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西北植物学报 2013年第3期33卷 507-511页

作者：庞楠张飞雄首都师范大学生命科学学院北京100048

为了探讨低氧对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响,本实验以普通小麦为材料,用低氧水处理其根尖,按常规细胞制片、银染、电镜观察、间接免疫荧光染色和半定量PCR分析等手段开展研究。观察发现:(1)低氧水处理后小麦核仁结构发生膨胀... 详细信息

为了探讨低氧对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响,本实验以普通小麦为材料,用低氧水处理其根尖,按常规细胞制片、银染、电镜观察、间接免疫荧光染色和半定量PCR分析等手段开展研究。观察发现:(1)低氧水处理后小麦核仁结构发生膨胀、突出、进而凝集、内部出现空泡、细微结构消失、核仁通道结构异常、甚至解体等一系列变异现象。(2)间接免疫荧光染色技术观察看到,低氧水处理后小麦核仁内的核磷蛋白B23向核质甚至胞质扩散。(3)半定量PCR分析显示,低氧处理后rRNA基因的表达量较对照明显降低,而且C23的表达信号几乎检测不到,表明核糖体RNA和核仁蛋白C23基因的表达均显著下调,低氧严重抑制它们的转录。研究证明,低氧除了对小麦根端分生细胞核仁结构有破坏作用外,还严重抑制核仁的功能。

关键词：低氧小麦根端分生细胞核仁结构核仁功能

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细胞凋亡和核仁结构的表观遗传调控机制研究

细胞凋亡和核仁结构的表观遗传调控机制研究

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作者：王庆武汉大学

学位级别：博士

细胞凋亡是细胞响应内外环境信号后为了维持生命体内稳态而做出的自杀行为。细胞凋亡在有机体的生长发育过程中扮演着重要的角色,它所涉及的主要调控基因的突变也在多种疾病如癌症、神经系统疾病等的发病过程中具有不可推卸的责任。DNA... 详细信息

细胞凋亡是细胞响应内外环境信号后为了维持生命体内稳态而做出的自杀行为。细胞凋亡在有机体的生长发育过程中扮演着重要的角色,它所涉及的主要调控基因的突变也在多种疾病如癌症、神经系统疾病等的发病过程中具有不可推卸的责任。DNA甲基化在许多生物过程和癌症发生中起着至关重要的作用。氮杂胞苷5-azacytidine(5-AC)是一种DNA甲基化抑制剂,在临床上已被用来治疗骨髓增生异常综合征、白血病等疾病。实验室前期研究发现5-AC能够特异性抑制凋亡过程,但其中涉及到的分子途径还需要进一步探索。核仁是负责核糖体生物合成的核细胞器,近期研究和核仁蛋白组学的发展表明其在多种生命活动中发挥着重要的作用。核仁的结构是其正常发挥生物学功能的体现。凋亡细胞染色质凝聚,核仁破碎。研究表明组蛋白H3第9位上赖氨酸的二甲基化修饰H3K9me2是核仁维持结构完整性不可缺少的部分,然而其对核仁结构的分子调控机理还有待于进一步的探究。本论文对细胞凋亡和核仁结构的表观调控机制进行了研究,主要结果如下:1、DNA甲基化抑制剂5-AC通过影响抗凋亡蛋白BCL-XL特异性抑制肿瘤坏死因子TNF-α和放线菌酮cycloheximide(CHX)共同诱导的NIH-3T3细胞的凋亡5-AC的处理会使癌细胞整体基因组甲基化包括特定凋亡基因的启动子甲基化水平降低,从而引起癌细胞的凋亡。由于细胞内分子环境之间的差异,不同的细胞类型对5-AC的刺激具有不一样的反应。实验室前期研究发现小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3对5-AC具有很高的耐受度,并且在TNF-α和CHX共同诱导的NIH-3T3细胞凋亡过程中基因组甲基化会有明显的升高,而50μmol/l的5-AC预处理3 h会显著阻滞该凋亡过程。为了进一步探究DNA甲基化在NIH-3T3细胞凋亡过程中发挥的作用,我对比使用了另外三种DNA甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine(5-d AC)、6-thioguanine(6-TG)和RG108。Dot blot结果表明这三种甲基化抑制剂的预处理可以像5-AC一样使NIH-3T3细胞的整体基因组甲基化降低到了正常水平。但是Annexin-V-FITC和PI共染后进行流式(FCM)细胞凋亡检测的结果却表明它们却不能像5-AC一样表现出抑制TNF-α和CHX共同诱导的NIH-3T3细胞凋亡的作用。进一步使用小干扰RNA(siRNA)将DNA甲基转移酶DNMT1瞬时敲低以达到降低基因组甲基化的目的。然而FCM细胞凋亡检测数据表明DNMT1的敲低基本上不影响NIH-3T3细胞的凋亡过程。综合以上结果,我认为5-AC特异性抑制TNF-α和CHX诱导的NIH-3T3细胞凋亡过程,但是是以DNA甲基化非依赖性的方式。随后我用western blot技术检测细胞凋亡相关的BCL-2家族中抗凋亡蛋白BCL-XL、BCL-2及促凋亡蛋白BAX在该凋亡过程中的变化,结果表明三种蛋白在该过程中都被下调。而且FCM细胞凋亡检测数据表明siRNA介导的抗凋亡蛋白BCL-XL的敲低会废除5-AC抑制凋亡的作用。另一方面,对抗凋亡蛋白BCL-2或促凋亡蛋白BAX的敲低则不会干扰5-AC的抑制作用。这些数据表明5-AC通过影响抗凋亡蛋白BCL-XL来发挥抑制TNF-α和CHX诱导的NIH-3T3细胞凋亡的作用。2、rDNA位点上的H3K9me2水平的降低诱导rDNA转录起始的增加和核仁分散现象在该研究中,我分析了三种rRNA polymerase I转录抑制剂ActD、BMH21或CX5461分别处理人类肺癌A549细胞24 h后对该细胞的影响。我通过核仁标记物纤维蛋白fibrillarin(FC)的荧光免疫(IF)染色检测到含有超过3个核仁的间期细胞核数量发生显著性的增加。以rDNA基因编码区5’端引物进行实时定量PCR(q RT-PCR),结果显示以45S pre-rRNA(45S pre)作为指示的rDNA转录起始产物的数量也发生显著上升的趋势。在人类宫颈癌HeLa细胞中也观察到了类似的现象。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验表明HeLa细胞rDNA位点上的异染色质标记H3K9me2水平明显降低。使用ActD对HeLa细胞进行时间梯度的处理,包括10 min、20 min、30 min和1 h,IF染色实验结果表明在处理20 min后,含有超过三个核仁的HeLa间期细胞核数量才发生显著性上升,q RT-PCR结果表明rDNA的转录起始的水平也在处理20 min后开始增加。然而ChIP实验表明在ActD处理10 min后,rDNA位点的H3K9me2水平已经明显降低,表明rDNA位点的组蛋白修饰H3K9me2先于rDNA转录起始和核仁数量增多,并且rDNA的转录起始与核仁分散之间有着密切的联系。BIX-

关键词：细胞凋亡氮杂胞苷核仁结构 H3K9me2 R-loop

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真核生物细胞核仁结构与rRNA基因转录位点研究

真核生物细胞核仁结构与rRNA基因转录位点研究

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作者：陶伟东北师范大学

学位级别：博士

该实验采用高等植物洋葱和哺乳动物小白鼠乳鼠为实验材料,借助于常规电镜、免疫荧光、电泳、免疫印迹、细胞化学、免疫电镜等实验技术,对(1)真核生物核仁的超微结构 ;(2)核仁中DNA孤运动过程;(3)核仁中DNA的分布位点及其排布规律;(4)RN... 详细信息

该实验采用高等植物洋葱和哺乳动物小白鼠乳鼠为实验材料,借助于常规电镜、免疫荧光、电泳、免疫印迹、细胞化学、免疫电镜等实验技术,对(1)真核生物核仁的超微结构 ;(2)核仁中DNA孤运动过程;(3)核仁中DNA的分布位点及其排布规律;(4)RNA聚合酶Ⅰ转录因子UBF(Upstream binding factor)的定性与定位;(5)rRNA基因在核仁中的转录位点等方面进行了研究.一、关于洋葱核仁结构及其rRNA基因转录位点.二、鼠肝核仁结构及其rRNA基因转录位点定位.利用RNA/DNA杂合体抗体来精细确定鼠肝核仁rRNA基因转录位点,结果表明鼠肝核仁的转录位点标记信号都出现在FC的边缘及DFC的一些区域,而在FC内部及核仁周边染色质未观察到转录标记信号.因此,鼠肝核仁rRNA基因的转录位点应位于DFC及FC的边缘.

关键词：真核生物细胞核仁结构 rRNA基因转录位点

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C23基因调控核仁结构和核糖体发生影响细胞增殖和胚胎发育的研究

C23基因调控核仁结构和核糖体发生影响细胞增殖和胚胎发育的研究

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作者：王丽娜内蒙古大学

学位级别：博士

核仁（Nucleolus）作为一种多功能细胞器，是真核细胞中最明显的核内结构，参与rDNA转录和核糖体生物发生、细胞周期、细胞凋亡及染色质重塑等多种过程。核仁素（也称C23，NCL）是核仁中高度保守的蛋白，主要位于核仁的致密纤维组分和... 详细信息

核仁（Nucleolus）作为一种多功能细胞器，是真核细胞中最明显的核内结构，参与rDNA转录和核糖体生物发生、细胞周期、细胞凋亡及染色质重塑等多种过程。核仁素（也称C23，NCL）是核仁中高度保守的蛋白，主要位于核仁的致密纤维组分和颗粒组分，参与核仁功能。核仁素的组织和功能失调将导致基因表达紊乱，引起细胞凋亡。核仁在细胞中是动态变化的结构，但动态核仁结构和功能背后的复杂调控机制尚未得到充分研究。此外，在体细胞核移植（SCNT）胚胎中，核仁基因如何调控核仁结构和早期胚胎基因表达的机制尚不明确。因此，通过调控C23基因的表达来研究其对细胞增殖、胚胎发育以及核仁形态结构的影响具有重要意义。　　在本研究中，通过构建了过表达和敲减C23基因的载体，在细胞水平和胚胎水平对C23基因调控核仁的结构和基因表达来研究其对细胞和胚胎的影响。首先，对构建的过表达和敲减C23基因的载体进行了基因和蛋白水平检验证明载体的可用性后用于转染牛成纤维细胞。然后，观察细胞表型的变化发现敲减C23基因导致细胞立体感减弱，核仁面积减少，核仁呈点状;过表达C23则会增加细胞立体感，核仁形状没有变化。核型分析发现，敲减C23基因后29.4%的细胞有不足60条染色体。通过细胞延时成像分析了细胞分裂速度和迁移速度，发现过表达C23基因会促进细胞分裂和迁移，敲减C23使速度减慢。通过台盼蓝染色后进行活细胞计数分析细胞增殖情况，发现过表达C23的细胞，在96h内一直处于增殖状态，且与对照细胞趋势一致;敲减C23的细胞量没有显著增加，从48h开始，细胞数量逐渐减少。通过流式分析了细胞周期和细胞凋亡，发现过表达C23的细胞中S期细胞比例增多，凋亡细胞减少;敲减C23的细胞中S期细胞比例始终低于对照和过表达细胞。通过转录组测序进一步分析了过表达和敲减C23后对细胞基因表达的影响，发现过表达C23后，细胞的基因水平有所提高;而敲减C23后，基因表达水平显著降低。接下来对差异基因进行GO和KEGG功能富集分析，结果显示差异基因主要集中在转录活性、细胞增殖、细胞周期、有丝分裂和染色体凝集等方面。进一步分析功能相关基因的TPM值，发现在过表达C23细胞中，促进细胞生长的基因表达量显著高于对照和敲减细胞;反之，促进细胞凋亡等加速细胞死亡的基因，在敲减C23细胞中表达量更高。最后，参考转录组数据的分析结果，挑选了6个功能相关基因和8个核糖体基因进行qPCR验证，结果显示基因在过表达C23细胞中有所升高;而在敲减C23的细胞中显著降低。　　为了进一步验证C23基因在胚胎发育过程中的调控关系，利用体细胞核移植技术构建了同种克隆胚胎和异种克隆胚胎，并对其表达调控作进一步探索。首先，通过qPCR检测了C23基因在同种和异种克隆胚胎中的表达情况，发现异种克隆胚胎中C23基因表　　达量显著低于同种胚胎，始终处于低表达状态。接下来，通过转录组测序分析了牛-牛同种（bovine-bovine，B-B）和羊-牛异种（ovine-bovine，O-B）克隆胚胎基因的表达差异;结果显示，差异基因中包含许多核糖体相关基因;热图分析显示核糖体相关基因显著富集到8-cell到囊胚持续高表达的基因簇中。由于8-cell是牛胚胎基因组激活时期，所以继续分析了10个ZGA基因和8个与胚胎发育相关的功能基因的转录组数据，发现这些基因在异种克隆胚胎中也没有被激活。收集胚胎样本时，发现羊-牛异种克隆胚胎在8-cell期存在明显的发育阻滞现象。核仁的免疫荧光结果显示，同种胚胎的核仁是环形，而异种胚胎的核仁呈现点状结构，这种异常结构的核仁达到84.6%，显著的高于IVF组和同种克隆胚胎组;同时发现，异种胚胎的核仁面积和直径变小，但个数增多。之后，构建了过表达和敲减C23基因的克隆胚胎;发现过表达C23基因后，同种克隆胚胎的囊胚率（30.18%vs28.98%）和异种克隆胚胎的囊胚率（1.23%vs0.95%）都有明显增加;而敲减C23基因表达后，胚胎的8-cell率和囊胚率都有所降低。C23基因也会改变克隆胚胎中正常和异常核仁的比例;过表达C23基因后，同种（8.38%vs10.58%）和异种（81.29%vs84.42%）克隆胚胎中异常核仁比例明显减少，而敲减C23基因则会导致同种（66.47%vs89.42%）和异种（11.64%vs15.58%）胚胎中正常的核仁比例减少。通过qPCR分析进一步了与胚胎发育相关基因的表达量，过表达C23基因后的同种和异种胚胎中，核糖体、ZGA和功能相关的基因都显著升高，而在敲减的胚胎中显著降低。　　综上所述，本研究发现C23的低表达会降低功能基因表达、导致核仁结构异常，不能正确生产核糖体和功能蛋白，从而引起细胞凋亡和异种克隆胚胎发育阻滞。过表达C23基因可部分改善核仁结构，提高基因表达，促进细胞生

关键词：体细胞核移植胚胎生长发育核仁结构核糖体发生 C23基因

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哺乳动物卵母细胞及早期胚胎核仁结构与rRNA基因表达研究进展

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生物学通报 2002年第11期37卷 4-6页

作者：隋宏书谭景和山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

核仁是细胞中合成 r RNA的场所 ,与细胞的蛋白质合成密切相关。近年的研究证明 ,在卵子发生和早期胚胎发育过程中 ,核仁的结构和机能都发生着有规律的变化 ,对于研究卵子发生和早期胚胎发育机理有着重要的意义。本文以牛为主要对象 ,综... 详细信息

核仁是细胞中合成 r RNA的场所 ,与细胞的蛋白质合成密切相关。近年的研究证明 ,在卵子发生和早期胚胎发育过程中 ,核仁的结构和机能都发生着有规律的变化 ,对于研究卵子发生和早期胚胎发育机理有着重要的意义。本文以牛为主要对象 ,综述了有关核仁的结构、发生以及卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中核仁结构和 r

关键词：哺乳动物卵母细胞早期胚胎核仁结构 rRNA 基因表达研究进展转录

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精氨酸对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响

精氨酸对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响

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细胞—生命的基础——中国细胞生物学学会2013年全国学术大会·武汉

作者：史文硕刘伟桐张硕张飞雄首都师范大学生命科学学院

精氨酸是一种半必需氨基酸,对人体具有重要的营养、生理和免疫等作用;另外,由于精氨酸是多胺和一氧化氮等的前体物质,而后两者是重要的信使分子,参与包括生物生长、发育、分化等一系列过程,因此精氨酸又具有广泛的生理生化功能。不过,... 详细信息

精氨酸是一种半必需氨基酸,对人体具有重要的营养、生理和免疫等作用;另外,由于精氨酸是多胺和一氧化氮等的前体物质,而后两者是重要的信使分子,参与包括生物生长、发育、分化等一系列过程,因此精氨酸又具有广泛的生理生化功能。不过,到目前为止还没有看到该氨基酸与核仁结构及功能关系的研究报道。本实验以普通小麦为材料,用不同浓度的L-精氨酸(L-Arg,Sigrna公司产品)处理萌发的

关键词：精氨酸小麦核仁结构核仁功能

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精氨酸对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响

精氨酸对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响

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中国细胞生物学学会2013年全国学术大会

作者：史文硕刘伟桐张硕张飞雄首都师范大学生命科学学院北京100048

精氨酸是一种半必需氨基酸,对人体具有重要的营养、生理和免疫等作用;另外,由于精氨酸是多胺和一氧化氮等的前体物质,而后两者是重要的信使分子,参与包括生物生长、发育、分化等一系列过程,因此精氨酸又具有广泛的生理生化功能.不过,到... 详细信息

精氨酸是一种半必需氨基酸,对人体具有重要的营养、生理和免疫等作用;另外,由于精氨酸是多胺和一氧化氮等的前体物质,而后两者是重要的信使分子,参与包括生物生长、发育、分化等一系列过程,因此精氨酸又具有广泛的生理生化功能.不过,到目前为止还没有看到该氨基酸与核仁结构及功能关系的研究报道.

关键词：精氨酸小麦核仁结构核仁功能

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过氧化氢对乳鼠心肌细胞核仁结构的损伤及HSP70的保护作用

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中国病理生理杂志 2001年第11期 109-109页

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过氧化氢对乳鼠心肌细胞核仁结构的损伤及HSP70的保护作用

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中国病理生理杂志 2001年第11期17卷 1148-1148页

作者：王慷慨肖卫民蒋磊邓恭华尢家碌肖献忠中南大学湘雅医学院病理生理学教研室，湖南长沙 410078

目的:采用体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞为模型,观察过氧化氢(H 2O2)对心肌细胞核仁结构的损伤作用以及HSP70对核仁结构改变的保护作用.方法:向体外培养的新生Wista r大鼠心肌细胞中加入含0.5mmol/L H2O2的无血清DMEM培基,观察3 h... 详细信息

目的:采用体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞为模型,观察过氧化氢(H 2O2)对心肌细胞核仁结构的损伤作用以及HSP70对核仁结构改变的保护作用.方法:向体外培养的新生Wista r大鼠心肌细胞中加入含0.5mmol/L H2O2的无血清DMEM培基,观察3 h后心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)的变化.采用甲苯胺兰(Toluidin blue)对核仁进行染色,光镜下观察核仁的结构变化,并采用电镜进一步观察核仁超微结构的改变.心肌细胞经42℃,30 min热休克预处理(HSR)并恢复6 h后,采用Western blot及免疫组织化学方法观察HSP70在心肌细胞中的表达及应激状态下的分布变化.并观察HSR对H2O2所致LDH释放率及核仁结构变化的影响 .经脂质体导入HSP70反义寡核苷酸以阻断HSP70的表达,观察其对热休克预处理保护作用的影响 .结果:0.5 mmol/L H2O2引起心肌细胞LDH释放率明显升高(57.55% ±3.18% vs Ctrl: 8.93%±0.38%, P＜0.01), 光镜下核仁染色颗粒数增多, 电镜下核仁结构松散、核仁组份分离、碎裂 .热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O2所致心肌细胞LDH释放率明显降低(21.68%±2.68% vs H2O2: 57.55%±3.18%, P＜0.01)、核仁损伤明显减轻.免疫组化结果显示H2O2可引起HSP70从胞浆到胞核,再到核仁的移位.HSP70反义寡核苷酸的导入明显阻断了热休克预处理时HSP70的表达,并明显阻断了其对心肌细胞LDH释放率(43.70%±3.24% vs HSR±H2O2: 21.68%±2.68%, H2O2:57.55%±3.18%, P＜0.01)及核仁损伤的保护作用.讨论:H2 O2可能通过引起蛋白质变性和聚集以及影响RNA聚合酶活性、rDNA模板活性,或者通过激活c aspase-3系统,进而激活某些DNA或RNA核酸内切酶,从而导致核仁结构受损.应激时HSP70 进入核仁以后,可能通过发挥其分子伴娘功能,与H2O2所致变性或聚集的RNA聚合酶、核糖核蛋白等结合,促使其复性或解聚,从而保证正常的细胞转录功能,维持核仁的正常结构; HSP70还可能在细胞浆内直接或间接抑制caspase-3的活化,或在核仁中与活化的caspase-3 或其下游活化物结合而阻止caspase-3系统对核仁的损伤作用.上述结果提示:H2O2可导致心肌细胞核仁结构损伤,HSP70表达及其向核仁的移位对上述损伤具有明显保护作用.

关键词：过氧化氢乳鼠心肌细胞核仁结构 HSP70

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核仁的结构和功能

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生物学通报 1991年第5期 13-13,12页

作者：吕桂芝北京肿瘤防治研究所细胞生物学室

细胞核中的核仁是一个重要的细胞结构,在细胞分裂周期中发生周期性的形态变化;在细胞分裂的早期核仁开始消失,中期和后期完全消失,分裂末期在一定的染色体上的特殊部位——核仁组织者(rRNA基因存在的地方)再次形成核仁结构,并逐渐增大,... 详细信息

细胞核中的核仁是一个重要的细胞结构,在细胞分裂周期中发生周期性的形态变化;在细胞分裂的早期核仁开始消失,中期和后期完全消失,分裂末期在一定的染色体上的特殊部位——核仁组织者(rRNA基因存在的地方)再次形成核仁结构,并逐渐增大,融合成一个或几个核仁,在间期细胞中核仁持续存在,核仁这种形态上的变化,称为核仁周期。核仁的结构和功能与细胞的代谢活动、增殖和分化相关,不同细胞的核仁类型、数目和大小都各不相同。核仁的类型不同的细胞的核仁形态很不相同,根据核仁成份和分布的不同可把核仁分为三种类型。 1.环状的核仁(ring-shaped) 核仁的最内层有一个大的纤维中心,由一束最致密的纤维成份相围绕,最外层仅有少量

关键词：核仁结构纤维内层致密型银染色镀银功能

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