检索结果-内蒙古大学图书馆

中国细胞生物学学报 2018年第6期40卷 955-961页

作者：黄希仕李瑞瑞黄岚珍阳晶吴群英蒋晓山桂林医学院细胞信号转导实验室桂林541004 桂林医学院科学实验中心桂林541004 桂林医学院细胞与遗传教研室桂林541004 桂林医学院研究生学院桂林541004

G蛋白偶联受体激酶6(G protein-coupled receptor kinase 6,GRK6)依赖去棕榈酰化修饰及特定核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)实现胞核定位,但NLS的关键基团及其对激酶活性的影响尚不清楚。该研究首先通过构建一系列缺失... 详细信息

G蛋白偶联受体激酶6(G protein-coupled receptor kinase 6,GRK6)依赖去棕榈酰化修饰及特定核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)实现胞核定位,但NLS的关键基团及其对激酶活性的影响尚不清楚。该研究首先通过构建一系列缺失突变子,初筛去棕榈酰化条件下GRK6的NLS结构域;然后采用点突变技术进一步确定NLS结构域中Lys(K)^(389)、Lys(K)^(390)、Lys(K)^(3913)个关键基团;最后通过检测内源性毒蕈碱M3受体介导的细胞内钙流,证实NLS突变子对M3受体介导的细胞内钙流信号的抑制作用无明显影响。该研究为进一步揭示GRK6胞核转运机制及其功能提供了有价值的信息。

关键词： GRK6 去棕榈酰化核定位信号 G蛋白偶联受体激酶

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

鹅细小病毒反向遗传学操作系统搭建及其在衣壳蛋白核定位信号定向改造中的应用

鹅细小病毒反向遗传学操作系统搭建及其在衣壳蛋白核定位信号定向...

引用

作者：刘鹏四川农业大学

学位级别：硕士

小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)感染引起的鹅病毒血症及肠道栓塞的传染病。鹅细小病毒感染性克隆的构建是研究鹅细小病毒致病和复制机制的重要技术平台。经典核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)是一段由精氨酸... 详细信息

小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)感染引起的鹅病毒血症及肠道栓塞的传染病。鹅细小病毒感染性克隆的构建是研究鹅细小病毒致病和复制机制的重要技术平台。经典核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)是一段由精氨酸和赖氨酸组成的一段特殊序列,含有经典NLS序列的蛋白可以被细胞质的內输蛋白识别并协助该蛋白通过核孔复合体(Nuclear pore complex,NPC)进入细胞核。NLS对细小病毒完成生命周期具有关键性作用,但GPV NLS仍未被揭示。本研究将以临床分离GPV RC16株为模板构建其感染性克隆,并基于此平台探讨病毒衣壳蛋白核定位功能的氨基酸在病毒增殖中的作用,为GPV致弱疫苗的研发奠定基础。首先本研究以临床分离GPV RC16株病毒为模板,通过对其基因组进行扩增、亚克隆片段测序、拼接,并基于拼接的基因组序列绘制分子系统进化树,分子系统进化树分析结果表明该分离的毒株为鹅细小病毒。在此基础上,通过同源重组的方法依次连接亚克隆片段,构建了含有GPV RC16株全长基因组的质粒并命名为pIGPV RC16;通过脂质体转染的方法将pIGPV RC16转染原代鹅胚成纤维细胞(Goose embryo fibroblasts,GEF)以拯救病毒,并通过间接免疫荧光、遗传标记的鉴定及PCR产物测序的方法,证实病毒拯救成功;对第2代重组病毒的生长曲线进行测定,结果表明第2代病毒可在GEF细胞上进行复制。本研究基于PSORT II在线预测软件,对GPV结构蛋白(VP)1进行NLS序列预测,结果表明,在VP1第160位到171位氨基酸序列之间存在富含赖氨酸的基础区域(Basic region,BR),该BR(YPVVKKPKLTEE)区疑似NLS。基于此预测,本研究构建了pEGFP-GPV NLS并转染细胞,以直接观察GFP蛋白定位的方法,证实BR(YPVVKKPKLTEE)可以将小分子量蛋白(GFP,分子量27 kDa)携带入细胞核;同时,本研究构建了pEGFP-GPV NLS-β-Gal并转染细胞,以SV40强核定位信号PKKKRKV构建pEGFP-SV40 NLS转染细胞为阳性对照,以直接观察GFP融合蛋白定位的方法,证实BR(YPVVKKPKLTEE)无法将大分子量蛋白(β-Gal,分子量100kDa)携带入细胞核。综上,GPV结构蛋白的BR(YPVVKKPKLTEE)具备核定位功能,但并非强核定位信号。进一步,本研究分别构建VP1中164K,165K和167K氨基酸位点丙氨酸突变的GFP融合蛋白真核表达质粒,转染细胞并观察荧光的细胞定位情况,发现第164位、165位和167位赖氨酸在将VP1定位到细胞核的过程中发挥关键作用。为了揭示VP1第164位、165位和167位赖氨酸在鹅细小病毒增殖中的作用,本研究通过重叠PCR方法构建NLS突变的感染性克隆并命名为pIGPV RC16K164A、pIGPV RC16K165A和pIGPV RC16K167A,将其转染GEF后发现无法拯救突变病毒,表明NLS关键位点164K、165K和167K是子代病毒复制所必需的。本研究首先构建了GPV RC16株感染性克隆,并在GEF上成功拯救重组病毒;鉴定了鹅细小病毒NLS为YPVVKKPKLTEE,并揭示其关键氨酸位点为164K、165K和167K;基于感染性克隆操作平台,构建了NLS关键位点164K、165K和167K突变的病毒,并证明164K、165K和167K三位点是子代病毒的增殖所必需的。本研究为进一步获得GPV弱毒疫苗候选株奠定基础。

关键词：鹅细小病毒衣壳蛋白核定位信号感染性克隆病毒增殖

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

叶酸和核定位信号介导载药纳米胶束的肿瘤细胞靶向作用研究

叶酸和核定位信号介导载药纳米胶束的肿瘤细胞靶向作用研究

引用

作者：谢鑫南昌大学

学位级别：硕士

为提高聚合物胶束抗肿瘤的主动靶向能力，本课题以胆固醇疏水改性壳聚糖(CHGC)为基本骨架，表面饰以叶酸和(或)NLS，得到新型纳米胶束，并以疏水性阿霉素为模型药物、香豆素6为探针，来研究其体外细胞作用。<br>　　目... 详细信息

为提高聚合物胶束抗肿瘤的主动靶向能力，本课题以胆固醇疏水改性壳聚糖(CHGC)为基本骨架，表面饰以叶酸和(或)NLS，得到新型纳米胶束，并以疏水性阿霉素为模型药物、香豆素6为探针，来研究其体外细胞作用。<br>　　目的：研究叶酸修饰的纳米胶束的体外细胞毒性、细胞摄取。研究核定位信号修饰的纳米胶束的体外细胞毒性、细胞摄取和细胞核转运方式。研究叶酸和核定位信号修饰的纳米胶束的体外细胞毒性、细胞摄取、内体溶酶体逃逸能力和细胞核转运方式。<br>　　方法：应用乳化.溶剂挥发法制备载阿霉素叶酸修饰纳米胶束，并研究其理化性质；采用MTT法检测载阿霉素纳米胶束对A549细胞和HeLa细胞产生的毒性作用；激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪(FCM)观察HeLa细胞对叶酸修饰的纳米胶束的摄取行为。应用乳化-溶剂挥发法制备载阿霉素核定位信号纳米胶束，并研究其理化性质；采用MTT法检测载阿霉素纳米胶束对HeLa和MCF-7/ADR细胞的毒性作用；激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪(FCM)观察载阿霉素纳米胶束在HeLa细胞的分布；应用内吞抑制剂(盐酸阿米洛利、盐酸氯丙嗪和染料木素)考察其对载阿霉素纳米胶束入胞方式的影响；CLSM观察WGA对DNCFtGC纳米胶束在HeLa细胞内的入核影响。应用乳化.溶剂挥发法制备载阿霉素和载香豆素6纳米胶束，并研究其理化性质；采用MTT法检测载阿霉素纳米胶束对A549细胞和KB细胞毒性作用；激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪(FCM)观察载香豆素6纳米胶束在KB细胞的分布和摄取作用；应用内吞抑制剂(盐酸阿米洛利、盐酸氯丙嗪和染料木素)考察其对载香豆素6纳米胶束入胞方式的影响；CLSM观察CNFCHGC-3纳米胶束在KB细胞内体.溶酶体中的逃逸状况，以及WGA和NEM对CNFCHGC-3纳米胶束在KB细胞内入核的影响。<br>　　结果：制备了载阿霉素DCHGC-1和DFCHGC-1胶束，两种胶束的体外释放行为均呈两相模式，平均粒径分别为251 nm、266 nm。HeLa细胞48 h毒性实验显示，叶酸修饰的载药胶束的毒性作用强于游离阿霉素和未接叶酸的纳米胶束，游离阿霉素的IC50分别是DCHGC-1和DFCHGC-1纳米胶束的2.1倍和5.4倍；A549细胞48 h毒性实验显示，游离阿霉素的IC50分别是DCHGC-1和DFCHGC-1纳米胶束的2.4倍和1.5倍。载阿霉素纳米胶束与HeLa细胞共孵育0.5 h和4 h后，CLSM结果表明，叶酸修饰的纳米胶束可以介导更多药物进入叶酸受体表达丰富的HeLa细胞。内吞抑制剂处理后，CLSM结果说明DFCHGC-1的细胞摄取以吞噬作用和网格蛋白介导为主要途径。制备载阿霉素DCHGC-2和DNCHGC-2胶束，其药物体外释放均呈两相模式，平均粒径分别为246 nm、248 nm。HeLa细胞48h毒性实验显示，核定位修饰的载药胶束的毒性作用强于游离阿霉素和未经修饰的纳米胶束，游离阿霉素的IC50分别是DCHGC-2和DNCHGC-2纳米胶束的2.3倍和7.0倍；MCF-7/ADR细胞48 h毒性实验显示，游离阿霉素的IC50分别是DCt-IGC.2和DNCHGC-2纳米胶束的3.5倍和13.5倍。载阿霉素纳米胶束与HeLa细胞共孵育4h，内吞抑制剂处理后，FCM和CLSM结果表明，NLS修饰的纳米胶束能够进入细胞核，并主要通过小窝蛋白途径和吞噬途径进入细胞。WGA处理后，DNCHGC-2与HeLa细胞共孵育1 h，CLSM结果表明，DNCHGC-2在HeLa细胞其入核过程主要通过核定位信号途径，不是糖蛋白途径。制备叶酸和核定位修饰的载阿霉素纳米胶束和载香豆素6纳米胶束，载阿霉素纳米胶束体外释放呈两相模式。KB细胞48 h毒性实验表明，叶酸和核定位修饰的载阿霉素纳米胶束的毒性作用强于游离阿霉素、叶酸修饰的纳米胶束、NLS修饰的纳米胶束和未经修饰的纳米胶束，游离阿霉素的IC50.分别是DCHGC-3、DFCHGC-3、DNCHGC-3和DNFCHGC-3纳米胶束的1.7倍、16.1倍、10.0倍和27.1倍；A549细胞48h毒性实验表明，游离阿霉素的IC50分别是DCHGC-3、DFCHGC-3、DNCHGC-3和DNFCHGC-3纳米胶束的2.9倍、1.5倍、3.1倍和1.7倍。载香豆素6纳米胶束与KB细胞共孵育4h，CLSM和FCM结果都表明，叶酸和NLS双重修饰载香豆素6纳米胶束具备提高载香豆素6胶束靶向进入细胞浆，细胞核的能力。内吞抑制剂处理后，FCM和CLSM结果表明，CNFCHGC-3在KB细胞摄取主要通过小窝蛋白介导途径进入细胞，2 h主要分布在内体.溶酶体，4 h出现在胞浆中，6h胞浆明显同时分布

关键词：叶酸核定位信号载药纳米胶束主动靶向给药肿瘤细胞细胞毒性

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送

引用

中国生物工程杂志 2004年第5期24卷 61-63,19页

作者：吴国清朱旭东刘娟党颖李少林黄培堂军事医学科学院生物工程研究所重庆医科大学重庆400016

增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可... 详细信息

增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可望用于转录治疗等研究领域。

关键词： TAT 核定位信号增强型绿色荧光蛋白蛋白质转导结构域细胞核

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

鸭圆环病毒核酸探针检测方法的建立及Cap蛋白核定位信号的研究

鸭圆环病毒核酸探针检测方法的建立及Cap蛋白核定位信号的研究

引用

作者：邹金峰山东农业大学

学位级别：硕士

鸭圆环病毒（Duck circovirus,DuCV）是圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）的新成员。DuCV感染可导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状。本研究建立了核酸探针检测鸭圆环病毒的方法,并用此方法对鸭圆环病毒的... 详细信息

鸭圆环病毒（Duck circovirus,DuCV）是圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）的新成员。DuCV感染可导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状。本研究建立了核酸探针检测鸭圆环病毒的方法,并用此方法对鸭圆环病毒的流行病学进行了调查,同时借助杆状病毒-昆虫细胞表达系统对DuCV Cap基因进行表达并对其核定位信号进行了研究。以DuCV传染性克隆为模板制备了检测DuCV的核酸探针,研究表明该探针特异性强,只能与DuCV核酸发生特异性杂交,而与对照的鸭病毒性肝炎Ⅰ型（DHV-1）病毒、鸭瘟病毒（DPV ）的核酸杂交反应为阴性;灵敏度高,最低检出量为5pg;使用方便,适合于批量检测。应用该探针对从山东、江苏、四川等地采集的196只鸭病料,共1025份脏器的组织DNA进行检测,结果个体阳性率为33.2%,在各脏器中法氏囊、肝脏、脾脏的DuCV检出率较高,检出率分别为52.3%、49.2%、38.5%。通过PCR方法扩增完整的Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBac TMHTB杆状病毒载体中,将筛选的阳性重组载体pF-CP,转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞中,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Westernblot和间接免疫荧光（IFA）试验结果表明,本研究成功构建了表达鸭圆环病毒Cap蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性。 DuCV FJ0601株Cap蛋白N端存在36个碱性氨基酸（AA）,通过软件PROSITE分析发现此区域存在两个二分裂核定位信号（Bipartite nuclear localization signal）,分别位于Cap蛋白N端的第2～17位AA和第21～36位AA。为进一步研究鸭圆环病毒Cap蛋白的生物学功能,我们构建了一系列Cap相关的融合表达质粒,对其核定位信号区进行了相关研究。首先将强型绿色荧光蛋白（EGFP）插入pFastBacTM HTB载体,构建pF-EGFP重组质粒,然后构建pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N（N端缺失2-17个AA）和pF-EGFP-CP-Δ36N（N端缺失2-36个AA）三个重组质粒分别转染Sf9昆虫细胞。结果显示pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N蛋白定位在细胞核中,而pF-EGFP-CP-Δ36N蛋白定位在胞质中,这一结果证实了PROSITE软件预测的DuCV Cap中的核定位信号为功能性核定位信号。

关键词：鸭圆环病毒 Cap基因杆状病毒表达系统间接免疫荧光核定位信号

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

斑马鱼缺氧诱导因子-3α核定位信号的研究

斑马鱼缺氧诱导因子-3α核定位信号的研究

引用

作者：姚青中国海洋大学

学位级别：硕士

缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors, HIFs)是最主要的能够应答细胞内氧气浓度的降低而对多种基因进行调控的转录因子家族,与生物体的生长、发育及一些疾病的发病机理都有着密切的联系。由于生物体内缺氧现象较为普遍,所以有关HIF... 详细信息

缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors, HIFs)是最主要的能够应答细胞内氧气浓度的降低而对多种基因进行调控的转录因子家族,与生物体的生长、发育及一些疾病的发病机理都有着密切的联系。由于生物体内缺氧现象较为普遍,所以有关HIF的结构、功能以及与多种疾病之间的关系等一直是热门的研究领域。HIF是一种异源二聚体蛋白,由α亚基和β亚基组成,其中α亚基受细胞内氧气浓度精密调控,对HIF功能的发挥是十分关键的。哺乳动物中HIF-α一共有三个成员,分别称为HIF-1α,HIF-2α和HIF-3α,三者在蛋白结构上较为保守。在缺氧状态下,HIF-α得到稳定积累并进入细胞核与HIF-1β结合形成有功能的转录复合体调控相关基因的表达。根据对HIF-1α和HIF-2α的研究可知,HIF-α无论在蛋白稳定性还是其对靶基因的转录激活功能方面都受到细胞内多条途径的调节。作为转录因子,HIF-α蛋白是否能从细胞质成功被转运进入细胞核是其发挥功能的前提,所以针对HIF-α在细胞中亚定位的研究十分必要。已知分子量大于50kDa的蛋白质不同于小分子,它们需要通过消耗能量的主动运输过程才能穿越核孔复合体进入到细胞核中,在这些蛋白结构上往往存在特殊的核定位信号(nuclear localization signal, NLS)使得能够蛋白质被成功转运入核内。文献报道,在细胞中检测外源性或内源性的HIF-1α和HIF-2α蛋白发现两者均能够定位于细胞核中,并且缺氧能够诱导两种蛋白的表达全部集中于核内。在HIF-1α和HIF-2α的蛋白结构中,研究者已经发现并证明了核定位信号存在的具体位点。在它们的C-端区域都包含有一段富含碱性氨基酸(Lys和Arg)的片段,当这些氨基酸被删除或被替换成其它氨基酸时蛋白便完全失去进入细胞核的能力。然而,由于HIF-3α较前两者较晚被克隆得到,所以目前对该蛋白是否也为核内蛋白,其进核能力是否会受到氧气浓度的影响以及该蛋白结构上是否也存在核定位信号等等一系列的问题尚未得到解答。本研究的目的就是要对上述疑问一一进行探讨。我们以斑马鱼Hif-3α作为对象观察该蛋白在细胞中的核质分布以及确定其核定位信号存在的位点。我们从斑马鱼体内克隆得到了hif-3α的全长cDNA,其开放阅读框共编码626个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现该蛋白和人类的HIF-3α相似性在40%左右,说明两者的保守性比较高。利用Hif-3α进行核定位信号的研究能够帮助我们完善对三种HIF-α亚基在结构上相同点和不同点的认识。将Hif-3α蛋白全长以及缺失N-端或C-端氨基酸片段的突变蛋白与EGFP构建成融合蛋白后用相应的质粒瞬时转染Hela细胞后我们发现,在常氧时Hif-3α-EGFP蛋白便已能够集中于细胞核分布,缺氧并不能对它的细胞亚定位产生影响。而N-端或C-端区域缺失突变体转染结果提示Hif-3α的C-端区域具有进核的功能。利用特异性表达于细胞质的β-Gal-EGFP蛋白进一步实验证明Hif-3α的C-端第518-567位和第568-626位两个氨基酸片段各自具备进核的功能。在每个片段中都存在碱性氨基酸对其功能的发挥有不可或缺的作用,它们分别为K524,R525,K578以及R579。在Hif-3α完整蛋白的背景下将这些氨基酸突变后也使得蛋白的进核能力明显减弱。在这两个碱性氨基酸簇之间有一段长为52个氨基酸的连接区域,这些氨基酸共同组成一段有核定位功能的结构域,我们将其命名为Hif-3α的核定位信号。值得注意的是,我们发现Hif-3αN-端的第1-69位氨基酸片段也能够介导β-Gal-EGFP进入细胞核中,其中发挥作用的氨基酸为R14,K15,R25和R26。但是在全长蛋白中该片段却并没有真正的核定位功能,这与之前在HIF-1α和HIF-2α中的研究结果相一致。最后将不同物种一共9种HIF-α的C-端序列进行比对,推测在Hif-3α中新发现的核定位信号的碱性氨基酸在HIF-α是保守存在的。综上所述,斑马鱼Hif-3α是一种不受氧气浓度影响集中于细胞核分布的蛋白质,在其C-端存在一段有功能的核定位信号,其中几个碱性氨基酸发挥主要的核定位功能。

关键词：缺氧诱导因子-3α 核定位信号细胞质细胞核

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

核定位信号研究进展

引用

生物学通报 2014年第8期49卷 5-10页

作者：陶华平杭州师范大学生命与环境科学学院浙江杭州310036

核定位信号是一种存在于细胞内众多蛋白质中,介导其由细胞质向细胞核转运的氨基酸序列。核定位信号具有形式多样性,其作用机制也不尽相同,对于入核蛋白发挥正常的生理功能有着重要的作用。因其功能异常引发的多种疾病越来越受关注,核定... 详细信息

核定位信号是一种存在于细胞内众多蛋白质中,介导其由细胞质向细胞核转运的氨基酸序列。核定位信号具有形式多样性,其作用机制也不尽相同,对于入核蛋白发挥正常的生理功能有着重要的作用。因其功能异常引发的多种疾病越来越受关注,核定位信号研究成了众多疾病病理机制研究的方向和寻求治疗的手段。简要概述近年来关于核定位信号的类型、相关疾病和应用研究的情况,并列举了几个常用预测软件与网站,供读者参考。

关键词：核定位信号转运受体入核机制核定位信号预测

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

核定位信号肽在超声靶向破坏微泡介导基因转染治疗犬心肌梗死中的促进作用

引用

临床超声医学杂志 2017年第1期19卷 1-6页

作者：崔晶晶曹省陈金玲邓倾王益佳周青胡波武汉大学人民医院超声影像科心血管病湖北省重点实验室武汉市430060

目的探讨超声靶向破坏微泡(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽增强犬心肌h Ang-1基因体内转染效率的可行性及应用价值。方法构建犬急性心肌梗死模型并分组进行基因转染治疗,每组8只。A组:建模成功后未行治疗,即空白对照组;B组:建模成功后... 详细信息

目的探讨超声靶向破坏微泡(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽增强犬心肌h Ang-1基因体内转染效率的可行性及应用价值。方法构建犬急性心肌梗死模型并分组进行基因转染治疗,每组8只。A组:建模成功后未行治疗,即空白对照组;B组:建模成功后超声介导质粒DNA转染;C组:建模成功后超声介导质粒DNA加经典NLS肽转染;D组:建模成功后超声介导质粒DNA加突变NLS肽转染;E组:建模成功后超声介导质粒DNA加经典NLS肽和入核阻滞剂转染。建模后转染前,HE染色观察心肌梗死后病理变化情况。转染后3 d,心肌冰冻切片检测EGFP标记的h Ang-1基因表达情况,RT-PCR和Western Blot分别从基因和蛋白水平方面检测心肌组织h Ang-1基因表达效率。转染后28 d,α-SMA免疫组化定位新生毛细血管,并在显微镜下计数新生微血管密度;Masson染色及心脏大体标本评价心肌梗死区纤维化程度及面积。建模前、建模后1周基因转染前及基因转染后28 d分别应用二维超声心动图检测各组犬射血分数及室壁运动情况,比较各组基因治疗效果。结果 (1)A、B、C组心肌组织中绿色荧光蛋白表达量逐渐增高,C、D、E组逐渐减少,Western Blot和RT-PCR检测结果显示h Ang-1蛋白及基因表达趋势与绿色荧光蛋白一致,C组与其余各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。(2)免疫组化结果显示C组毛细血管密度最高,与其余各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);Masson染色显示A、B、C组心肌纤维化程度依次减低,C、D、E组依次增高。(3)建模后1周,5组犬均可见节段性室壁运动减低且射血分数明显减低,组间比较差异无统计学意义。基因转染后28 d,A、E组心功能明显减低,B、D组轻度减低,C组轻度增高,C组与其余各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 UTMD联合NLS可高效、靶向地介导质粒DNA在缺血心肌内的表达,并促进血管新生,改善心肌纤维化,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗方面将有较好的应用前景。

关键词：非病毒载体超声靶向破坏微泡核定位信号基因治疗心肌梗死犬

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

核定位信号类短肽的生物医学应用

引用

国际病理科学与临床杂志 2009年第4期29卷 312-317页

作者：陈本科王晓文唐劲天清华大学工程物理系粒子技术与辐射成像教育部重点实验室北京100084 北京中医药大学中药学院生物制药系北京100102

核蛋白定位信号(nuclear localization signal,NLS)是一段富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的短肽,是介导蛋白通过核孔复合体入核的必要信号序列。NLS存在于真核细胞核蛋白及病毒蛋白中,鱼精蛋白是应用较为广泛的天然NLS类短肽。针对NLS... 详细信息

核蛋白定位信号(nuclear localization signal,NLS)是一段富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的短肽,是介导蛋白通过核孔复合体入核的必要信号序列。NLS存在于真核细胞核蛋白及病毒蛋白中,鱼精蛋白是应用较为广泛的天然NLS类短肽。针对NLS能够介导DNA、蛋白质、纳米粒等进入细胞核的特点,国内外学者对其在生物医学中的应用进行了广泛研究。

关键词：核定位信号鱼精蛋白低分子质量鱼精蛋白

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

小鼠TET1蛋白核定位信号的鉴定

小鼠TET1蛋白核定位信号的鉴定

引用

作者：陈琳琳西北农林科技大学

学位级别：硕士

表观遗传修饰指的是,在不改变DNA序列的前提下,生物体表型发生的可遗传性变化,在干细胞的干性维持和定向分化中发挥着重要的功能。DNA甲基化可以诱导基因沉默,是表观遗传修饰的一种重要形式。研究发现,TET(ten-eleven translocation)家... 详细信息

表观遗传修饰指的是,在不改变DNA序列的前提下,生物体表型发生的可遗传性变化,在干细胞的干性维持和定向分化中发挥着重要的功能。DNA甲基化可以诱导基因沉默,是表观遗传修饰的一种重要形式。研究发现,TET(ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化DNA的5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),这种改变使基因的CpG岛(CpG islands,CGIs)去甲基化,从而诱导基因的转录激活。核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)控制着真核细胞中细胞核与细胞质之间的物质交换,小分子,如离子和不超过50KDa的蛋白质可以通过被动扩散经由NPC进入细胞核中;而大蛋白则只能通过主动运输的方式进入细胞核发挥其生理功能。这种主动运输的蛋白质必须至少包含一个核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。核定位信号分为经典核定位信号(classical NLS,cNLS),内输蛋白β2识别的NLS(PY-NLS)和其它类型的NLS,它们对应不同的核输入机制。参与cNLS核蛋白转运的核转运蛋白是内输蛋白α和β1,而参与PY-NLS的核转运蛋白是内输蛋白β2。TET1是定位在细胞核中的转录因子,是由2039个氨基酸组成的DNA去甲基化酶。根据在线软件POSORT II预测,TET1具有18个NLSs,其中13个单分型NLSs和5个双分型NLSs。本研究通过一系列的TET1突变体融合绿色荧光蛋白载体构建以及细胞免疫荧光染色,鉴定出了小鼠TET1蛋白中的两个功能性核定位信号KKRK和RKR R,分别位于TET1蛋白序列的603-606AA和1720-1723AA,可共同促进TET1蛋白转运至细胞核中发挥功能。本研究的主要实验结果包括:1.以小鼠胚胎干细胞J1(J1 mESCs)总RNA为模板扩增小鼠Tet1基因编码区,并构建真核表达载体pCMV-HA-TET1。Western blot以及细胞免疫荧光染色表明TET1融合蛋白可以正常表达且TET1蛋白主要定位于细胞核中,这提示了TET1至少具有一个功能性的NLS。2.研究NLS的第一步,是对TET1蛋白的序列进行分析。在线软件POSORT II(http://***/***)对NLS的预测表明TET1具有18个潜在性cNLSs。为了定位NLS,将TET1蛋白“切割”成5个截短突变体,并将其与示踪分子EGFP融合表达,所有融合表达的蛋白大小均超过50kDa,仅能通过主动运输的方式进入细胞核中。实验发现融合蛋白EGFP-TET1-275-862和EGFP-TET1-1463-1885主要定位于细胞核中,这提示功能性NLS存在于这两个片段中。3.通过一系列的截短实验和突变实验鉴定了功能性核定位信号603KKRK606和1720R KRR1723,其中KKRK位于TET1蛋白N端的CXXC区域,而RKRR位于C端的催化结构域中。生物信息学软件比对了小鼠、大鼠、人、豚尾猴、土拨鼠、牛和野猪的TE T1蛋白序列,结果显示核定位信号KKRK在这些物种间高度保守,而RKRR并不保守。TET蛋白家族的同源性分析则表明KKRK和RKRR均不保守。综上所述,本研究成功构建了小鼠pCMV-HA-TET1真核表达载体;鉴定出了小鼠TET1的两个功能性NLS,其中KKRK位于TET1蛋白N端的CXXC区域,而RKRR位于C端的催化结构域中;TET1的核定位信号KKRK高度保守而RKRR并不保守。这对于进一步的研究TET1的功能以及揭示TET1的核转运机制有很大帮助。

关键词： TET1 核定位信号核输入蛋白 NIH3T3 小鼠

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：