检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：陈少敏华中农业大学

学位级别：硕士

平菇菌丝疏水蛋白是真菌疏水蛋白中的一种，分子量在10~15 kDa之间，是一种活性非常强的表面活性剂。它能在两相界面自组装形成一种高度不溶的蛋白膜，改变界面的亲水性和疏水性，是在工业上应用十分广泛的一种蛋白。\n 本研究提取... 详细信息

平菇菌丝疏水蛋白是真菌疏水蛋白中的一种，分子量在10~15 kDa之间，是一种活性非常强的表面活性剂。它能在两相界面自组装形成一种高度不溶的蛋白膜，改变界面的亲水性和疏水性，是在工业上应用十分广泛的一种蛋白。\n 本研究提取平菇菌丝的总RNA，设计特异性引物，并分别加入SacⅠ、MluⅠ、BamHⅠ、AsuⅡ酶切位点，通过引物成功克隆得到***Ⅰ和***Ⅱ基因，其中***Ⅰ是无终止密码子（TAA），***Ⅱ为完整的疏水蛋白。将两段疏水蛋白基因片段连接pMD18-T载体，通过菌落PCR验证和测序分析，确定序列的正确性。用SacⅠ、BamHⅠ双酶切***Ⅰ和***Ⅱ，分别回收***Ⅰ片段和含***Ⅱ的T载体骨架片段，用T4连接酶连接并热击转化DH5α大肠感受态，经2h1-F/R引物菌落PCR验证并测序，确认两段疏水蛋白基因连接的正确性。提取pMD18-T-hyd-hyd质粒和pCAMBIA1302载体质粒，最后分别用MluⅠ、AsuⅡ双酶切融合疏水蛋白hyd-hyd质粒和pGEH-hyd质粒，回收hyd-hyd基因片段和pGEH-hyd骨架，连接并电击转化A. tumefaciens EHA105，再次经2H1-F/R引物和EH-F/R引物菌落PCR检测，并经MluⅠ、AsuⅡ双酶切进一步确定阳性转化子，成功构建银耳表达载体pEGH-H-H。\n 提取表达载体质粒通过脉冲电转仪将载体转入到根癌农杆菌EHA105中，经菌落PCR验证后，将转化的农杆菌与通过AS诱导后的银耳芽孢进行共培得到转化子。先后经过50μg/mL和100μg/mL潮霉素及200μg/mL头孢塞污筛选出拟转化子后，分别经过转化子PCR验证，实时荧光定量PCR分析，Southern blot印记杂交检测等技术进行验证，并最后成功提取出目标融合疏水蛋白。\n 对分离纯化后的疏水蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，分子量大小与平菇菌丝疏水蛋白的二聚体大小类似，表明目标蛋白成功表达。之后对融合疏水蛋白的起泡性和乳化性及其稳定性做了初步试验。转化子的起泡性达到70以上，明显优于平菇菌丝的46，且能长时间保持泡沫稳定性，乳化指数也到达35以上，高于平菇菌丝的25。结果表明融合疏水蛋白的起泡性和乳化性效果优于平菇菌丝疏水蛋白，性质得到了提升。

关键词：疏水蛋白银耳根癌农杆菌介导转化乳化性起泡性

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农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选

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作者：孔慧敏浙江大学

学位级别：硕士

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）可以引起水稻上的重要病害—稻瘟病。了解***的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义,而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。分离和鉴定稻瘟病菌... 详细信息

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）可以引起水稻上的重要病害—稻瘟病。了解***的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义,而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因,是达到这一目标的关键所在。DNA插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一,ATMT是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术,具有转化效率高、成本低,操作方便和重复性好多重优点。我们用含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的农杆菌介导稻瘟病菌（Guyll）转化,转化效率达每10～6个分生孢子＞300个转化子,并得到了1114个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。用感病大麦叶片离体接种的方法快速测定稻瘟病菌转化子的致病性,鉴定了致病性下降或缺陷的4个突变体,它们分别是A1-134,A1-452,A2-1-8和A1-3-6。进一步的表型分析发现:1)这些突变体对感病水稻品种的致病性也有不同程度的下降;2)A1-134突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7.8%,孢子形态为圆球形,只有一个分隔,而A1-452突变体产孢量明显增多,是野生菌株的20多倍;3)A2-1-8孢子为长形,在正常的疏水表面不形成附着胞;4)A1-3-6分生孢子为长形,基本没有没有致病性。用TAIL-PCR的方法获得了A1-134突变体的T-DNA左翼基因组序列,经测序和BLAST分析,外源T-DNA插入位点位于Ⅱ号染色体的MGG06868.5基因终止密码子下游228bp处,MGG06868.5基因全长2475bp,具有5个外显子和4个内含子,推测编码683个氨基酸的乙酰乳酸合成酶,与其他丝状真菌（麦胞菌、核盘菌、灰霉菌、球毛壳菌、子囊菌等）的乙酰乳酸合成酶同源性达70%以上。有关基因的后续功能验证和其他突变体的相关突变基因的研究正在进行之中。

关键词：稻瘟病菌根癌农杆菌介导转化插入突变致病缺陷突变体

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农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病相关基因研究

农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病...

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作者：柯金聪福建农林大学

学位级别：硕士

DNA插入突变是标记、分离植物病原真菌功能基因的有效途径之一。本实验通过电转化法将双元载体pATMT1导入农杆菌AGL-1中,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)转化,转化效率达每10～6个分生孢子＞250个转化子,并得到了... 详细信息

DNA插入突变是标记、分离植物病原真菌功能基因的有效途径之一。本实验通过电转化法将双元载体pATMT1导入农杆菌AGL-1中,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)转化,转化效率达每10～6个分生孢子＞250个转化子,并得到了1500多个转化子。对部分转化子的继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。用大麦叶片离体接种的方法快速测定稻瘟病菌转化子的致病性,发现2个致病缺陷突变体:A1-192和A1-139,5个转化子的生长速度明显减慢,8个转化子的产孢量明显减少。 A1-192菌株不能侵入感病大麦和水稻品种的叶片。A1-139突变体则不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,初步说明A1-139突变体的穿透和扩展进程同时被阻断。进一步的表型分析,发现A1-139突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的0.7%,在疏水表面不能形成附着胞。 Southern杂交显示A1-192基因组中的T-DNA为单拷贝插入,而A1-139基因组中T-DNA插入是双拷贝的。上述结果表明,A1-192突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。A1-139表型改变可能与两个T-DNA插入位点或其中之一的位点有关。分别用嵌套式反向PCR和HiTAIL-PCR扩增得到A1-192和A1-139突变体的插入T-DNA侧翼基因组序列。通过克隆、测序和BLAST分析,A1-192菌株的T-DNA插入点位于编码一个MAPK基因-MPS1(MGG 04943.5)启动起始位点ATG上游456bp处。而A1-139突变体T-DNA双拷贝分别插在MGG 01057.5和MGG 10568.5基因的CDS中。

关键词：稻瘟病菌根癌农杆菌介导转化插入突变致病缺陷突变体

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农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病突变体的筛选

农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稻瘟病菌转化及致病...

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作者：刘朋娟浙江大学

学位级别：硕士

稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)可以引起水稻上的重要病害—稻瘟病。了解M. grisea的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义,而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。分离和鉴定稻瘟... 详细信息

稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)可以引起水稻上的重要病害—稻瘟病。了解M. grisea的致病分子机理不仅对防治稻瘟病具有重要的意义,而且它作为一个理想的研究体系对了解其他植物病原真菌与寄主的相互作用也有重要的意义。分离和鉴定稻瘟病菌的致病相关基因,是达到这一目标的关键所在。DNA插入突变是标记、分离功能基因的有效途径之一,ATMT是丝状真菌遗传转化的一个的新的技术,具有转化效率高、成本低,操作方便和重复性好多重优点。我们在构建了二个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每10～6个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T-DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体:Al-412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明Al-412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析,发现Al-412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发的速度也略有延迟。Southern杂交显示Al-412基因组中T-DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,Al-412突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。

关键词：稻瘟病菌根癌农杆菌介导转化插入突变致病缺陷突变体

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香灰菌gpd启动子的克隆及功能验证

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食品工业科技 2019年第17期40卷 97-103页

作者：陈悦刘冬梅许丹云王媛媛马爱民华中农业大学食品科学技术学院

为了构建香灰菌的转化体系,研究香灰菌的基因功能,需要获得高活性的启动子元件。本实验通过PCR技术分别克隆得到gpd基因以及其基因上游约1000 bp序列,使用Neural Network Promoter Prediction、Signal Scan Search Request、PLANTCAREA ... 详细信息

为了构建香灰菌的转化体系,研究香灰菌的基因功能,需要获得高活性的启动子元件。本实验通过PCR技术分别克隆得到gpd基因以及其基因上游约1000 bp序列,使用Neural Network Promoter Prediction、Signal Scan Search Request、PLANTCAREA database软件分析发现,gpd基因上游区域内不仅包含启动子所需的特征核心元件TATA-box、CAAT-box、G-box、GC-box、CT-rich等,还含有一个高分值的转录起始位点。为进一步验证该序列的启动子功能,将gpd启动子元件与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)和潮霉素基因(hph)连接构建成融合表达载体,通过根癌农杆菌介导将其转化香灰菌丝。潮霉素抗性筛选、绿色荧光蛋白检测结果显示,香灰菌gpd启动子成功驱动了潮霉素抗性基因和增强型绿色荧光蛋白基因的表达,根癌农杆菌介导转化成功,为香灰菌外源基因表达及基因功能的研究奠定了基础。

关键词：香灰菌 gpd 启动子载体构建根癌农杆菌介导转化

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融合疏水蛋白在银耳中的异源表达

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食品工业科技 2018年第14期39卷 115-119页

作者：陈少敏朱涵予刘冬梅许丹云马爱民华中农业大学食品科学技术学院湖北武汉430070

为改善疏水蛋白的性质,充分利用疏水蛋白和银耳的可食性优势,将平菇疏水蛋白基因hyd与去除终止密码子的hyd拼接,形成融合疏水蛋白H-H,并构建其表达载体p EGH-H-H。通过电击法将p EGH-H-H导入到根癌农杆菌EHA105中,并转化到银耳芽孢。转... 详细信息

为改善疏水蛋白的性质,充分利用疏水蛋白和银耳的可食性优势,将平菇疏水蛋白基因hyd与去除终止密码子的hyd拼接,形成融合疏水蛋白H-H,并构建其表达载体p EGH-H-H。通过电击法将p EGH-H-H导入到根癌农杆菌EHA105中,并转化到银耳芽孢。转化子经潮霉素抗性筛选,PCR检测后,随机挑取10个转化子进行Southern blot,筛选获得高拷贝且能稳定遗传的转化子。实时荧光定量PCR分析显示5号转化子的疏水蛋白相对表达量是野生型的11.4倍。最后提取5号转化子中的融合疏水蛋白,经SDS-PAGE检测,证明融合疏水蛋白在银耳中成功异源表达。起泡性和乳化性实验表明,转化子融合疏水蛋白较平菇疏水蛋白有一定的提升。

关键词：融合疏水蛋白根癌农杆菌介导转化银耳起泡性乳化性

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南丰蜜橘胚性愈伤组织诱导及其转化研究

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中国农学通报 2009年第8期25卷 42-45页

作者：段艳欣范净郭文武华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室武汉430070 青岛农业大学园林园艺学院山东青岛266109

南丰蜜橘是原产于中国的古老柑橘品种,其果实皮薄而肉甜,深受消费者喜爱,当前南丰蜜橘的品质发生劣变,影响了其商品价值。为采用基因工程育种以改善南丰蜜橘品质,通过诱导其愈伤组织并以其为试材进行了转基因研究。南丰蜜橘自种子实生... 详细信息

南丰蜜橘是原产于中国的古老柑橘品种,其果实皮薄而肉甜,深受消费者喜爱,当前南丰蜜橘的品质发生劣变,影响了其商品价值。为采用基因工程育种以改善南丰蜜橘品质,通过诱导其愈伤组织并以其为试材进行了转基因研究。南丰蜜橘自种子实生苗下胚轴处长产生出愈伤组织,挑选胚性愈伤组织进行增殖后,采用根癌农杆菌介导法进行开花相关基因AP1的转化。结果获得22团抗性愈伤组织,平均产出率为7.3团/皿,表明该品种有较高的转化率。抗性愈伤组织经PCR分析、Southern blot检测证实为转化子。研究结果表明南丰蜜橘胚性愈伤组织是基因工程改良的良好受体,可用于其他基因的转化研究。

关键词：根癌农杆菌介导转化胚性愈伤组织南丰蜜橘 PCR分析 Southern blotting检测

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稻瘟病菌T-DNA插入的突变表型分析

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农业生物技术学报 2007年第5期15卷 877-883页

作者：贺春萍林春花廖奇亨李锐郑服丛中国热带农业科学院环境与植物保护研究所华南热带农业大学环境与植物保护学院

PCR技术检测28个形态发育和致病性相关T-DNA插入突变体,结果所有突变体均含磷酸转移酶基因序列。观察这些突变体的生物学性状,发现15个颜色异常,8个菌落生长缓慢,2个分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞。致病性测定... 详细信息

PCR技术检测28个形态发育和致病性相关T-DNA插入突变体,结果所有突变体均含磷酸转移酶基因序列。观察这些突变体的生物学性状,发现15个颜色异常,8个菌落生长缓慢,2个分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞。致病性测定结果表明,9个突变体完全丧失对抗瘟(C101)和感瘟(日本晴)水稻苗的致病能力。用标准菌株1528和P131测定突变体有性世代的形成能力,结果发现3个突变体(Y34-0211、Y34-1469和Y34-0635)完全丧失产生有性世代的能力。

关键词：稻瘟病菌根癌农杆菌介导转化 T-DNA插入突变功能基因组学

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出芽短梗霉双产物发酵及其应用研究

出芽短梗霉双产物发酵及其应用研究

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作者：胡丹南开大学

学位级别：硕士

聚苹果酸poly(β-L-malic acid)(PMLA)是一种以L-苹果酸为唯一单体的完全生物可降解性高分子聚合物，具有极佳的水溶性、易修饰性、易代谢性和生物相溶性，是一种具有广阔应用前景的生物学材料。　　本研究利用出芽短梗霉Aureobasidium... 详细信息

聚苹果酸poly(β-L-malic acid)(PMLA)是一种以L-苹果酸为唯一单体的完全生物可降解性高分子聚合物，具有极佳的水溶性、易修饰性、易代谢性和生物相溶性，是一种具有广阔应用前景的生物学材料。　　本研究利用出芽短梗霉Aureobasidium pullulans IFO6353发酵合成PMLA，同时得到其胞外水溶性多糖普鲁兰。普鲁兰是一种优良的高分子材料，具有重要的工业应用价值。　　有机溶剂沉淀法和透析法对发酵液中的PMLA和普鲁兰多糖进行分离纯化。核磁共振(NMR)和傅立叶红外吸收光谱(FT-IR)对产物进行了结构分析。凝胶渗透色谱(GPC)测定PMLA的分子量，其Mw和Mn分别是是8505和8326。在单因素试验的基础上应用正交试验法对Aureobasidium pullulans IFO6353发酵培养基进行优化。利用优化后的培养基进行发酵，与优化前相比较，其产率提高了41.8％。优化后的最高产率比初始培养基的产率提高了约12倍，最高产率达2.0809 g/L。　　利用ATMT(Agrobacterum tumefaciens-mediated transformation)方法，通过与重组根癌农杆菌LBA4404Hyg共培养，得到了一株黑色素合成缺陷的基因工程菌。利用细胞核染色和PCR方法对于获得的工程菌进行了检证。采用潮霉素特异性引物对该突变株的基因组总DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示得到了目的条带。对该基因工程菌进行发酵研究，其初始聚苹果酸合成产率为0.1058 g/L。　　聚苹果酸与十四烷基三甲基溴化铵(MTAB)通过静电作用生成两亲型梳形复合物PMLA-MTAB。利用核磁共振法检测产物。应用透析法制备复合物包载紫杉醇的纳米粒子。通过MTT法比较胶束包载紫杉醇与单纯紫杉醇对Hela癌细胞的增殖抑制作用。结果显示，PMLA-MTAB载药胶束与单纯紫杉醇给药方式对比，相同浓度下能起到相似的抑制效果。两亲型疏水型复合物PMLA-MTAB有望作为疏水性抗癌药物的新型控释材料。

关键词：出芽短梗霉双产物发酵根癌农杆菌介导转化自组装聚苹果酸发酵合成

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烟草疫霉G蛋白α亚基基因的克隆和敲除研究

烟草疫霉G蛋白α亚基基因的克隆和敲除研究

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作者：路则宝云南大学

学位级别：硕士

烟草黑胫病是全球主要的烟草病害之一，其病原真菌是烟草疫霉(Phytophthora parasitica ***)，可以造成多种作物的病害。甲霜灵(metalaxyl)属于苯酰氨类内吸性杀菌剂，起初被广泛应用于防治包括烟草疫霉在内的许多重要植物病原真菌。但... 详细信息

烟草黑胫病是全球主要的烟草病害之一，其病原真菌是烟草疫霉(Phytophthora parasitica ***)，可以造成多种作物的病害。甲霜灵(metalaxyl)属于苯酰氨类内吸性杀菌剂，起初被广泛应用于防治包括烟草疫霉在内的许多重要植物病原真菌。但是由于长期使用该作用位点单一的内吸性杀菌剂，很容易使其与病原菌作用靶点亲和性降低而产生抗药性。G蛋白是细胞内一类非常重要的信号转导蛋白，大多数膜受体都通过与G蛋白偶联而将信号传导到细胞内下游效应分子。G蛋白由三个亚基组成，当外部有信号时，G蛋白偶联受体与其相应的配体结合，使α亚基上的GDP与GTP交换。G蛋白α亚基与GTP的结合导致G蛋白解离为Gα-GTP和Gβγ，两个亚单位可以分别激活下游的效应分子，从而产生多种生物学效应。\n 本文对烟草疫霉进行了单孢分离和鉴定，对烟草疫霉的生物学性状进行了研究，包括烟草疫霉对甲霜灵抗性水平、生长速率的快慢和对渗透压的敏感性等。然后以烟草疫霉菌株单孢分离物2407为出发菌株对G蛋白α亚基编码基因进行了克隆，通过RT-PCR定性研究了其在烟草疫霉不同生长阶段的表达情况。并采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的真菌遗传转化方法，通过DNA同源重组技术敲除了烟草疫霉甲霜灵敏感菌株62804的G蛋白α亚基基因，通过比较野生型菌株和G蛋白α亚基基因敲除后的突变转化子的生物学性状，进一步分析了烟草疫霉G蛋白α亚基调节的信号通路对烟草疫霉生长速率、孢子囊的产生、游动孢子的释放、渗透压的敏感性和抗药性水平的影响。主要结果如下：\n 1.分离得到4株不同甲霜灵抗性水平的烟草疫霉并进行了鉴定，发现菌株生长速率的快慢、对渗透压的敏感性与对甲霜灵抗性水平呈现一定的相关性。\n 2.根据GenBank报道的其他疫霉菌的G蛋白α亚基编码基因保守序列设计简并引物，通过DNA Walking技术克隆得到烟草疫霉G蛋白α亚基编码基因全长序列(2970-bp)。并根据克隆得到的全长序列设计特异性引物，通过RT-PCR克隆得到全长cDNA序列。\n 3.以烟草疫霉的菌丝、孢子囊和游动孢子三个不同无性阶段生物体为材料提取的总RNA作模板，对烟草疫霉G蛋白α亚基的表达情况进行RT-PCR分析，结果显示烟草疫霉G蛋白α亚基基因在菌丝、孢子囊和游动孢子三个不同无性阶段都能稳定的表达，而不像大豆疫霉(Phytophthora sojae strain P6497)和致病疫霉(Phytophthora infestan strain88069)那样只在孢子囊和游动孢子中特异性的表达。\n 4.对烟草疫霉遗传转化的关键条件和影响因素进行了摸索和优化，建立了根癌农杆菌介导烟草疫霉遗传转化体系，得到了遗传稳定的阳性转化子；通过对野生型菌株和重组转化子的生物学特征对比发现烟草疫霉G蛋白α亚基调节的信号传导通路调控烟草疫霉菌丝生长速率、孢子囊的产生、游动孢子释放、渗透压的敏感性和抗药性水平。\n 论文的创新性主要体现为：\n 1.首次从烟草疫霉中克隆得到G蛋白α亚基的全长编码基因，并对其在不同无性生殖阶段的表达情况进行了RT-PCR分析。\n 2.建立和优化了农杆菌介导的烟草疫霉遗传转化体系，并利用同源重组技术成功实现了目标基因的敲除，为烟草疫霉基因功能研究提供了一个有效的手段。对烟草疫霉G蛋白α亚基调节的信号传导通路对烟草疫霉生长速率、孢子囊的产生、游动孢子的释放、渗透压的敏感性和抗药性水平的影响进行了研究。

关键词：烟草疫霉甲霜灵抗药性 G蛋白α亚基根癌农杆菌介导转化基因克隆

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