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超声靶向微泡破坏联合核定位信号肽增强基因转染治疗犬心肌梗死的实验研究

超声靶向微泡破坏联合核定位信号肽增强基因转染治疗犬心肌梗死的...

引用

中国超声医学工程学会第十三届全国超声心动图学术会议

作者：崔晶晶周青曹省陈金玲邓倾胡波王益佳谭团团武汉大学人民医院超声影像科

目的:利用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽提高hAng-1基因体内转染效率,治疗犬心肌梗死。方法:40只犬经股动脉明胶海绵栓塞法成功建立急性心肌梗死模型后随机分为4组,即A:空白对照组;B:hAng-1组;C:UTMD+hAng-1组;D:UTM... 详细信息

目的:利用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽提高hAng-1基因体内转染效率,治疗犬心肌梗死。方法:40只犬经股动脉明胶海绵栓塞法成功建立急性心肌梗死模型后随机分为4组,即A:空白对照组;B:hAng-1组;C:UTMD+hAng-1组;D:UTMD+NLS+hAng-1组。模型建成后1w,经静脉注入各组治疗试剂,同时C、D组超声辐照心前区。①建模前、建模后1w基因转染前及转染后28天分别行超声检查,二维超声心动图检测各组犬射血分数及室壁运动情况,心肌声学造影检测各组犬心肌血流灌注情况。②转染后28天,从每组随机挑选犬9只,RT-PCR和WesternBlot分别从基因和蛋白水平检测基因相对表达量;免疫荧光SP法定位梗死周边区新生毛细血管,并在显微镜下计数微血管密度(MVD);Masson染色及心脏大体标本评价梗死区纤维化程度及面积;比较4组基因治疗效果。结果:①建模前,4组犬室壁运动、心功能正常,心肌造影各室壁未见充盈缺损。心梗建模后1w基因转染前,4组犬左室前壁运动幅度及左室射血分数均明显减低,心肌造影均显示前壁充盈缺损,组间差异无统计学意义(p>0.05)。基因转染后28天,A、B、C、D组心功能分别为(31±2.3)%、(32.2±2.2)%、(41.8±3.7)%、(48.2±3.8)%,D组与其他组比较差异均有统计学意义(p<0.05),心肌造影显示D组梗死及周围区较多造影剂充填,C组少许造影剂充填,A、B组充盈缺损。②RT-PCR和Western Blot显示D组hAng-1表达量明显高于其他各组,差异均有统计学意义(p<0.05),D组蛋白和mRNA分别为C组的1.9倍、1.8倍;③免疫荧光SP法结果显示新生微血管被染成绿色,A、B、C、D组毛细血管密度分别为(4.7±1.6/mm2)、(11.2±2.8/mm2)、(70.0±6.4/mm2)、(85.3±7.0/mm2),D组与其他各组比较差异均有统计学意义(p<0.05);④Masson染色及心脏大体标本显示D组心肌纤维化程度及面积较其他组减低,D组与其他各组间差异有统计学意义(p<0.05)。结论:NLS能够促进超声靶向微泡破碎介导的hAng-1基因在缺血心肌内的高效表达,并促进血管新生、改善心肌纤维化,为缺血性心脏病的基因治疗提供一种新的基因转移途径。

关键词： UTMD 基因治疗心肌梗死核定位信号

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猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病学术研讨会

作者：郭龙军陆月华黄立平危艳武刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨 150001

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原，其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白，起保护性抗原作用，对其进行抗原表位鉴定十分必要。本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原，其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白，起保护性抗原作用，对其进行抗原表位鉴定十分必要。本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体，通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达，先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位，然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。5株单抗中有4株针对同一抗原表位，坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区，经多肽扫描证实，核心序列为26RPWLVHPRHRY36：另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应，对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应，鉴于该单抗具有中和病毒活性，针对的可能是构象表位。本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位，为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白抗原表位多肽扫描核定位信号

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核糖体蛋白RpL6/Taxreb107核定位信号的确定及启动子分析

核糖体蛋白RpL6/Taxreb107核定位信号的确定及启动子分析

引用

第六届海内外生命科学论坛

作者：王冀姝杨曦李荣孙强周鹏韩骅第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室 710032

利用核定位信号捕捉系统确定核糖体蛋白L6(RpL6)的核定位信号(NLS)的位置，并在体外培养的细胞中加以证实.氨基端的30-41和68-84氨基酸残基具有核定位及核仁定位功能.RpL6又称Taxreb107，是HTLV-1原癌蛋白Tax应答序列结合蛋白.通过筛选... 详细信息

利用核定位信号捕捉系统确定核糖体蛋白L6(RpL6)的核定位信号(NLS)的位置，并在体外培养的细胞中加以证实.氨基端的30-41和68-84氨基酸残基具有核定位及核仁定位功能.RpL6又称Taxreb107，是HTLV-1原癌蛋白Tax应答序列结合蛋白.通过筛选噬菌体文库克隆了RpL6/Taxreb107的基因组基因，并对外显子/内含子的结构进行了分析.RpL6/Taxreb107的启动子含有多种包括NF-κB在内的特殊转录因子的识别位点.由于Tax能够激活NF-κB，而RpL6/Taxreb107能够协助Tax对病毒基因组的转录，所以探讨了Tax是否能够对RpL6/Taxreb107的表达进行调节.结果显示，RpL6/Taxreb107的启动子具有持续激活的特点.Tax对RpL6/Taxreb107的表达和启动子的活性具有上调的作用，而这种作用正是通过启动子上的NF-κB识别位点实现的.综上所述，Tax通过NF-κB上调RpL6/Taxreb107的表达，而RpL6/Taxreb107又促进了HTLV-1病毒感染细胞的增生和病毒基因组的复制.

关键词：核糖体蛋白核定位信号启动子转录因子

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BRD7核定位信号的结构分析和功能鉴定

BRD7核定位信号的结构分析和功能鉴定

引用

第八届全国鼻咽癌学术会议

作者：周鸣王蓉唐珂李桂源李小玲徐晓杰周后德刘华英何佳瑾武明花沈守荣曹莉中南大学湘雅医学院肿瘤研究所长沙410078

目的：BRD7是我室通过cDNA代表性差异分析自主克隆的一个鼻咽癌抑瘤新基因,并已初步证实为一个潜在的核转录调节因子.本研究旨在对BRD7的核定位信号进行预测、结构分析和功能鉴定,并考察其对BRD7亚细胞定位的影响. 方法：通过生物信... 详细信息

目的：BRD7是我室通过cDNA代表性差异分析自主克隆的一个鼻咽癌抑瘤新基因,并已初步证实为一个潜在的核转录调节因子.本研究旨在对BRD7的核定位信号进行预测、结构分析和功能鉴定,并考察其对BRD7亚细胞定位的影响. 方法：通过生物信息学对BRD7的核定位信号进行预测和结构分析,然后利用绿色荧光蛋白(GFP)介导的直接荧光和间接免疫荧光定位方法分别对核定位信号的功能进行鉴定,并考察其对BRD7亚细胞定位的影响. 结果：BRD7的65～96位氨基酸具有潜在核定位信号(NLS)的结构特征,该核定位信号包含三簇碱性氨基酸残基,可视为由两个紧密相邻、部分重叠的双向核靶序列NLS1和NLS2组成;并发现NLS及其构成上的NLS1和NLS2均具有介导异源蛋白GFP胞核定位的功能,从而证实BRD7的65～96位氨基酸为BRD7功能性核定位信号所在区域,且单簇碱性氨基酸残基的缺失不足以破坏其核定位信号的功能;同时发现野生型BRD7呈胞核分布,而核定位信号缺失型BRD7主要呈胞浆分布. 结论：BRD7的65-96位氨基酸为BRD7功能性核定位信号所在区域,在BRD7胞核分布模式中发挥了十分重要的作用.

关键词：鼻咽癌抑瘤基因 BRD7 核定位信号功能鉴定

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人乳头瘤状病毒58 L1蛋白羧基端核定位信号在毕赤酵母细胞中入核功能研究

人乳头瘤状病毒58 L1蛋白羧基端核定位信号在毕赤酵母细胞中入核...

引用

第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：姜自军楼觉人上海生物制品研究所

目的探究HPV58 L1蛋白羧基端核定位信号是否在毕赤酵母细胞中发挥主动入核功能。方法分别构建表达全长HPV58L1蛋白和缺失羧基端核定位信号的HPV58L1蛋白与绿色荧光蛋白融合表达质粒,在毕赤酵母中诱导表达相应蛋白,用激光共聚焦显微镜观... 详细信息

目的探究HPV58 L1蛋白羧基端核定位信号是否在毕赤酵母细胞中发挥主动入核功能。方法分别构建表达全长HPV58L1蛋白和缺失羧基端核定位信号的HPV58L1蛋白与绿色荧光蛋白融合表达质粒,在毕赤酵母中诱导表达相应蛋白,用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在毕赤酵母细胞中分布情况。结果全长HPV58 L1和缺失羧基端核定位信号的HPV58L1与绿色荧光蛋白融合蛋白没有聚集在毕赤酵母细胞核中,而是随机地分布在毕赤酵母细胞中。结论 HPV58 L1蛋白的羧基端核定位信号在毕赤酵母中不发挥主动入核的功能。

关键词： pPIC3.5K 核定位信号毕赤酵母 DRAQ-5

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超声靶向微泡联合肽核酸结合核定位信号肽增强基因转染的实验研究

超声靶向微泡联合肽核酸结合核定位信号肽增强基因转染的实验研究

引用

中国超声医学工程学会第十三届全国超声心动图学术会议

作者：姜楠陈茜胡波周青曹省冯闯丽郭瑞强武汉大学人民医院超声影像科

目的:应用超声靶向微泡破坏(UTMD)介导连接有核定位信号的质粒DNA转染293T细胞,增加基因入胞及入核量,从而提高细胞对外源基因的转染效率。方法:合成连接有细胞特异性抗体的靶向微泡,特异性识别293T细胞膜表面SV40T抗原,增加微泡在细胞... 详细信息

目的:应用超声靶向微泡破坏(UTMD)介导连接有核定位信号的质粒DNA转染293T细胞,增加基因入胞及入核量,从而提高细胞对外源基因的转染效率。方法:合成连接有细胞特异性抗体的靶向微泡,特异性识别293T细胞膜表面SV40T抗原,增加微泡在细胞周围的聚集量,强化UTMD空化作用使细胞膜通透性增加,从而提高质粒入胞率;通过肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)将核定位信号(nuclearlocalization signal,NLS)与EGFP-N3质粒基因相连接,通过构建一种特殊的基因传递系统来介导细胞对外源基因的摄取,提高细胞核对基因的摄取量。在优化的超声参数条件下,比较以下几组间转染效率:空白对照组(CON)、普通微泡+质粒组(CMB+DNA)、靶向微泡+质粒组(AT-MB+DNA)、普通微泡+NLS-PNA-DNA组(CMB+NLS-PNA-DNA),靶向微泡+NLS-PNA-DNA组(AT-MB+NLS-PNA-DNA)。倒置荧光显微镜观察荧光入胞及入核的情况;CCK-8(cel1 count kit-8)检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞转染率;RT-PCR以及Western b1ot检测目的基因的mRNA和蛋白的表达水平。结果:UTMD联合靶向微泡可以在保持细胞较高存活率的情况下显著提高胞质对外源基因的摄入,AT-MB+NLS-PNA-DNA组的基因转染效率分别是AT-MB+DNA组和CMB+NLS-PNA-DNA组的2.3和1.5倍(P<0.01)。结论:通过合成靶向微泡和连接有核定位信号的质粒DNA,在UTMD介导下,细胞质和细胞核对质粒DNA的摄取明显增加,从而显著提高EGFP-N3质粒对293T细胞的转染效率。

关键词：超声处理微气泡肽核酸核定位信号转染

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超声靶向微泡联合肽核酸结合核定位信号肽增强基因转染的实验研究

超声靶向微泡联合肽核酸结合核定位信号肽增强基因转染的实验研究

引用

2017中国超声医师学术大会暨中国医师协会超声医师分会成立十周年大会

作者：姜楠陈茜胡波周青曹省冯闯丽郭瑞强

目的：应用超声靶向微泡破坏(UTMD)介导连接有核定位信号的质粒DNA 转染293T 细胞，增加基因入胞及入核量，从而提高细胞对外源基因的转染效率。

关键词：超声处理微气泡肽核酸核定位信号转染

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猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

引用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：郭龙军陆月华黄立平危艳武刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白抗原表位多肽扫描核定位信号

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非结构蛋白NS1的核定位信号对蟑螂浓核病毒感染的影响

非结构蛋白NS1的核定位信号对蟑螂浓核病毒感染的影响

引用

第八届全国病毒学学术研讨会

作者：周伟东张珈敏杨波周亮胡远扬病毒学国家重点实验室武汉大学生命科学学院武汉湖北 430072

@@黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa Densovirus，简称PfDNV)是1990年由武汉大学胡远扬教授等分离鉴定。由于其具有独特的结构和功能，2004年国际病毒学分类委员会(ICTV)的第八次报告中，特别设立了黑胸大蠊浓核病毒属(Pefudens... 详细信息

@@黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa Densovirus，简称PfDNV)是1990年由武汉大学胡远扬教授等分离鉴定。由于其具有独特的结构和功能，2004年国际病毒学分类委员会(ICTV)的第八次报告中，特别设立了黑胸大蠊浓核病毒属(Pefudensovirus)，代表种为黑胸大蠊浓核病毒PfDNV。

关键词：非结构蛋白核定位信号黑胸大蠊浓核病毒结构功能分离鉴定

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鸭圆环病毒ORF3蛋白核定位信号研究

鸭圆环病毒ORF3蛋白核定位信号研究

引用

中国畜牧兽医学会家禽学分会第十八次全国家禽学术讨论会

作者：王鑫武专昌孟凡生孙培明毕崇亮王娟临沂大学农林科学学院山东临沂276000

1引言鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)能引起鸭免疫抑制性疾病,感染的鸭子主要表现为羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻,胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏不同程度出血肿胀,淋巴细胞坏死等特征.DuCV于2003年由德国学者Hatter-mann发现,而后分别... 详细信息

1引言鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)能引起鸭免疫抑制性疾病,感染的鸭子主要表现为羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻,胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏不同程度出血肿胀,淋巴细胞坏死等特征.DuCV于2003年由德国学者Hatter-mann发现,而后分别在匈牙利、美国、中国台湾地区及中国大陆等地被发现或报道,众多的病原学和血清学的检测表明我国鸭群中DuCV的感染普遍存在,感染率在6％-84％不等.DuCV分为2个基因型,DuCV感染鸭在脾脏、胸腺和法氏囊形成明显病灶,与淋巴细胞凋亡相关.对分属两基因型的不同DuCV代表毒株的0RF3基因序列进行同源性分析发现,基因Ⅰ型和Ⅱ型DuCV的ORF3核酸序列同源性存在较大差异,基因Ⅰ型C端缺失了20个氨基酸,利用重叠和突变PCR技术进行基因Ⅰ型DuCV ORF3蛋白C端缺失区域回补,不同基因型DuCV的ORF3蛋白的核定位信号存在于基因Ⅰ型C端缺失了20个氨基酸中,本研究主要研究两种不同基因型DuCV的ORF3蛋白的核定位信号.对进一步了解DuCV子代病毒的复制,并影响宿主细胞基因表达、细胞凋亡和细胞周期调控等过程具有重要意义.

关键词：鸭圆环病毒 ORF3 核定位信号

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