作用的生物活性成分.该论文开避孕药了中华蜜蜂（***,中蜂）、意大利蜜蜂（Apismellifera,意蜂）蜂毒磷酸脂酶A<,2>和透明质酸酶基因的克隆与表达研究.

关键词：中华蜜蜂意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A 透明质酸酶核苷酸序列基因表达杆状病毒-昆虫细胞表达系统大肠杆菌表达系统

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猪圆环病毒2型遗传变异分析及Cap蛋白真核表达和免疫原性分析

猪圆环病毒2型遗传变异分析及Cap蛋白真核表达和免疫原性分析

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作者：赵云环河北农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是已知感染哺乳动物最小的DNA病毒,主要引起猪圆环病毒相关疾病,导致患病猪免疫系统产生高度免疫抑制,继而引发其他病毒和细菌的感染。PCV2基因组进化速率惊人,自1998年发现以来PCV2已进... 详细信息

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是已知感染哺乳动物最小的DNA病毒,主要引起猪圆环病毒相关疾病,导致患病猪免疫系统产生高度免疫抑制,继而引发其他病毒和细菌的感染。PCV2基因组进化速率惊人,自1998年发现以来PCV2已进化出了 PCV2a～PCV2h 8种不同基因亚型,这给PCV2的防控带来极大阻碍。由于目前国内外的商品化疫苗主要是基于PCV2a和PCV2b基因型研发的,无法满足当前PCV2基因亚型多样性的防控需求,因此了解当前本地区PCV2的流行趋势并针对该趋势制定防控措施,对我国PCV2疫情防控具有极其重要的意义。本研究首先对河北省部分地区PCV2的流行情况进行调查,发现各地区均存在PCV2阳性感染情况,阳性感染率约为29.6%。将检测为阳性的PCV2毒株进一步筛选,经PK-15细胞对PCV2感染毒株进行分离,并通过对感染的细胞病毒液进行PCR鉴定、间接免疫荧光鉴定、透射电镜观察等,确定分离毒株的病毒粒子为PCV2,并将其命名为CH/HB/XT01。同时对所有阳性样品进行全基因组测序,共获得12条全基因组序列,通过遗传变异分析发现其分别属于PCV2a、PCV2b和PCV2d分支,其中7株属于PCV2d基因亚型;随后对其高变异区ORF2基因进行核苷酸及氨基酸序列分析,发现其抗原表位区存在多处氨基酸突变位点及基因重组事件。以上结果证实PCV2具有较高的进化速率,且由于流行毒株之间基因型的不同,造成了宿主免疫力或毒株致病性的改变,致使PCV2仍在猪群中流行。 PCV2 ORF2基因编码PCV2最具免疫原性的衣壳蛋白,该蛋白是开发PCV2基因重组疫苗的主要目的基因。本研究根据对当前河北省部分地区PCV2的遗传变异分析,确定当前流行毒株为PCV2d基因亚型,由此利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统构建了针对PCV2d Cap蛋白的病毒样颗粒疫苗。首先对PCV2d Cap基因组序列进行扩增纯化,将其克隆至pFastBac1载体后转化至DH10Bac感受态细胞以获得重组Bacmid载体,经无内毒素质粒提取试剂盒提取获得重组杆粒,将鉴定正确的重组杆粒转染至Sf9细胞,对转染后的细胞进行病变观察、间接免疫荧光鉴定及透射电镜观察,结果显示重组杆粒成功转染至Sf9细胞,并在细胞内完成正确折叠并进行自我组装形成完整的病毒样颗粒。随后经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定,表明重组杆粒Bacmid-dCap可在Sf9细胞内正确表达。由于重组蛋白表达与外界因素如重组杆状病毒的MOI、接种时间等有关,本研究探究了重组蛋白的最佳表达条件,将获得的重组杆状病毒以不同的MOI接种Sf9细胞后,重组蛋白均获得有效表达,但最佳的攻毒量MOI为1;设定不同时间收获重组杆状病毒,发现在72 h左右收获重组蛋白其目的蛋白表达量最高。为了进一步验证本研究制备的重组杆状病毒是否可以诱导机体产生强大的免疫保护,将最优条件下获得的目的蛋白病毒样颗粒以肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验进行免疫原性分析,结果显示本研究制备的重组杆状病毒免疫后14 d即有PCV2特异性抗体产生,免疫后28 d抗体水平趋于平稳;以不同浓度的PCV2病毒液刺激分离的脾淋巴细胞可观察到经重组杆状病毒免疫的脾淋巴细胞产生了显著的增殖,表明本研究制备的PCV2 VLPs可诱导小鼠产生高水平高特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答,为PCV2防控提供技术支持。

关键词：猪圆环病毒2型分离鉴定遗传进化分析病毒样颗粒杆状病毒-昆虫细胞表达系统免疫原性

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人乳头瘤病毒16型的衣壳蛋白L2的颗粒组装和截短表达纯化及性质鉴定

人乳头瘤病毒16型的衣壳蛋白L2的颗粒组装和截短表达纯化及性质鉴...

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作者：姚巧缤厦门大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses,HPV)属于乳头瘤病毒科、乳头瘤病毒属,是一类具有蛋白衣壳的双链DNA病毒。HPV病毒可分为200多个亚型,高危型HPV的感染将大大增加女性罹患宫颈癌的概率。宫颈癌号称女性第二大杀手,仅次于乳腺癌对... 详细信息

人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses,HPV)属于乳头瘤病毒科、乳头瘤病毒属,是一类具有蛋白衣壳的双链DNA病毒。HPV病毒可分为200多个亚型,高危型HPV的感染将大大增加女性罹患宫颈癌的概率。宫颈癌号称女性第二大杀手,仅次于乳腺癌对女性的杀伤力。另外,HPV的感染也可能导致生殖器癌、口腔癌、咽喉癌,及生殖器疣等疾病的产生。L1蛋白HPV病毒上的主要衣壳蛋白,占HPV衣壳蛋白总比例的80%至90%,能自组装成类病毒颗粒,具有良好的免疫原性。现上市的HPV疫苗均以L1的类病毒颗粒为基础研制。但L1蛋白具有较强的型别特异性,对研发广谱的HPV疫苗造成了一定的困难。L2蛋白是HPV病毒上的次要衣壳蛋白,与病毒感染、入核、以及成熟后组装等过程有关。L2蛋白上含有HPV的广谱综合表位,且型别特异性较小,具有诱导机体产生交叉综合抗体、提供交叉保护的潜能。因此,解析L2蛋白的结构对更深入地研究HPV的感染机制以及研发HPV的广谱疫苗具有重要的意义。为了研究L2的结构与功能,本研究首先开展了在杆状系统中表达L1与L2相互作用的VLPs的工作。分别通过共感染与共表达路径进行表达,此时的L1与L2蛋白上均不含相互作用位点。经鉴定,两条路径表达的VLPs均由L1蛋白组成,未鉴定到L2蛋白的存在。通过细胞沉淀中的包涵体鉴定发现,L2蛋白存在于包涵体中。由此能够推论:L1、L2蛋白在昆虫细胞中同时表达后,未能有效相互作用。后续本研究在L1与L2上分别引入了半胱氨酸点突变,期望两个半胱氨酸位点能形成二硫键,增强相互作用。随后将蛋白L1-Q317C与L2-E338C同时表达,结果显示,在共感染路径表达的VLPs中,可检测到L2蛋白,但含量极少。本研究继续通过HPLC比较了不同VLPs的出峰时间并推论出,发现颗粒中L2的含量虽少,却能增大VLPs的直径。相互作用位点的引入是具有一定的效果。免疫原性评价的结果显示,此VLPs的免疫未能诱发小鼠体内产生高滴度的L2中和抗体。这可能与L2在HPV大部分的生命周期中均存在于五聚体内部、极少暴露中和位点有关。由于上述获得的VLPs并不均一,不利于冷冻电镜结构解析,本研究进行了L1与L2蛋白相互作用的五聚体的表达工作。经SDS-PAGE/WB/HPLC/TEM鉴定后,确认可在杆状系统中表达经175位与428位双点突变的16L1蛋白,且此蛋白具有自组装形成HPV-L1五聚体的能力。除了L2-E338C,我们根据本实验室其他课题方向的研究结果,在L2蛋白上引入了新的突变位点——T421C,以期能更好地加强L1与L2蛋白的相互作用。但从鉴定结果发现,旧相互作用位点与新相互作用位点的作用效果均不明显,共表达L1与L2形成的五聚体中不含L2蛋白。第三部分,本研究通过截短表达L2部分功能域蛋白。第一轮截短后,本研究首先通过Co柱对截短的L2蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,洗脱样品中杂蛋白含量太高,难以用于结构解析及疫苗生产。本研究继续尝试第二轮的L2蛋白的截短,使用不同的载体和截短长度,最后用Co柱对其中六个截短蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,L2-140-340蛋白具有最佳的纯化效果,洗脱样品中杂蛋白较少,L2含量很高,纯度较高,可能以三聚体或单体的形式存在。后续将继续研究该截短L2蛋白的生物性质和活性,获得均一的L2蛋白用于结晶和结构解析。

关键词：人乳头瘤病毒(HPV) 次要衣壳蛋白L2 杆状病毒-昆虫细胞表达系统相互作用 L2截短蛋白

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小型猪与人CYP3A重组酶的体外表达和代谢特性比较

小型猪与人CYP3A重组酶的体外表达和代谢特性比较

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作者：边诣聪浙江大学

学位级别：硕士

目的：表达小型猪细胞色素CYP3A22、CYP3A29、CYP3A46和人细胞色素CYP3A4、CYP3A5重组酶,通过比较人CYP3A4、CYP3A5和小型猪CYP3A22、 CYP3A29、CYP3A46对经典底物睾酮、咪达唑仑和硝苯地平的代谢和抑制特性,考察小型猪与人CYP3A酶的代... 详细信息

目的：表达小型猪细胞色素CYP3A22、CYP3A29、CYP3A46和人细胞色素CYP3A4、CYP3A5重组酶,通过比较人CYP3A4、CYP3A5和小型猪CYP3A22、 CYP3A29、CYP3A46对经典底物睾酮、咪达唑仑和硝苯地平的代谢和抑制特性,考察小型猪与人CYP3A酶的代谢相似性和差异,为小型猪作为药物代谢动物模型提供依据。方法：采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统构建人和小型猪CYP3A重组杆状病毒；将CYP3A4、CYP3A5、CYP3A22、CYP3A29和CYP3A46重组杆状病毒与含细胞色素氧化还原酶(POR)和细胞色素b5(Cyt b5)的重组病毒共同感染Sf9细胞,得到上述CYP3A各亚型、POR和Cytb5共表达的重组蛋白；通过体外孵育实验考察人和小型猪CYP3A重组酶对睾酮、咪达唑仑和硝苯地平等经典底物的代谢情况；考察经典抑制剂酮康唑对人与小型猪CYP3A酶代谢经典底物的抑制能力。采用HPLC或HPLC-MS/MS法检测孵育样品中底物及其代谢物的浓度。结果：成功表达了人CYP3A4、CYP3A5和小型猪CYP3A22、CYP3A29、CYP3A46重组酶,这些重组酶对人CYP3A经典底物的代谢能力以及受经典抑制剂抑制的情况均较为相似。CYP3A4、CYP3A5、CYP3A22、CYP3A29和CYP3A46催化睾酮生成6p-羟基睾酮的米氏常数Km分别为135.7±9.3、188.5±24.8、86.5±4.8、97.6+4.8和184.8±15.5μM,最大反应速率Vmax分别为7.39±0.16、1.56±0.07、3.49±0.05、6.23±0.09和0.914±0.03nmol/min/nmol P450,内在清除率CLint分别为54.5±2.8、8.3±0.8、40.4±1.8、63.8±2.4和4.95±0.29μL/min/nmol P450;催化咪达唑仑生成1-羟基咪达唑仑的米氏常数Km分别为3.27±0.16、6.14±0.21、5.58±0.12、16.95±0.87和25.57±1.63μM,最大反应速率Vmax分别为1.11±0.01、2.88±0.03、0.297±0.002、0.505±0.011和0.416±0.010nmol/min/nmol P450,内在清除率CLint分别为340.5±13.65、469.4±12.5、53.02±0.85、29.80±0.95和16.28±0.70μL/min/nmolP450；催化硝苯地平生成氧化硝苯地平的米氏常数Km分别为13.59±0.90、33.26±1.63、24.21±1.22、40.33±2.02和51.88±2.25μM,最大反应速率Vmax分别为150±0.03、2.07±0.03、0.992±0.002、1.85±0.03和1.11±0.02nmol/min/nmol P450,内在清除率CLint分别为110.3±5.9、62.33±2.24、40.96±1.59、45.81±1.63和21.41±0.63μL/min/nmol P450。酮康唑抑制CYP3A4、CYP3A5、CYP3A22、 CYP3A29和CYP3A46催化睾酮生成6β-羟基睾酮的的IC50分别为0.1561±0.0022,1.281±0.043,0.5343±0.0087,0.7317±0.0109和0.7520±0.0510μM；抑制催化咪达唑仑生成1-羟基咪达唑仑的的IC50分别为0.1496±0.0010、0.6772±0.0105、0.1224±0.0039、0.0791±0.0009和0.0546±0.0004μM；抑制催化硝苯地平生成氧化硝苯地平的IC50分别为0.2851±0.0081,2.122±0.026,0.1846±0.0031,0.2227±0.0025和0.6305±0.0117μM。结论：构建的重组酶可以作为小型猪与人CYP3A酶代谢特性比较的高效、快速研究模型,用于CYP3As底物和抑制剂的筛选和代谢特性研究。小型猪与人CYP3A在药代动力学行为、代谢产物情况和抑制特性上存在相似性,可以作为CYP3A介导药物的代谢研究动物模型。

关键词：小型猪 CYP3A 药物代谢杆状病毒-昆虫细胞表达系统睾酮咪达唑仑硝苯地平

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新型冠状病毒VLP候选疫苗的研制及其免疫原性评价

新型冠状病毒VLP候选疫苗的研制及其免疫原性评价

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作者：崔耀丹扬州大学

学位级别：硕士

由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（Coronavirus disease 2019,COVID-19）至今仍未停止变异与传播,疫苗是预防病毒传染的最有效方式之一,相比于传统的疫苗,病毒样... 详细信息

由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（Coronavirus disease 2019,COVID-19）至今仍未停止变异与传播,疫苗是预防病毒传染的最有效方式之一,相比于传统的疫苗,病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）疫苗安全性更高,可引起机体较强的免疫反应。SARS-CoV-2的膜蛋白（Membrane,M）和包膜蛋白（Envelope,E）可组装形成VLPs,而刺突蛋白（Spike,S）由S1和S2两个亚基组成,其中S1中的受体结合域（Receptor binding domain,RBD）与宿主细胞膜上的血管紧张素转换酶2（ACE2）介导病毒进入宿主细胞,诱导机体产生中和抗体,是疫苗研发的关键靶点。杆状病毒表达系统表达VLP,相较于哺乳动物细胞表达系统,成本更低,易于大规模生产。沙门菌鞭毛蛋白是先天性免疫系统的有效激活剂,其佐剂活性在许多抗原中得到验证。因此,本研究通过杆状病毒表达载体系统纯化SARS-CoV-2 RBD蛋白,并制备获得VLPs疫苗,通过小鼠模型,评价其与鞭毛蛋白（Fli C）佐剂混合使用的免疫原性,为安全、有效的COVID-19疫苗研发提供理论基础。 ***-CoV-2 RBD在昆虫细胞中的可溶表达及鉴定利用同源重组技术构建重组质粒pFastBac1-gp67-RBD。通过杆状病毒表达系统的Bac-to-Bac技术,筛选获得重组杆状病毒P3-RBD,利用间接免疫荧光试验和Western Blotting方法检测目的蛋白的表达,经过Ni2+柱亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western Blotting方法鉴定纯化的RBD蛋白,并通过ELISA鉴定RBD蛋白的ACE2结合活性。结果显示,重组质粒pFastBac1-gp67-RBD构建成功;重组病毒P3-RBD感染Sf9细胞后出现特异性绿色荧光;纯化后的RBD蛋白条带单一,能与Anti-RBD多克隆抗体发生特异性反应,并且与ACE2蛋白具有较高亲和力。综上,本研究在昆虫细胞中成功表达SARS-CoV-2 RBD蛋白,获得了高纯度、具有良好免疫反应性和生物活性的RBD抗原,为COVID-19疫苗开发提供了重要的生物材料。 ***-CoV-2病毒样颗粒的构建与鉴定成功构建重组质粒pFastBac1-S和pFastBac-Dual-ME,通过Bac-to-Bac技术筛选制备重组杆状病毒P2-S和P3-ME。将重组杆状病毒分别感染昆虫Sf9细胞,通过间接免疫荧光试验与Western Blotting方法鉴定S、M和E蛋白表达水平,结果显示,使用Anti-RBD多克隆抗体孵育后,P2-S感染后的Sf9细胞可观察到明显的特异性绿色荧光,分别使用Anti-His和Anti-Flag单克隆抗体孵育后,P3-ME感染后的Sf9细胞也均可观察到特异性绿色荧光,Western Blotting结果显示,S、M和E蛋白均成功表达。将P2-S和P3-ME共同感染Sf9细胞后,利用蔗糖密度梯度超速离心法,纯化细胞裂解上清中的VLPs,透射电镜可观察到具有明显的冠状结构的球形颗粒,免疫电镜观察到胶体金颗粒附着在冠状结构表面,表明VLPs组装成功。此外,Western Blotting结果显示VLPs中含有S、M和E蛋白;ELISA结果显示SARS-CoV-2 VLPs与ACE2蛋白具有较高亲和力。综上,本研究利用Sf9细胞成功表达并组装具有生物活性的SARS-CoV-2 VLPs。 ***-CoV-2病毒样颗粒候选疫苗的免疫原性分析成功提取鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（Fli C）,经Western Blotting鉴定其具有良好的免疫反应性,可用作VLP疫苗佐剂。以6-8周龄BALB/c雌性小鼠为模型,通过腹腔注射免疫纯化后的VLPs,并设置鞭毛蛋白Fli C佐剂组（VLPs+Fli C）和Alum佐剂组（VLPs+Alum）。分别在二免和三免12天后采集血清检测抗体应答水平,结果显示,二免和三免后,VLPs免疫组的Ig G抗体水平均显著高于PBS组,VLPs+Fli C和VLPs+Alum免疫组的Ig G抗体水平均显著高于VLPs免疫组。三免后VLPs免疫组的Ig G1和Ig G2a抗体水平均显著高于PBS组。三免2周后检测小鼠血清中和抗体,结果显示,与PBS组相比,VLPs组中和反应显著升高,VLPs+Fli C、VLPs+Alum组的中和反应显著高于VLPs组。此外,VLPs+Fli C和VLPs+Alum组小鼠血清抑制率显著高于单独VLPs免疫组,表明其能诱导高水平中和抗体应答。三免后14天采集脾脏

关键词： SARS-CoV-2 病毒样颗粒杆状病毒-昆虫细胞表达系统鞭毛蛋白佐剂免疫原性

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密码子优化的鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的表达

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中国动物传染病学报 2013年第3期21卷 13-17页

作者：肖亚莉刘建龙李雪松余磊滕巧泱闫丽萍李国新李泽君中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为了使鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)的E蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统中高效表达,本研究将DTMUV的E基因按照昆虫细胞偏嗜性密码子进行了优化,合成了基因optiE,并将其插入到pFastBac HT载体上,得到质粒pFastBac-... 详细信息

为了使鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)的E蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统中高效表达,本研究将DTMUV的E基因按照昆虫细胞偏嗜性密码子进行了优化,合成了基因optiE,并将其插入到pFastBac HT载体上,得到质粒pFastBac-optiE。将该质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组转座子rBacmid-optiE。将rBacmid-optiE转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验和Western blot方法都证实目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。本研究为进一步研究DTMUV E蛋白的结构与功能奠定了基础。

关键词：鸭坦布苏病毒 E蛋白杆状病毒-昆虫细胞表达系统密码子优化

来源：评论

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HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的形成

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重庆医学 2003年第10期32卷 1348-1350页

作者：赵玮廖国阳蒋燕军孙明波张新文姜述德中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所云南昆明650118

目的　在昆虫细胞中同时表达HCV的核心蛋白C和包膜蛋白 (E1、E2 )以形成病毒样颗粒 (VLP)。方法　利用PCR技术得到HCV的核心蛋白和包膜蛋白基因 ,用基因重组技术分别构建表达HCVC、E1和E2蛋白的重组杆状病毒 ,用SDS PAGE电泳分析HCV结... 详细信息

目的　在昆虫细胞中同时表达HCV的核心蛋白C和包膜蛋白 (E1、E2 )以形成病毒样颗粒 (VLP)。方法　利用PCR技术得到HCV的核心蛋白和包膜蛋白基因 ,用基因重组技术分别构建表达HCVC、E1和E2蛋白的重组杆状病毒 ,用SDS PAGE电泳分析HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达。电镜观察昆虫细胞内VLP的形成。结果　得到了能表达HCVC蛋白和同时表达E1、E2蛋白的重组杆状病毒reBV/C和reBV/E1、E2。reBV/C和reBV/E1、E2共感染的昆虫细胞同时表达了C、E1和E2蛋白 ,分子量分别为 2 0kD ,35kD和 6 6kD。电镜观察到表达HCV结构蛋白的昆虫细胞质中存在大量的直径为 4 0～ 6 0nm的VLP ,对照细胞无此结构。结论　在昆虫细胞中表达的HCVC。

关键词： HCV核心蛋白 HCV包膜蛋白病毒样颗粒杆状病毒-昆虫细胞表达系统

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