检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：胡晓星昆明理工大学

学位级别：硕士

肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是引起手足口病的主要病原体之一,多感染5岁以下幼儿,主要通过亲密接触、呼吸道及消化道等途径传播,可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹和溃疡,个别患者可导致心肌炎、肺水肿以及无菌性脑膜炎等... 详细信息

肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是引起手足口病的主要病原体之一,多感染5岁以下幼儿,主要通过亲密接触、呼吸道及消化道等途径传播,可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹和溃疡,个别患者可导致心肌炎、肺水肿以及无菌性脑膜炎等并发症甚至死亡。目前,国内市场还没有针对手足口病的治疗药物,只能采用对症支持治疗。理想的小动物模型的缺乏严重制约了手足口治疗药物的研制进程。目前,可用于EV71感染的动物模型有灵长类猕猴模型、乳鼠模型以及转基因小鼠模型,但以上模型都存在各自的缺陷,尚不能作为合适的疾病模型。有研究发现,EV71能够感染幼龄中缅树鼩,具有发展为理想动物模型的潜力,建立一个成熟、稳定的树鼩体外细胞感染模型,可为EV71感染树鼩模型的建立奠定基础并提供理论依据。本研究首先建立了EV71载量测定的方法,通过对比EV71 VP1基因序列,筛选出高度保守区域,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1+载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。经实验验证,引物和探针的最佳工作浓度分别为300nM和200nM,在1×103-1×109拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R2=1),灵敏度可达到102 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16 (Coxsackievirus A16, CA16)、柯萨奇B1 (Coxsackievirus B1, CB1)、人轮状病毒(Human rotavirus, HRV)、疱疹病毒(Herpesvirus, HSV)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。其次,用胰蛋白消化和机械振荡法联合使用,分离获得树鼩原代肾上皮细胞,用含5ng/mLEGF的RPMI1640完全培养基进行培养,并用角蛋白18抗体(Cytokeratin 18, CK18)对树鼩肾细胞进行鉴定,显微镜下观察大部分细胞都可发出绿色荧光,表明所分离出的细胞是肾上皮细胞。用MTT对树鼩肾细胞进行生长特性的测定,结果发现,在培养的1d-2d天内细胞生长速度缓慢,培养到3d-4d时细胞开始进入指数生长期,10d以后细胞生长进入平稳期,14d以后细胞开始凋亡。利用Vero细胞培养获得高毒力的EV71病毒,培养的病毒滴度可达5×107TCID50/mL。将培养的高毒力EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,通过RT-PCR定性和TaqMan荧光定量PCR检测病毒上清,结果发现RT-PCR可检测出目的条带,定量测定病毒载量可达106copies/μL,与EV71感染Vero后上清中病毒载量大小无显著性差异,表明EV71可以在树鼩肾细胞内复制增殖。通过测定EV71感染树鼩原代肾细胞后培养上清中病毒载量和滴度的变化,确定了该病毒在树鼩肾细胞中最适感染复数(Multiplicity of infection, MOI)为5,用最适的MOI将EV71接种到树鼩原代肾细胞中,发现在感染的第4d,上清中病毒滴度达到最大,可达5×105TCID50/mL,之后,随着时间的增加,病毒滴度开始下降。利用Western blot和间接免疫荧光方法对感染后的树鼩肾细胞进行EV71 VP1蛋白表达情况的检测,发现在感染后的第2d～6d均能检测到目的蛋白的表达。综上所述,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法,可用于后续EV71感染实验的载量测定。胰蛋白酶消化法与机械振荡法联合使用,分离获得的树鼩原代肾上皮细胞,经高滴度的EV71病毒感染后,通过核酸和蛋白水平检测,均证实树鼩原代肾细胞可以被EV71感染。该实验结果可为EV71感染树鼩动物模型的建立提供体外病毒易感性实验依据。

关键词：树鼩原代肾细胞肠道病毒71型感染荧光定量PCR 间接免疫荧光

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

树鼩原代肾细胞的分离优化培养及EV71感染

树鼩原代肾细胞的分离优化培养及EV71感染

引用

第十四届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：胡晓星彭杰冯悦刘阳夏雪山昆明理工大学生命科学与技术学院云南省分子医学研究中心昆明650500云南

目的分离优化培养树鼩原代肾细胞,并探索EV71对树鼩肾细胞的感染性。方法胰蛋白酶-EDTA消化法分离得到的树鼩原代肾细胞,分别用10％FBS DMEM、5ng/mL10％FBS DMEM、10％FBS RPMI1640以及5ng/mL 10％FBS RPMI1640四种培养基同时进行培... 详细信息

目的分离优化培养树鼩原代肾细胞,并探索EV71对树鼩肾细胞的感染性。方法胰蛋白酶-EDTA消化法分离得到的树鼩原代肾细胞,分别用10％FBS DMEM、5ng/mL10％FBS DMEM、10％FBS RPMI1640以及5ng/mL 10％FBS RPMI1640四种培养基同时进行培养比较,显微镜下观察细胞生长状态,EV71感染最佳状态细胞,一步法RT-PCR和实时定量PCR检测感染结果。结果 5ng/mL EGF 10％FBS RPMI1640培养的树鼩原代肾细胞,生长速度快,生长状态好,EV71感染树鼩原代肾细胞后在第48h收获的病毒上清,RT-PCR可检测出目的条带,实时定量PCR可检测出比洗涤液高的病毒载量。结论含5ng/mL EGF的RPM11640完全培养基最适合培养树鼩原代肾细胞,EV71可在分离培养出来的树鼩肾细胞中增殖,在分子水平上验证了EV71对树鼩原代肾细胞具有感染性,这为EV71感染树鼩模型的建立提供理论依据。

关键词：树鼩原代肾细胞 EV71 感染实时定量PCR

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

引用

中国实验动物学报 2017年第2期25卷 117-122页

作者：杨铭胡晓星王文广张莉董书维冯悦代解杰夏雪山昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩标准化研究与疾病动物模型创建省创新团队昆明650118

目的建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒... 详细信息

目的建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别,建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,感染后48~96 h病毒滴度可达到1.3×10~6TCID_(50)/m L,说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现,EV71病毒VP1蛋白可在感染后2~8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出,间接免疫荧光法则在感染后2~6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上,确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性,初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。

关键词：树鼩原代肾细胞 EV71 病毒增殖 VP1蛋白感染模型

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

树鼩原代细胞的分离及感染甲型流感病毒模型的构建

引用

世界最新医学信息文摘 2017年第71期 20-22页

作者：谷臻杜秋伶江海明李润峰夏雪山杨子峰澳门路加医疗中心呼吸疾病国家重点实验室(广州医科大学)/广州医科大学附属第一医院昆明理工大学生命科学与技术学院

目的建立甲型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1)对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的体外感染模型。方法胶原酶蛋白消化法获得树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞,用流感病毒PR8株感染树鼩原代细... 详细信息

目的建立甲型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1)对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的体外感染模型。方法胶原酶蛋白消化法获得树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞,用流感病毒PR8株感染树鼩原代细胞,测定24、48和72 h培养上清病毒载量,并观察细胞感染流感病毒后的形态变化,以确定流感病毒PR8株体外对树鼩原代气管内皮细胞、树鼩原代肺细胞及树鼩原代肾细胞的感染性。结果分离到的树鼩原代细胞经传代培养纯化和形态鉴别,对树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞和犬肾传代细胞(MDCK)进行流感病毒易感性比较,培养48 h时显微镜下均能观察到明显的细胞病变(CPE);培养72h时病毒滴度可分别达到2.40×105TCID50/mL、1.20×103TCID50/mL、1.74×104TCID50/mL和1.79×107TCID50/mL。结论流感病毒可有效感染树鼩原代气管内皮细胞、原代肺细胞、原代肾细胞并有效增殖,且流感病毒对树鼩原代气管内皮细胞感染性最强,与流感病毒易感细胞MDCK相比具有统计学意义。确立了树鼩原代细胞的分离与培养方法,初步建立了流感病毒感染树鼩原代细胞的体外模型。

关键词：树鼩原代气管内皮细胞树鼩原代肺细胞树鼩原代肾细胞流感病毒病毒增殖易感性

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：