检索结果-内蒙古大学图书馆

农业生物技术学报 2020年第11期28卷 2011-2022页

作者：袁超高洪波周磊韩一帆段志强贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室/动物科学学院

Prox1 (prospero-related homeobox protein 1)作为转录因子,在胚胎发育与癌症发生中具有重要作用。为预测和鉴定鸡(Gallus gallus) Prox1蛋白核定位信号(nuclear localization signal, NLS),首先对鸡Prox1蛋白进行截短表达,通过荧光观察和亚细胞定位分析确定其NLS所在区域。运用在线软件预测鸡Prox1蛋白截短体中假定的NLS (putative NLS, pNLS),构建鸡Prox1蛋白pNLS缺失体重组真核表达载体并转染细胞,通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位确定NLS;进一步将鉴定的鸡Prox1蛋白NLS进行保守性分析,并检测其对外源蛋白的核输入能力;另外,利用NLS点突变鉴定鸡Prox1蛋白NLS中的关键碱性氨基酸位点。结果表明,鸡Prox1蛋白N端(1～220 aa)具有细胞核定位特征,NLS预测结果显示其N端存在2个pNLS,分别为pNLS1 (KRRR)和pNLS2 (RAKRAR)。对pNLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位分析发现,pNLS1和pNLS2共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。另外,鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2基序在其他禽类、人(Homo sapiens)和不同哺乳动物间均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。此外,碱性氨基酸点突变实验证实,K15、R16、R18和K165、R166、R168分别是NLS1和NLS2的关键碱性氨基酸位点,这些位点共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。本研究证实鸡Prox1蛋白存在2个高度保守的NLS,两者共同决定细胞核定位,为后续研究鸡Prox1蛋白细胞核定位的分子机制及功能提供参考依据。

关键词：鸡 Prox1(prospero-related homeobox protein 1) 核定位信号亚细胞定位

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猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

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中国农业科学 2010年第7期43卷 1480-1486页

作者：郭龙军陆月华黄立平危艳武刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室/兽医生物技术国家重点实验室

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免... 详细信息

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。【结果】5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。【结论】本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白抗原表位多肽扫描核定位信号

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维生素D受体核定位信号的鉴定

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南京医科大学学报（自然科学版） 2022年第8期42卷 1073-1079页

作者：马泽萌陈允梓南京医科大学基础医学院免疫学系江苏南京211166

目的:确定维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)的核定位信号并验证其功能。方法:通过软件分析及文献调研预测VDR核定位信号,利用点突变试剂盒构建了VDR一系列点突变体,通过蛋白质免疫印迹检测VDR在胞质和胞核里的分布,并结合免疫荧光... 详细信息

目的:确定维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)的核定位信号并验证其功能。方法:通过软件分析及文献调研预测VDR核定位信号,利用点突变试剂盒构建了VDR一系列点突变体,通过蛋白质免疫印迹检测VDR在胞质和胞核里的分布,并结合免疫荧光观察确定其预测突变点对VDR入核的影响,最后采用实时荧光定量链式聚合酶反应(quantitative real-time PCR,qPCR)检测VDR下游基因的表达,以判断VDR核定位突变体的活性。结果:确定VDR核定位信号序列为49RRSMKRKALFLT61,构建的VDR一系列核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)点突变体在细胞内的表达主要分布在胞质里,维生素D(vitamin D,VD)既不能诱导这些点突变体入核,也不能促进VD下游基因表达。结论:VDR核定位确定信号能有效控制VDR进入细胞核发挥转录因子作用,进而影响其下游基因的表达,为探索VD及VDR相关疾病的治疗提供新平台和思路。

关键词：维生素D受体维生素D 核定位信号转录调控

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非洲猪瘟病毒A151R蛋白核定位信号的鉴定

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中国兽医科学 2022年第12期52卷 1552-1557页

作者：王裴倪温碧钟桂芳胡伯里周继勇浙江大学动物医学中心农业农村部动物病毒学重点实验室浙江杭州310058

为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白A151R发挥功能的亚细胞定位,通过荧光显微镜观察发现,A151R蛋白能够聚集在细胞核内。使用在线软件预测A151R中存在的核定位信号(NLS),并构建缺失NLS的A151R质粒。荧光共聚焦显微镜观察结果表明,缺失... 详细信息

为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白A151R发挥功能的亚细胞定位,通过荧光显微镜观察发现,A151R蛋白能够聚集在细胞核内。使用在线软件预测A151R中存在的核定位信号(NLS),并构建缺失NLS的A151R质粒。荧光共聚焦显微镜观察结果表明,缺失NLS的重组A151R蛋白A151RΔNLS无法进入细胞核。细胞核质分离结果显示,NLS序列能够协助EGFP进入细胞核,证明了NLS的核输入能力。以上证据均表明A151R依赖于NLS进入细胞核,为进一步研究其在ASFV复制中的功能提供了重要的信息。

关键词：非洲猪瘟病毒 A151R 核定位信号亚细胞定位

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SIPA1蛋白核定位信号确定及其调控ABCB1基因活性的机制研究

SIPA1蛋白核定位信号确定及其调控ABCB1基因活性的机制研究

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作者：马瑛华中科技大学

学位级别：博士

乳腺癌的新发病例位居女性肿瘤发病率之首。随着乳腺癌早期诊断以及治疗技术的飞速发展,大多数乳腺癌患者得到有效治疗,但是仍有部分恶性乳腺癌患者,尤其是高转移性的三阴性乳腺癌患者,由于癌细胞靶点不明或机体缺少特异性受体而难以得... 详细信息

乳腺癌的新发病例位居女性肿瘤发病率之首。随着乳腺癌早期诊断以及治疗技术的飞速发展,大多数乳腺癌患者得到有效治疗,但是仍有部分恶性乳腺癌患者,尤其是高转移性的三阴性乳腺癌患者,由于癌细胞靶点不明或机体缺少特异性受体而难以得到有效治疗,甚至出现药物耐受而导致治疗失败。因此亟需进一步解析癌细胞转移机制,寻找新的药物靶点以提升乳腺癌临床治疗效果。信号诱导增殖相关蛋白1(Signal-induced proliferation associated Protein1,SIPA1),是小G蛋白家族成员之一,能促进细胞内Rap1GTP水解,发挥Rap GAP活性。前期研究发现SIPA1蛋白在不同的肿瘤细胞中有不同的核质分布,且与多种肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等的增殖、转移相关。高转移性的三阴性乳腺癌组织和细胞中,SIPA1蛋白高表达并且呈现细胞核分布,乳腺癌细胞中SIPA1蛋白的核定位与乳腺癌的高转移性存在相关性,那么SIPA1这一130 k Da的蛋白是如何进入细胞核的?本论文首先将SIPA1蛋白序列与数据库中已报道的经典核定位信号序列进行比对,未发现SIPA1存在已知核定位信号。那么SIPA1蛋白中是否存在新的核定位信号?本论文构建了多个SIPA1蛋白缺失突变体并采用核质分离、免疫印迹、免疫荧光、共聚焦显微成像等技术检测其突变体核质定位,发现SIPA1蛋白N端核定位区域NLR(Nuclear Localization Region)(140-179aa)结构序列是决定SIPA1蛋白在细胞中核质分布的关键区域。进一步研究表明此肽段能够引导已知定位于细胞质的GFP-GFP(2×GFP)蛋白定位于细胞核中。对NLR肽段进行精细结构分析,此肽段三级结构是首尾两个β折叠,中间由无规则卷曲相连的。此SIPA1-NLR(140-179aa)特殊空间结构可能介导SIPA1蛋白核定位。细胞内的核转运蛋白识别货物蛋白上的NLS(Nuclear Localization Signal)后,转运货物蛋白进入细胞核。为了探究细胞内识别SIPA1-NLR的核转运蛋白,本论文分析了前期免疫共沉淀、质谱实验结果,发现在MDA-MB-231细胞中SIPA1蛋白可能与核转运蛋白Importin7、Importinβ1结合。为了进一步确定与SIPA1结合的核转运蛋白,本论文构建了SIPA1-NLR原核表达质粒,采用原核表达外源蛋白及纯化体系获得带有GST标签的NLR蛋白。免疫共沉淀实验检测到SIPA1-NLR与核转运蛋白Importin7结合。此结果表明SIPA1-NLR可能是通过与核转运蛋白Importin 7结合,实现SIPA1蛋白由细胞质向细胞核的转运。为了明确细胞中核、质定位的SIPA1蛋白所发挥的功能,本论文中构建了稳定过表达SIPA1全长或SIPA1-ΔNLR蛋白的乳腺癌MCF7细胞系MCF7/SIPA1和MCF7/SIPA1-ΔNLR。研究发现过表达SIPA1全长的MCF7/SIPA1细胞的迁移能力较MCF7细胞显著提高;而过表达缺失NLR肽段的SIPA1蛋白的MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞的迁移能力与MCF7细胞的迁移能力相比无显著性变化。此结果表明SIPA1-NLR结构域能够改变SIPA1蛋白促乳腺癌细胞迁移的能力。前期研究发现过表达SIPA1蛋白能够导致原本对化疗药物表阿霉素敏感的MCF7细胞变得不敏感。本论文中使用表阿霉素处理多种乳腺癌细胞,发现乳腺癌细胞中SIPA1蛋白的表达水平及其核质分布与该细胞对表阿霉素的敏感性直接相关。SIPA1高表达且核定位的BT549细胞对表阿霉素表现为不敏感;SIPA1低表达的MCF7细胞对表阿霉素处理表现为敏感。本论文中使用表阿霉素分别处理MCF7/SIPA1和MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞后,MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞与MCF7/SIPA1细胞相比对表阿霉素变得敏感。核定位的SIPA1蛋白是如何改变乳腺癌细胞的药物敏感性?前期研究结果显示,高表达SIPA1的MDA-MB-231细胞经表阿霉素处理后,细胞中多种耐药基因如ABCB1、ABCG2的mRNA表达水平比SIPA1敲低的MDA-MB-231/sh-sipa1细胞中相应的基因表达水平显著升高。本论文检测了MCF7/SIPA1和MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞中上述耐药基因的mRNA表达水平,同样发现MCF7/SIPA1细胞中的多药耐药基因ABCB1的mRNA表达水平与MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞中ABCB1的mRNA表达水平相比显著升高;而MCF7/SIPA1-ΔNLR细胞中ABCB1的mRNA表达水平与MCF7细胞中的ABCB1的mRNA表达水平相比无显著差异,且均较低。上述结果表明SIPA1蛋白的NLR结构域不仅能介导SIPA1蛋

关键词：乳腺癌核质转运核定位信号 SIPA1蛋白药物敏感性耐药基因ABCB1

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人核因子κBp65核定位信号缺失突变对A549细胞恶性表型的影响

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中国呼吸与危重监护杂志 2015年第1期14卷 52-59页

作者：黄艳吴春婷郭红娟朱光发首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所呼吸与危重症医学科北京100029

目的鉴定人核因子κB(NF-κB)p65核定位信号(NLS)缺失突变质粒即pc DNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(简称NF-κBp65ΔNLS)的表达功能,以及其对低表达NF-κBp65的A549细胞株即A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移和粘附能力的影响。方法培养人A... 详细信息

目的鉴定人核因子κB(NF-κB)p65核定位信号(NLS)缺失突变质粒即pc DNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(简称NF-κBp65ΔNLS)的表达功能,以及其对低表达NF-κBp65的A549细胞株即A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移和粘附能力的影响。方法培养人A549/NF-κBp65 shRNA细胞株,分为对照组、转染pc DNA3.1(+)组、转染NF-κBp65ΔNLS组。应用间接免疫荧光、实时荧光定量-PCR和Western blot技术检测NF-κBp65的细胞内定位及mRNA、蛋白表达水平的变化;应用MTT、Transwell和细胞粘附实验分析转染NF-κBp65ΔNLS质粒对A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移、粘附能力的影响。结果成功构建人NF-κBp65ΔNLS真核表达质粒。转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,NF-κBp65 mRNA表达水平明显上调(10.63±0.84比1.04±0.21和1.23±0.22,P<0.01),NF-κBp65蛋白表达水平明显升高(1.07±0.06比0.53±0.02和0.59±0.04,P<0.01),且NF-κBp65蛋白主要位于细胞浆内,在肿瘤坏死因子α刺激后NF-κBp65蛋白并未明显进入细胞核。与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力均有不同程度增强。结论通过基因突变技术构建无NLS的NF-κBp65真核表达质粒,可明显增强A549/NF-κBp65shRNA细胞株内NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平,并使NF-κBp65蛋白定位于细胞浆内;同时,细胞浆内过表达NF-κBp65ΔNLS蛋白可明显增强A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力,提示滞留于细胞浆内的NF-κBp65仍可通过影响NF-κB信号通路相关蛋白参与调节肺癌细胞的生物学行为。

关键词：核因子κB p65 核定位信号肺癌增殖迁移粘附

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小麦中带有核定位信号NAC转录因子的鉴定及分析

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河北农业大学学报 2021年第6期44卷 9-16页

作者：耿怀民张艳俊李聚贤崔钟池王菲王海燕刘大群河北农业大学植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治技术创新中心河北保定071000 邢台职业技术学院资源与环境工程系河北邢台054000

NAC(NAM/ATAF/CUC)是植物特有的一类转录因子,在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。本研究从小麦基因组中鉴定出9个C末端带有核定位信号的NAC转录因子,对其理化性质、系统发育模式、保守基序进行了分析。结果表明,这9个NAC转录因子均... 详细信息

NAC(NAM/ATAF/CUC)是植物特有的一类转录因子,在生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。本研究从小麦基因组中鉴定出9个C末端带有核定位信号的NAC转录因子,对其理化性质、系统发育模式、保守基序进行了分析。结果表明,这9个NAC转录因子均是亲水蛋白,分子量范围在19.63~28.92 kD之间,等电点范围在8.40~9.87之间,同一亚族成员具有相似的保守基序。对这9个NAC转录因子在小麦与条锈菌、赤霉菌互作过程中的表达变化进行了模拟分析,发现TaNACL-B1和TaNACL-D1的表达受条锈菌和赤霉菌的诱导。利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测了接种叶锈菌的小麦中TaNACL-A1、TaNACL-B1和TaNACL-D1的表达模式,结果显示,3个基因的表达量在小麦与叶锈菌亲和互作与非亲和互作中存在明显差异,均在12~72 h呈上升趋势,在亲和组中的表达量高于非亲和组,表明它们可能在小麦与叶锈菌互作过程中发挥负调控作用。综上所述,本研究初步筛选到了与小麦抗病相关的带有核定位信号的NAC转录因子,为研究NAC转录因子在小麦与病原物互作过程中的作用提供了参考。

关键词：小麦 NAC转录因子核定位信号生物信息学分析叶锈菌

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JC病毒VP2蛋白的抗原抗体制备及核定位信号与入核转运受体的鉴定

JC病毒VP2蛋白的抗原抗体制备及核定位信号与入核转运受体的鉴定

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作者：王殿丽大连医科大学

学位级别：硕士

目的:JC病毒属于人类多瘤病毒属,是一种重要的机会感染性疾病病原体。JC病毒广泛分布于人群中,有80﹪的成人血清学检测为阳性[1]。当免疫力低下时,JC病毒会引发多灶性脑白质病(PML)[2]。然而,JC病毒的临床检测,以及它的包膜蛋白VP2入核... 详细信息

目的: JC病毒属于人类多瘤病毒属,是一种重要的机会感染性疾病病原体。JC病毒广泛分布于人群中,有80﹪的成人血清学检测为阳性[1]。当免疫力低下时,JC病毒会引发多灶性脑白质病(PML)[2]。然而,JC病毒的临床检测,以及它的包膜蛋白VP2入核的机制和入核转运受体并不清楚。本研究拟通过原核表达、抗体制备、核定位信号鉴定和入核转运受体的鉴定几个方面初步阐释JC病毒的小包膜蛋白VP2基因在PML发生发展过程中的生物学功能。方法: (1)构建原核表达载体pET-32a(+)-VP2,转化BL21宿主菌后经IPTG诱导,获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达。 (2)利用Ni+亲和柱纯化表达蛋白并免疫BALB /c小白鼠,获得抗VP2多克隆抗体。以纯化VP2为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。 (3)构建重组绿色荧光表达载体pEGFP-C1-VP2,转染7402细胞,24hr后观察各截短体的亚细胞定位情况。 (4)表达纯化pGEX-2T-importin(importinα1、3、5、7和imporinβ)的GST融合蛋白。 (5)通过GST-pull down方法,寻找并确定VP2的入核转运受体。结果: (1)通过PCR方法从病人的脑脊液中获得VP2的目的片段,并成功构建了pET-32a(+)-VP2原核表达载体。pET-32a(+)-VP2原核表达载体在IPTG的诱导作用下,成功表达融合蛋白通过Ni+亲和层析法获得了融合蛋白纯品。 (2)用纯化的VP2融合蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备了高效价,高特异性的鼠抗VP2多克隆抗体。通过ELISA法表明多克隆抗体效价>1:160,000, Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。 (3)通过PCR方法获得了VP2截短体的目的片段,成功构建了VP2各截短体的绿色荧光表达载体;将构建好的VP2各截短体绿色荧光表达载体转染7402人肝癌细胞,通过各截短体的亚细胞定位分析出了VP2蛋白的核定位信号为946-972段。 (4)成功表达纯化了五个pGEX-2Timportin融合蛋白。 (5)通过GST-pull down实验,分析发现VP2能够与入核转运受体蛋白importinα1、importinα3结合,从而被转运入细胞核,发挥它的生理和生化作用。结论: 1.我们成功构建了pET-32a(+)- Vp2原核表达载体,在IPTG的诱导下,成功表达纯化了VP2融合蛋白。这就为抗体的制备以及研究VP2蛋白与其它蛋白的相互作用做了物质上的准备。 2.将VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了高效价、高特异性的鼠抗VP2多克隆抗体。这对于VP2抗原的检测,以及免疫组化奠定了基础。 3.成功的鉴定出VP2的核定位信号,通过构建四个pEGFP-C1-Vp2绿色荧光载体,脂质体转染7402细胞株,在荧光显微镜下观察pEGFP-C1-Vp2各截短体的亚细胞定位。这是第一次鉴定出VP2的核定位信号,为进一步的研究提供了信息。 4.通过GST-pull down方法,我们成功的鉴定出VP2的入核转运受体为importinα1、importinα3。初步阐明了VP2入核过程中参与的入核转运受体。

关键词： VP2蛋白表达纯化多克隆抗体核定位信号入核转运受体

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转录因子AP-2β核定位信号突变对PDA相关疾病基因的影响

转录因子AP-2β核定位信号突变对PDA相关疾病基因的影响

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作者：张凯湖南师范大学

学位级别：硕士

动脉导管未闭(patent ductus arteriosus,PDA)是一类婴幼儿常见的先天性心血管发育畸形病,在足月活产新生儿中的发病率约为0.5‰,是人类重大先天性疾病之一,严重威胁着人类生命健康。TFAP2B(transcription factor AP-2 beta)是神经嵴来... 详细信息

动脉导管未闭(patent ductus arteriosus,PDA)是一类婴幼儿常见的先天性心血管发育畸形病,在足月活产新生儿中的发病率约为0.5‰,是人类重大先天性疾病之一,严重威胁着人类生命健康。TFAP2B(transcription factor AP-2 beta)是神经嵴来源的特异性转录因子,能够促进下游靶基因的转录,调控心肌细胞结构蛋白或心脏相关基因蛋白的表达,参与细胞周期调控、神经嵴细胞分化等过程,最终促进动脉导管的闭合。近年来,国内外学者关于TFAP2B与PDA的相关性研究主要在TFAP2B的转录激活区、DNA结合区和二聚化区,而针对TFAP2B核定位信号区的突变分析较少,本课题首次对TFAP2B的核定位信号突变进行了研究。首先我们分析筛选了 TFAP2B SNP位点,得到TFAP2B 三个点突变 A275D(rs80338914)、R285Q(rs80338915)、R300C(rs80338917),单荧光素酶报告实验分析表明A275D、R285Q、R300C突变显著下调TFAP2B的转录活性。通过对TFAP2B物种之间的同源性分析和转录因子AP2家族成员之间的同源性分析以及在线网站NLStradamus预测,成功得到TFAP2B核定位信号区的结构序列,并发现A275D、R285Q、R300C突变位于TFAP2B的核定位信号区。我们进一步通过细胞免疫荧光染色和细胞核、质蛋白Western blotting,证实了 A275D、R285Q、R300C 突变改变了 TFAP2B 蛋白在细胞中的定位,说明这3个突变确实位于TFAP2B的核定位信号区。通过单荧光素酶报告实验发现,在A275D、R285Q、R300C突变定量的情况下,提高TFAP2B的转录辅助激活因子CITED2的剂量并不能增强A275D的转录活性,而R285Q、R300C突变的TFAP2B转录活性会随着CITED2的剂量的增加而有所提高,说明CITED2在一定程度上可以激活恢复TFAP2B的转录活性。与此同时,我们还用单荧光素酶报告实验,证实了提高A275D、R285Q、R300C突变的剂量会改变WTTFAP2B的转录活性,表明A275D、R285Q、R300C突变可能会对WTTFAP2B产生显性负调控作用。接下来,我们又用实时荧光定量PCR检测到A275D、R285Q、R300C突变改变了 TFAP2B下游与 PDA 相关基因(CACNA1G,CACNB2,KCNA2,BMP2,BMP4,Et-1,ERBB3)的mRNA表达水平,而这些相关基因的mRNA水平产生的上调或下调的变化,会导致这些基因所在的信号通路产生异常,最终引发PDA。以上所有结果可以为阐明PDA的发生机理提供了一定的理论依据。

关键词：动脉导管未闭转录因子激活蛋白-2β 核定位信号单核苷酸多态性 PDA相关基因

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猪圆环病毒衣壳蛋白核定位信号对其复制的影响及突变体病毒的免疫原性研究

猪圆环病毒衣壳蛋白核定位信号对其复制的影响及突变体病毒的免疫...

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作者：帅江冰浙江大学

学位级别：博士

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科,圆环病毒属,无囊膜,直径约17nm,是最小的动物病毒之一,其因组为一单链环状DNA。PCV分为两个基因型,PCV1无致病性,广泛存在于猪群中。而PCV2被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)... 详细信息

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科,圆环病毒属,无囊膜,直径约17nm,是最小的动物病毒之一,其因组为一单链环状DNA。PCV分为两个基因型,PCV1无致病性,广泛存在于猪群中。而PCV2被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要致病因子,可引起消瘦、可视黏膜苍白、呼吸困难、间歇性腹泻及淋巴结肿胀等症状,对养猪业构成了严重威胁。PCVl和PCV2均包含ORF1、ORF2和ORF3三个主要的开放阅读框。其中ORF2编码病毒的衣壳蛋白,并且是PCV2的主要毒力因子和免疫原性蛋白。研究表明,植物单链环状病毒核衣壳蛋白核定位信号(NLS)的破坏或缺失直接导致ssDNA积聚减少,从而影响病毒的复制增殖。核衣壳蛋白有可能通过与复制相关蛋白的作用而参与调节病毒基因组的复制。对PCV2核衣壳蛋白的研究将有助于深入了解病毒复制、致病性,开发有效的病毒疫苗。而猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪多系统衰竭综合征的病原之一,严重影响养猪业的健康发展,目前还没有有效疫苗。本项目以PCV2 ORF2为基础,在对浙江省及周边地区猪场PCV2感染血清学和分子流行病学调查的基础上,比较深入地开展了PCV核衣壳蛋白核定位信号对PCV2复制的影响和重组病毒的免疫原性研究。由于该病毒在体外培养细胞中的增殖较慢,是影响疫苗研发的瓶颈问题,本研究针对PCV2复制问题开展的研究,具有重要的理论和实际意义。首先,分别应用PCR和ELISA方法对2003-2007年浙江省及其周边上海、江苏等地猪场采集的169份病猪组织和1779份血清进行了PCV2及其特异性抗体的检测。结果显示,淋巴结中PCV2的PCR阳性率为52.07%(88／169),猪群PCV2抗体阳性率为46.0%(819／1779)。其中断奶后仔猪(54.1%,223／412)和肥育猪血清(49.9%,423／848)PCV2抗体阳性率显著高于哺乳仔猪的阳性率(33.3%,173／519)。进一步扩增27株2004-2007年不同地区PCV2毒株的ORF2基因,进行测序并分析其分子流行特点。结果显示该地区PCV2毒株彼此间核苷酸的同源性较高(98%-100%),但与国内其它地区或国外毒株相比具有明显的氨基酸变异,特别是衣壳蛋白的两个主要抗原表位区内氨基酸位点变异率非常高,导致其亲水性发生明显改变。遗传进化分析发现该地区的所有PCV2毒株与部分国内毒株处于同一分支内,而与大部分国内或国外的PCV2毒株亲缘关系较远。以上结果说明PCV2感染在浙江省及周边省市呈广泛流行并呈上升趋势,而且其毒株具有独特的分子特征。 PCV衣壳蛋白在胞浆内合成后通过其自身核定位信号的作用转运至细胞核内参与病毒的复制和组装。预测结果表明PCV1 ORF2蛋白的N端也含有多个可能的单一型或双分型核定位信号序列(NLS)。本研究将PCV1 ORF2及其突变体与eGFP融合,插入真核表达质粒pcDNA3,使其能融合表达两个不同基因。转染细胞后观察荧光,以分析和确证PCV1 ORF2蛋白中的核定位元件。试验结果表明,PCV1 ORF2蛋白C端190个氨基酸缺失后不影响融合蛋白的核定位,即蛋白均集中于细胞核内,与野生型ORF2-EGFP融合蛋白一致。而其N端43位氨基酸序列的缺失导致融合蛋白丧失了核定位功能而使蛋白散布于PK-15细胞的胞浆内。这说明PCV1 ORF2蛋白的核定位功能由其N端序列决定。进一步对N端NLS序列中的碱性氨基酸残基分别进行点突变,结果表明氨基酸短肽9RRRR12的突变和25RRPYLAHPAFRNRYRWRRK43中后6个碱性氨基酸的突变导致融合表达产物分布于整个细胞,丧失了完整的核定位功能,说明这两个序列为PCV1 ORF2蛋白的核定位元件,与PCV2 ORF2蛋白的NLS有较大差异。应用反向遗传学技术可以详细研究病毒的基因结构和编码蛋白的功能。我们将PCV2基因组克隆入pUC-18载体,并在其3’端亚克隆入一段重复序列,构建了mPCV2感染性克隆。其中的重复序列有助于DNA在细胞内通过同源重组自身环化并从质粒中释放。以同样策略构建了PCV1基因组为骨架、含有PCV2ORF2的杂合型PCV12感染性克隆以及PCV2 ORF2核定位信号序列(NLS)被PCV1 ORF2相应序列替换的PCV2-2NLS1和PCV12-2NSL1两种杂合型感染性克隆,以研究PCV核定位信号元件对于病毒复制的影响。结果表明4个感染性克隆转染PK-15细胞后均能产生感染性的病毒粒子。连续传代稳定后,mPCV2和PCV12病毒分别能达到105.5和105TCID50/ml,滴度与野毒株PCV2相似。而杂合病毒PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1的滴度则显著低于野毒P

关键词：猪圆环病毒核衣壳蛋白核定位信号

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