新冠病毒刺突蛋白通过与血管紧张素转化酶2（ACE2）相互作用介导病毒入侵宿主细胞,是当下冠状病毒研究中重要的药物设计与病毒检测靶点。目前我国已研制了新冠病毒核酸与假病毒标准物质,以及核衣壳蛋白标准物质等,但新型冠状病毒中具有重要功能的刺突蛋白目前仍无标准物质成功研制。标准物质的研制过程中,准确定量是重要环节。目前对蛋白质定量的技术主要有免疫法、表面等离子共振与质谱分析法。同位素稀释质谱法（isotope dilution mass spectrometry,IDMS）作为具有最高计量学特性的基准方法,可直接溯源至国际单位制基本单位（SI单位）,常用于标准物质定值。实验旨在建立一种基于特征肽段准确定量新冠病毒刺突蛋白S1亚基的方法,并基于此进行标准物质的研制。实验步骤分为以下4部分:1)获得新冠病毒刺突蛋白S1亚基原料后,首先对其进行定性分析（包括分子量、氨基酸序列、纯度、以及ACE2亲和力验证）。2)通过两种不同的定量方法分别进行定量分析,选择基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法作为第一种定量方法,并用BSA标准物质对该方法定量准确性进行验证。3)选择基于特征肽段的同位素稀释质谱法作为第二种定量方法,在优化实验相关参数（缓冲液、加酶次数与反应时间）后,考察方法可行性（特异性、基质效应、精密度与准确度）。比较两种方法定量结果是否有差异。4)最后研究标准物质的均匀性、稳定性,并对标准物质的定值不确定度进行计算。实验结果表明,重组表达纯化得到的新冠病毒刺突蛋白S1亚基原料具有正确的蛋白序列与生理活性,可以用于标准物质研制。基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法经验证具有准确定量的能力。基于特征肽段T6(GIYQTSNFR,GIYQTSNF(13C9,15N)R)的同位素稀释质谱法,以30%乙腈和10 m M氯化钙,p H 8的Tris缓冲液,水解48 h作为反应条件,反应前12 h每隔4 h加一次酶,后期每隔12 h加一次酶。两种定量方法结果等效度比较显示无差异,且基于特征肽段结合同位素稀释质谱法的定量方法可行性良好。标准物质候选物具有良好的均匀性,短期稳定性数据显示在4℃条件下的保存时间不宜超过36小时,25℃下会快速降解,反复冻融三次后未见其明显降解。长期稳定性考察综合考虑后将该标准物质的保存期限设为36个月。最后结合氨基酸与特征肽段这两种定量方法进行不确定度的合成,最终对该标准物质候选物定值结果为1.008 mg/g,不确定度为0.039 mg/g,扩展因子k=2,扩展不确定度为0.078 mg/g。本项目研制的新型冠状病毒刺突蛋白S1亚基具有良好的溯源性和准确量值,可对各检测试剂盒的检测值进行校准且结果具有可比性。同时也可为试剂盒与重组蛋白疫苗的开发提供质量监控,保证生命安全。
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