检索结果-内蒙古大学图书馆

食品与生物技术学报 2015年第11期34卷 1168-1171页

作者：鲍广稳祝嫦巍安徽科技学院生命科学学院安徽凤阳233100

设计了一种简单高效的根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的方法。利用嵌套平板的方法,在内层平板培养平菇菌丝,待菌丝生长至平板边缘,将经诱导的根癌农杆菌与共培养培养基(CCM)混合,倒入内层平板与外层平板的间隙中,与正在生长中的菌丝共培... 详细信息

设计了一种简单高效的根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的方法。利用嵌套平板的方法,在内层平板培养平菇菌丝,待菌丝生长至平板边缘,将经诱导的根癌农杆菌与共培养培养基(CCM)混合,倒入内层平板与外层平板的间隙中,与正在生长中的菌丝共培养,实现转化,利用潮霉素抗性筛选获得转化子,平均转化效率33%左右。此方法操作简单,周期短,极易扩大实验规模,为平菇的分子育种以及其他丝状真菌的遗传转化提供参考。

关键词：根癌农杆菌介导转化菌丝体平菇

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根癌农杆菌介导转化贡蕉胚性悬浮细胞的研究

根癌农杆菌介导转化贡蕉胚性悬浮细胞的研究

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中国植物生理学会第九次全国会议

作者：黄霞魏岳荣肖望黄学林中山大学生命科学学院中山大学生命科学学院中山大学生命科学学院中山大学生命科学学院

香蕉(Musa spp.)是世界第二大宗水果。目前共有120个国家和地区生产香蕉,香蕉已成为近五亿人口的主要粮食,是发展中国家重要的创汇来源。我国的香蕉生产近50年来发展迅猛,有着巨大的经济利益。病虫害的侵袭使香蕉生产遭受严重损失,用传... 详细信息

香蕉(Musa spp.)是世界第二大宗水果。目前共有120个国家和地区生产香蕉,香蕉已成为近五亿人口的主要粮食,是发展中国家重要的创汇来源。我国的香蕉生产近50年来发展迅猛,有着巨大的经济利益。病虫害的侵袭使香蕉生产遭受严重损失,用传统的育种方法培育抗病、抗逆的优质香蕉比较困难,而利用组织培养结合基因工程技术可望实现这一目的。近年来,香蕉基因转化的研究取得了可喜的进展,国内外研究者通过基因枪法或根癌农杆菌介导法获得了转基因植株,但仅限于少数几个香蕉品种。不同基因型甚至同一基因型的不同品种的香蕉进行基因转化,成功的难易程度相差很大。贡蕉(Musa *** group,***)足独特的食用二倍体蕉,与普通香蕉比较更加芳香爽口,价格也高出几倍,是21

关键词：胚性悬浮细胞根癌农杆菌介导转化黑暗培养

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糙皮侧耳疏水蛋白基因RNAi载体构建及根癌农杆菌介导的转化研究

糙皮侧耳疏水蛋白基因RNAi载体构建及根癌农杆菌介导的转化研究

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作者：刘媛媛华中农业大学

学位级别：硕士

部分高等真菌基因功能研究的壁垒,主要在于其自身的多细胞核特点,这为多核细胞的基因功能研究带来很大技术难题。本研究选用RNA干扰技术(RNAi)欲从转录水平抑制糙皮侧耳疏水蛋白基因(***)的表达量,克服了运用传统基因敲除技术不易获得... 详细信息

部分高等真菌基因功能研究的壁垒,主要在于其自身的多细胞核特点,这为多核细胞的基因功能研究带来很大技术难题。本研究选用RNA干扰技术(RNAi)欲从转录水平抑制糙皮侧耳疏水蛋白基因(***)的表达量,克服了运用传统基因敲除技术不易获得纯合子的缺点,同时结合***基因的超表达载体、反义RNA载体,以及根癌农杆菌介导糙皮侧耳菌丝的遗传转化等方法来共同探索***的基因功能。疏水蛋白(Hydrophobin),在气生菌丝形成、孢子萌发、子实体发育等生命过程中扮演重要角色,但针对疏水蛋白基因功能的研究相对较少,目前尚未发现有关糙皮侧耳疏水蛋白基因功能的报道,本研究通过基因水平来探索糙皮侧耳疏水蛋白的基因功能,以期为糙皮侧耳疏水蛋白基因功能研究及工业生产奠定基础。首先,利用PCR技术克隆到大小为330bp的糙皮侧耳疏水蛋白基因编码区(CDS)序列,以及大小为960bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子(gpd)序列。其次,以植物双元载体p CAMBIA1300为骨架,构建在gpd启动子调控下的疏水蛋白超表达载体p1300-gh-gOEHyd、以及反义RNA载体p1300-gh-ganti Hyd,同时利用Golden Gate克隆技术构建了糙皮侧耳疏水蛋白干扰载体p1302-GG-ihyd,该载体以p CAMBIA1302为骨架,在其T-DNA区包含潮霉素(Hyg B)抗性选择基因以及绿色荧光蛋白(GFP)标记基因。最后,采用电击法将将构建好的双元载体转入根癌农杆菌中,并在乙酰丁香酮(AS)诱导作用下,进行根癌农杆菌对糙皮侧耳幼嫩菌丝的转化。拟定转化子依次经潮霉素抗性筛选、PCR检测外源基因、以及荧光显微观察绿色荧光蛋白表达情况以及Southern杂交等技术进行验证,最后运用Real-time PCR技术检测转化子疏水蛋白基因的表达量。结果显示,所获干扰载体的转化子具有潮霉素抗性还可在荧光显微镜下检测到绿色荧光信号,其疏水蛋白基因的表达量为野生型的43%,且干扰载体T-DNA片段以单拷贝的形式整合在该平菇转化子基因组内。过表达载体和反义RNA载体的转化子,经PCR检测具有潮霉素抗性基因,并可以稳定遗传。

关键词：糙皮侧耳疏水蛋白根癌农杆菌介导转化 RNAi

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根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

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中国水稻科学 2010年第6期24卷 617-622页

作者：杨迎青杨媚李明海李勇贺晓霞周而勋华南农业大学植物病理学系广东广州510642

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等... 详细信息

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。

关键词：水稻纹枯病立枯丝核菌根癌农杆菌介导转化 T-DNA插入诱变方法

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根癌农杆菌介导的粉棒束孢插入转化及突变体筛选

根癌农杆菌介导的粉棒束孢插入转化及突变体筛选

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作者：宋文静海南大学

学位级别：硕士

粉棒束孢（Isaria farinosa）是一种常见的昆虫病原真菌,已被用作生物防治武器,用于防治温带农林害虫、植物病原微生物以及线虫等。同时,粉棒束孢作为冬虫夏草中的定殖真菌,严重危害冬虫夏草的（Ophiocordyceps sinensis）寄主蝙蝠蛾幼... 详细信息

粉棒束孢（Isaria farinosa）是一种常见的昆虫病原真菌,已被用作生物防治武器,用于防治温带农林害虫、植物病原微生物以及线虫等。同时,粉棒束孢作为冬虫夏草中的定殖真菌,严重危害冬虫夏草的（Ophiocordyceps sinensis）寄主蝙蝠蛾幼虫的饲养,引起了资源昆虫研究者的高度重视,并采取措施进行控制。本论文利用根癌农杆菌介导转化（ATMT）方法构建粉棒束孢DGPH5品系的突变子库,通过测定不同因素对转化效率的影响,优化农杆菌介导转化的条件,测定转化子的特征,以黄粉虫幼虫测定转化子毒力,为冬虫夏草人工培养过程中控制粉棒束孢污染提供科学依据。利用ATMT方法成功构建了粉棒束孢突变子库,优化转化参数分生孢子浓度为10～4个/m L,农杆菌OD600为0.6,共培养温度为25℃的条件下粉棒束孢的插入转化效率为每10～4个/m L个分生孢子可获得10-80个转化子;乙酰丁香酮（AS）对粉棒束孢ATMT的预培养和共培养并非必需;对3000多个转化子通过固体平板、液体培养、感染昆虫等方法筛选突变子,筛选到菌丝生长受阻以及毒力降低相关的转化子,通过三代基因组重测序获得相关基因。ATMT转化系统为粉棒束孢功能基因的发现和特征描述提供了有用的工具。

关键词：根癌农杆菌介导转化粉棒束孢插入突变毒力测定冬虫夏草

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根癌农杆菌介导深红虫草菌株C033遗传转化的研究

根癌农杆菌介导深红虫草菌株C033遗传转化的研究

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作者：郭维江西农业大学

学位级别：硕士

深红虫草(Cordyceps cardinalis)是一种寄生于鳞翅目幼虫的病原真菌。其主要代谢产物是一种天然的真菌毒素，在生物防治中可以作为重要的真菌杀虫剂。药用真菌功能基因研究是真菌基因组研究领域里极其重要的部分，活性成分及其合成的相... 详细信息

深红虫草(Cordyceps cardinalis)是一种寄生于鳞翅目幼虫的病原真菌。其主要代谢产物是一种天然的真菌毒素，在生物防治中可以作为重要的真菌杀虫剂。药用真菌功能基因研究是真菌基因组研究领域里极其重要的部分，活性成分及其合成的相关基因是主要研究目标。利用农杆菌介导的真菌遗传转化是当前获得突变体的最优方法之一。因此，进行了农杆菌介导深红虫草转化体系研究，构建了深红虫草T-DNA插入突变体库，并对突变体进行了分析，取得如下结果： (1)确定了遗传霉素G418和头孢霉素分别为深红虫草菌株C033的有效筛选剂和除菌剂，筛选剂的浓度为500μg·mL。通过根癌农杆菌EHA105介导建立了深红虫草菌株的遗传转化体系。当根癌农杆菌菌液在600nm处的吸光值为0.6左右，虫草菌孢子的浓度为105个/mL，AS的浓度为200μmol·L，根癌农杆菌与虫草菌的共培养时间为48h时，该体系的转化效率最高，可获得约100个转化子。与同一类型蛹虫草的转化效率30～100个转化子略有增加。 (2)以g418和npt II基因分别为筛选抗生素和筛选标记，继代培养转化子，用gus检测液再次筛选，进行PCR验证。证明T-DNA成功插入深红虫草菌株基因组DNA中;通过转化子菌株与原始菌株C033在菌落形态、颜色等方面的差异比较，大部分转化子菌株与原始菌株差别不大，只有少数转化子菌株发生了较大变化，表明农杆菌介导的深红虫草菌株C033遗传转化系统的稳定性。 (3)利用TAIL-PCR方法对孢子产生突变子T-DNA右边界侧翼序列进行克隆测序，得到2条有效序列，经过BLAST比对，发现其中一条序列与构巢曲霉(Aspergillusnidulans)GPDA基因和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的水通道蛋白基因Aqy1相似性分别达到99.1%和98.2%，推测可能为深红虫草的假定基因序列。将该序列上传GenBank，登录号为AEW46442.1和AB293446.1，另外2株经过反复实验均未得到理想结果，而得到的右侧条带又只有1条在GenBank中有同源性序列，需进一步分析。综上所述，为了研究虫草菌的基因功能、基因表达调控和表达体系，进行虫草菌的遗传转化是开展这些研究的基础，因此建立一个高效的虫草菌转化体系非常关键。同时，为虫草菌株的选育、相关功能基因的克隆及功能分析，阐明深红虫草代谢产物的合成途径奠定技术基础。

关键词：深红虫草根癌农杆菌介导转化 T-DNA TAIL-PCR 突变体

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根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的研究

根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化的研究

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作者：任楠华南理工大学

学位级别：硕士

丝状真菌具有良好的蛋白分泌能力,而且能对合成的真核蛋白正确地进行各种翻译后加工包括肽链的剪切和糖基化等,其糖基化修饰模式较酵母更类似于高等真核生物。由于在食品及食品加工中长期应用,许多菌种已被认定是安全的。与哺乳动物和... 详细信息

丝状真菌具有良好的蛋白分泌能力,而且能对合成的真核蛋白正确地进行各种翻译后加工包括肽链的剪切和糖基化等,其糖基化修饰模式较酵母更类似于高等真核生物。由于在食品及食品加工中长期应用,许多菌种已被认定是安全的。与哺乳动物和昆虫等高等生物表达系统相比,丝状真菌培养方便、生长迅速、成本较低,表达的外源蛋白可以分泌到培养基中,下游的分离纯化简单。加之丝状真菌遗传转化系统研究的迅速发展,为在丝状真菌中表达外源蛋白奠定了基础。本文以泡盛曲霉为研究对象,拟通过根癌农杆菌介导建立其遗传转化体系。通过分泌蛋白图谱分析和药物敏感性分析,确定了以潮霉素B抗性基因和乙酰胺酶基因amdS作为筛选标记的宿主菌;基于Gateway克隆技术,构建了由高效启动子、终止子和目的基因表达框组成的根癌农杆菌双元载体,筛选标记为潮霉素B抗性基因和乙酰胺酶基因amdS;通过根癌农杆菌介导,将构建的双元载体转化泡盛曲霉,获得了含有目的基因的转化子,经过PCR验证、SDS-PAGE蛋白电泳和Western蛋白杂交证明目的基因已转化进入泡盛曲霉,表明根癌农杆菌介导泡盛曲霉转化具有可行性,所得转化子遗传稳定性高,适合作为异源蛋白的表达体系。

关键词：丝状真菌泡盛曲霉异源蛋白表达根癌农杆菌介导转化

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根癌农杆菌介导的丝状真菌转化及脂肪酶基因表达的研究

根癌农杆菌介导的丝状真菌转化及脂肪酶基因表达的研究

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作者：李俊星华南理工大学

学位级别：硕士

丝状真菌被广泛应用于生产重组蛋白正受到越来越多的关注。作为基因工程的受体菌,丝状真菌具有与细菌、酵母不同的独特优点:它们不仅具有很强的蛋白外分泌能力,并且更类似于高等真核生物,能够正确的进行各种翻译后加工。因此,丝状真菌... 详细信息

丝状真菌被广泛应用于生产重组蛋白正受到越来越多的关注。作为基因工程的受体菌,丝状真菌具有与细菌、酵母不同的独特优点:它们不仅具有很强的蛋白外分泌能力,并且更类似于高等真核生物,能够正确的进行各种翻译后加工。因此,丝状真菌不仅在工业酶制剂生产领域,同时在生物医药、食品安全、生物防治以及生物病理学等领域都有广泛的应用。随着基因工程技术的不断深入发展,越来越多的丝状真菌通过进行遗传转化作为外源蛋白表达宿主应用于工业生产等领域。因此,作为其中最关键的技术——遗传转化其作用显得越来越重要。本研究首先进行了野生型曲霉宿主的筛选标记试验,分别研究了潮霉素B、苯菌灵和吡啶硫胺素等3种药物以及乙酰胺氮源利用培养基对于8株工业上常用的曲霉生长的影响。结果表明,潮霉素B、苯菌灵和吡啶硫胺素对于黑曲霉SH-1野生株和泡盛曲霉CBS115.52野生株生长均具有很好的抑制作用,最佳作用浓度分别为100μg/mL、1.5μg/mL和0.1μg/mL,而对米曲霉IFO4177和寄生曲霉CICC2312等少数曲霉的抑制效果较差。在以乙酰胺为唯一氮源的培养基平板上,黑曲霉和泡盛曲霉等8株菌的生长均十分缓慢,抑制效果亦良好。利用Gateway克隆技术分别构建含有苯菌灵抗性基因和amdS基因的双元表达载体,并通过根癌农杆菌介导转化方法选用黑曲霉SH-1和泡盛曲霉CBS115.52作为宿主菌分别完成以上4种筛选标记基因的遗传转化,结果表明以上标记基因都已转化到黑曲霉和泡盛曲霉基因组中,并由此建立糖化酶工业生产菌野生株黑曲霉SH-1的农杆菌介导转化方法。在此基础上,将重组米黑根毛霉脂肪酶基因转入黑曲霉SH-1中,从DNA和蛋白水平对转化子进行了检测,筛选到稳定遗传的转化子并对其表达的脂肪酶酶活进行了初步发酵优化测定。

关键词：丝状真菌根癌农杆菌介导转化脂肪酶黑曲霉SH-1

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根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

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华南理工大学学报（自然科学版） 2012年第5期40卷 84-89页

作者：潘力王云艳王斌何攀李俊星华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉... 详细信息

黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15 U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.

关键词：无孢黑曲霉根癌农杆菌介导转化米黑根毛霉脂肪酶基因表达

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农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

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中国水稻科学 2006年第3期20卷 231-237页

作者：刘朋娟王政逸王秋华李德葆浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所浙江杭州310029

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮... 详细信息

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T-DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体:A1-412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1-412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1-412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern杂交显示A1-412基因组中T-DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1-412突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。

关键词：稻瘟病菌根癌农杆菌介导转化插入突变致病缺陷突变体

来源：评论

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