检索结果-内蒙古大学图书馆

中国比较医学杂志 2023年第4期33卷 50-56页

作者：李咏洁张伟杨凤梅李艳艳段素琴唐洁孙文亭靳玮华邓自君李明学张名马绍辉和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 西安交通大学医学部第一附属医院西安710061

目的建立叙利亚金黄地鼠CVb1(Coxsackievirus b1,CVb1)感染动物模型。方法取叙利亚金黄地鼠经鼻腔滴注方式呼吸道感染CVb1,感染剂量每只为10^(7.25)CCID_(50)。观察14 d体重、体温、精神状态、皮肤黏膜变化、行为、粪便状态、是否有神... 详细信息

目的建立叙利亚金黄地鼠CVb1(Coxsackievirus b1,CVb1)感染动物模型。方法取叙利亚金黄地鼠经鼻腔滴注方式呼吸道感染CVb1,感染剂量每只为10^(7.25)CCID_(50)。观察14 d体重、体温、精神状态、皮肤黏膜变化、行为、粪便状态、是否有神经症状等临床情况;每天采集咽拭子、鼻灌洗液以及粪便进行病毒载量检测,感染第7天取3只实施安乐死,采血进行病毒载量及生化检测;同时采集脑、心脏、肝等多个组织样品进行病毒载量、组织病理学和IHC检测。结果感染CVb1病毒的动物在14 d内均出现不同程度精神萎靡、体温下降,以及口唇部出现典型的红疹及疱疹等类似人类手足口病临床表现。咽拭子、鼻灌洗液、粪便以及血液中能检测到病毒;组织中检测到病毒载量并观察到病毒抗原,同时伴有炎症、增生、出血等病理改变;血清酶中肝功、心肌酶升高。结论CVb1病毒经滴鼻方式感染叙利亚金黄地鼠建立的感染模型,表现出心肌和肝等组织器官的病理损伤特征,可用于人类手足口病的研究。

关键词：柯萨奇病毒b组1型叙利亚金黄地鼠手足口病

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柯萨奇病毒b组1型新型中和试验方法的建立及初步应用

柯萨奇病毒B组1型新型中和试验方法的建立及初步应用

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作者：尹志超厦门大学

学位级别：硕士

我国自2008年在安徽省阜阳市暴发大规模手足口病(HFMD)疫情以来,截止2018年底,累计报告病例数超过2000万例,其中死亡病例数约3600例,发病数和死亡病例数均居我国丙类传染病第一位,严重危害公共健康。导致HFMD的人肠道病毒有20多种,除了... 详细信息

我国自2008年在安徽省阜阳市暴发大规模手足口病(HFMD)疫情以来,截止2018年底,累计报告病例数超过2000万例,其中死亡病例数约3600例,发病数和死亡病例数均居我国丙类传染病第一位,严重危害公共健康。导致HFMD的人肠道病毒有20多种,除了主要病原体肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)外,柯萨奇病毒b组1型(CVb1)也是引起HFMD的重要病原体。研究显示,CVb1感染还可导致无菌性脑膜炎、心肌炎、脑膜脑炎等以及与I型糖尿病有关。目前尚无针对CVb1的预防或治疗方法,亟需开展相关防治方法的基础与应用研究。为了进一步建立和完善相关研究技术和方法,本研究基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立了快速高效的CVb1新型中和抗体检测方法(Nt-ELISPOT),为CVb1疫苗和药物研发及血清流行病学研究提供技术支持。本研究以自福建泉州地区分离的CVb1临床分离毒株XM0108株为对象开展相关研究,核酸序列进化分析显示该毒株与我国已报告的CVb1流行毒株高度相近,属于主要流行株。本研究首先对CVb1病毒进行培养与病毒颗粒纯化条件的摸索,建立了较为稳定高效的病毒培养与制备方法,初步建立了病毒原液的浓缩和纯化方法,进一步应用蔗糖密度离心方法获得了具有较高纯度的CVb1病毒颗粒。获得对CVb1病毒具有特异和较好反应性的单克隆抗体是建立基于ELISPOT技术的新型免疫检测方法的重要基础。本研究将经灭活处理后的病毒颗粒以腹腔注射的方式免疫小鼠,利用间接ELISA方法筛选获得了6株抗CVb1的单克隆抗体。通过分析相关单抗对CVb1病毒的结合活性与反应特异性本研究选取具有较好反应性能的2E6单抗作为Nt-ELISPOT检测方法的检测抗体。进一步通过系统摸索Nt-ELISPOT检测方法中酶标检测单抗稀释比例、病毒感染剂量与培养时间,本研究基于ELISPOT技术建立了具有快速和高通量特点的CVb1中和试验方法。与传统的基于细胞病变效应(CPE)的中和试验方法(Nt-CPE),该方法可显著缩短检测时间(从5-7天缩短至1天),并且两种方法的检测结果具有良好的一致性。本研究进一步应用建立的Nt-ELISPOT方法开展了CVb1中和性单克隆抗体的筛选,获得了6株CVb1中和性单克隆抗体。其中5株单克隆抗体亚型为IgG2a,一株为IgG1亚型。中和能力分析显示,其中8A10具有相对更优的中和活性。本研究进一步应用乳鼠感染模型初步评价了8A10与CVb1免疫抗血清的体内抗病毒感染效果。结果显示,8A10与CVb1免疫抗血清通过被动免疫方式可有效保护小鼠免于CVb1的致死性攻击。同时,本研究应用建立新型中和试验方法对厦门地区515份健康人群血清样本进行CVb1中和抗体水平检测。结果显示,上述血清样本的CVb1中和抗体阳性率为27%,其中20-39岁年龄组的血清中和抗体阳性率最高,这提示厦门地区存在CVb1的既往流行感染。综上所述,本研究建立了一种新型的CVb1中和抗体检测方法,可以快速、高效和高通量地应用于CVb1中和抗体的筛选评价以及相关血清流行病学调查,可为CVb1的防治方法研究提供重要支持。

关键词：柯萨奇病毒b组1型中和试验方法酶联免疫斑点检测技术

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柯萨奇病毒b组1型中和纳米抗体的筛选与初步鉴定

柯萨奇病毒B组1型中和纳米抗体的筛选与初步鉴定

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作者：梅雅贤厦门大学

学位级别：硕士

柯萨奇病毒b组1型(Coxsackievirus b1,CVb1)是人肠道病毒(Human Enterovirus,HEV)的一种,常见感染人群以婴幼儿等免疫力低下人群为主,其恶性感染可能造成心肌炎、病毒性脑膜炎等症状,目前尚无针对CVb1的特效治疗性药物。纳米抗体(VHH)... 详细信息

柯萨奇病毒b组1型(Coxsackievirus b1,CVb1)是人肠道病毒(Human Enterovirus,HEV)的一种,常见感染人群以婴幼儿等免疫力低下人群为主,其恶性感染可能造成心肌炎、病毒性脑膜炎等症状,目前尚无针对CVb1的特效治疗性药物。纳米抗体(VHH)具有亲和力高,分子量小等特点,应用潜力巨大。当前,纳米抗体的筛选方式以基于噬菌体展示技术的亲和结合筛选为主,本研究尝试在噬菌体展示技术的基础上,摸索全新的中和纳米抗体筛选方式,筛选CVb1特异性中和纳米抗体,为CVb1病毒的诊疗提供基础,并为其他中和纳米抗体的筛选提供参考。本研究采用CVb1病毒的XM0108株,经过病毒培养及纯化等步骤,制备CVb1病毒抗原,灭活后与佐剂乳化,完成羊驼免疫。经RNA提取、逆转录、巢式PCR等实验步骤,最终从免疫羊驼的外周血单核细胞(Peripheral blood Mononuclear Cells,PbMCs)中特异性扩增出纳米抗体基因片段,成功构建多样性丰富的噬菌体-纳米抗体库。为快速高效筛选出对CVb1具有中和活性的纳米抗体,在噬菌体-纳米抗体库经噬菌体展示技术初步筛选后,本研究尝试将富集到的纳米抗体基因构建到带有人IgG1 Fc片段的真核表达载体中,转染到HEK293细胞表达出VHH-Fc形式的融合蛋白,最后用基于酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)的高通量中和抗体检测系统,筛选出对CVb1有良好中和活性的纳米抗体。本研究最终筛选出VHH-1H7、VHH-2A7、VHH-2C7三株对CVb1具有良好中和活性的VHH-Fc,其中VHH-2C7的中和活性最高,半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)值仅有0.029 μg/mL。体外结合活性实验表明三株纳米抗体均具有有效的CVb1结合活性,体内治疗实验证明这三株纳米抗体能有效延长CVb1感染小鼠的生存周期。本研究进一步采用高通量测序技术来筛选更多具有CVb1中和活性的纳米抗体。对初步富集的噬菌体-纳米抗体库进行高通量测序,得到了 5万余条纳米抗体序列信息。综合利用多种网站和软件进行序列分析,发现V GENE一共有43种基因型别,其中Vicpac IGHV3S53*01 F基因型占比最高,约占总库的64.74%。纳米抗体序列与羊驼胚系基因同源性集中于80%-95%之间,占总库的93.74%。V区突变位点数、V区氨基酸变化及FR2区氨基酸频率分析结果也证明该纳米抗体-高通量测序库质量较好,有利于纳米抗体筛选。本研究基于序列重复性,与VHH-1H7、VHH-2A7、VHH-2C7序列同源性等筛选原则,从纳米抗体-高通量测序库中挑选出40条纳米抗体序列。考虑到VHH-2C7优越的中和活性,部分序列同时构建出原始骨架及以VHH-2C7 FR区为骨架的纳米抗体序列。最终从库中构建出69条新序列,并成功筛选出VHH-10286和VHH-441两株具有中和活性的新纳米抗体。综上所述,本研究筛选出了五株CVb1特异性中和纳米抗体,有助于CVb1相关疾病的防治。我们建立了基于真核表达系统和ELISPOT以及基于高通量测序技术的两种中和纳米抗体筛选方法。这个体系也可以为其他病毒的中和纳米抗体的筛选提供一定的参考。

关键词：柯萨奇病毒b组1型纳米抗体中和筛选深度测序

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柯萨奇病毒b组1型TaqMan一步法荧光定量 RT-PCR检测方法的建立

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中国病毒病杂志 2022年第1期12卷 26-30页

作者：许丹菡张名冯昌增郭伟何秀莲张光贤禇嘉祐杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立柯萨奇病毒b组1型(coxsackievirus b1,CV-b1)特异的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据CV-b1的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD19;载体,在DH5α感受态细胞中扩增,体外转录后获得RNA标准品... 详细信息

目的建立柯萨奇病毒b组1型(coxsackievirus b1,CV-b1)特异的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据CV-b1的VP1序列,设计特异性引物和TaqMan探针。将目的基因插入pMD19;载体,在DH5α感受态细胞中扩增,体外转录后获得RNA标准品,建立标准曲线。并对检测方法的灵敏度、特异性、重复性进行评价。结果该方法在10^(2)-10^(11)拷贝/μl的模板范围内具有良好的线性关系(R^(2)=1.000),扩增效率E=107.5%。灵敏度达1×10^(2)拷贝/μl,只对CV-b1有特异性扩增曲线,且重复性较好。结论建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性,可作为CV-b1的快速检测和绝对定量分析。

关键词：柯萨奇病毒b组1型 TaqMan 实时荧光定量PCR 分子诊断

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柯萨奇病毒b组1型感染动物模型研究进展

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医学研究杂志 2024年第5期53卷 158-161,73页

作者：李咏洁和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118

柯萨奇病毒b组1型(coxsakievirus b1,CVb1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVb1感染后的机... 详细信息

柯萨奇病毒b组1型(coxsakievirus b1,CVb1)能引起人类心肌炎、无菌性脑膜炎、新生儿全身感染等多种疾病,幼儿感染后病情较重甚至引发死亡,而目前尚无针对该病毒的疫苗及特效治疗药物。因此,建立并开展相关动物模型研究对CVb1感染后的机体免疫反应、病毒毒力机制、药物疫苗研发等问题的解决具有重要意义,同时也能为临床治疗提供部分依据。本文通过对CVb1病毒感染构建的不同动物模型进行总结,以期望为建立合适的动物模型以及开展相关研究提供参考。

关键词：柯萨奇病毒b组1型动物模型疫苗及药物评价

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柯萨奇病毒A组6型和b组1型混合感染叙利亚金黄地鼠动物模型的实验研究

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中国比较医学杂志 2025年第1期35卷 30-40页

作者：侯婧涵段素琴徐鸿界孙文亭李明学李艳艳靳玮华陈丽雄刘权赵远杨凤梅和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 呼吸与共病全国重点实验室北京100005

目的建立柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)和b组1型(coxsackievirus b1,CVb1)混合感染叙利亚金黄地鼠手足口病动物模型。方法本研究将24只地鼠分为CVA6感染组、CVb1感染组、CVA6和CVb1混合感染组及对照组,采取鼻腔滴注病毒液和... 详细信息

目的建立柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)和b组1型(coxsackievirus b1,CVb1)混合感染叙利亚金黄地鼠手足口病动物模型。方法本研究将24只地鼠分为CVA6感染组、CVb1感染组、CVA6和CVb1混合感染组及对照组,采取鼻腔滴注病毒液和PbS方式造模。监测记录15 d内临床指标、生理指标、排毒情况,并在感染后第7天(D7)选取动物进行组织病理学和病毒抗原与核酸检测。结果单独和混合感染的实验组地鼠均出现类似人类手足口病的临床症状;WbC、NEUT、LYMPH结果提示病毒感染血象特征;咽拭子、粪便、血液和组织中均能检测到两种病毒核酸;粪便样品中能分离出两种病毒;脑等组织出现病理损伤表现及CVA6和CVb1病毒抗原蛋白和核酸的阳性共定位。结论经鼻腔同时滴注CVA6和CVb1混合液能够成功感染叙利亚金黄地鼠,复制出类似人类手足口病的疱疹、造成病毒性心肌炎和脑炎病理损伤等,结果显示混合感染组相较于单独感染组病情更为严重,表现为临床症状加重、病毒复制增高以及组织病理损伤明显。本研究为开展人类肠道病毒混合感染基础和临床研究提供一定借鉴和参考。

关键词：叙利亚金黄地鼠混合感染动物模型柯萨奇病毒A组6型柯萨奇病毒b组1型手足口病

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柯萨奇b组1型云南分离株MSH／KM9／2009全基因组序列分析

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病毒学报 2013年第3期29卷 293-298页

作者：刘建生邵聪文潘玥朱艳菊邓新强廖宏玮刘雅灵马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

对2009年分离自云南省昆明市脑膜脑炎儿童的1株柯萨奇b组1型病毒MSH-KM9-09,进行了全基因组的序列测定,并对其分子变异和进化特点进行了分析。采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR),分段扩... 详细信息

对2009年分离自云南省昆明市脑膜脑炎儿童的1株柯萨奇b组1型病毒MSH-KM9-09,进行了全基因组的序列测定,并对其分子变异和进化特点进行了分析。采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR),分段扩增覆盖病毒全长序列的8个重叠片段(未包括多聚腺苷酸尾),并进行序列测定和分析。CVb1MSH-KM9-09病毒株基因组全长7 384个核苷酸(nt),5'端和为3'端分别为741nt和94nt的非编码区,5'和3'非编码区间为一个6 549nt长的开放阅读框,编码一个含2 183个氨基酸的多聚蛋白,编码区内未见核苷酸的插入或缺失。与Genbank库中现有CVb1全基因组序列M16560、pmMC、Tucson b1和CVb1/Nm相比对,整个基因组的核苷酸同源性分别为80.9%、81.6%、80.5%和80%,氨基酸同源性分别为95.6%、95.8%、96.2%和95.6%。首次完成中国CVb1病毒全基因组核苷酸序列的测定,经核苷酸序列同源性比对和进化树分析,证实MSH/KM9/2009株属于CVb1基因型。

关键词：柯萨奇病毒b组1型全基因组同源性序列分析

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