检索结果-内蒙古大学图书馆

免疫学杂志 2012年第5期28卷 394-397,402页

作者：崔志刚刘刚潘进勇路浩军张立新解放军306医院泌尿外科北京100101

目的观察MUC1的模拟表位肽对表达人MUC1 T739荷瘤小鼠的治疗作用。方法建立稳定表达人MUC1 T739荷瘤小鼠,培养T739小鼠成熟树突状细胞,荷瘤小鼠随机分为4组,用负载模拟表位肽成熟DC免疫表达人MUC1 T739荷瘤小鼠,第1组皮下注射等渗盐水,... 详细信息

目的观察MUC1的模拟表位肽对表达人MUC1 T739荷瘤小鼠的治疗作用。方法建立稳定表达人MUC1 T739荷瘤小鼠,培养T739小鼠成熟树突状细胞,荷瘤小鼠随机分为4组,用负载模拟表位肽成熟DC免疫表达人MUC1 T739荷瘤小鼠,第1组皮下注射等渗盐水,第2组注射空DC,第3组注射负载1号肽的DC,第4组注射负载2号肽的DC,测量肿瘤大小,计算肿瘤体积,称瘤重,并观察小鼠存活期。结果两组DC+肽免疫的小鼠瘤体积减小明显,与1、2组相比差异非常显著(P<0.01)。平均瘤重1、2组与3、4组相比差异非常显著(P<0.01)。第1～4组荷瘤鼠的生存期分别为(34.6±3.507)d,(35.2±3.564)d,(58.4±5.595)d,(59±6.819)d,3、4两组荷瘤小鼠生存期较1、2组明显延长,差异有显著性意义(P<0.01)。结论 MUC1模拟表位肽能明显抑制表达人MUC1 T739荷瘤小鼠肿瘤生长,显著延长T739荷瘤小鼠生存时间。

关键词： MUC1粘蛋白模拟抗原表位肿瘤疫苗膀胱癌

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MUC1抗原模拟表位的筛选及鉴定

MUC1抗原模拟表位的筛选及鉴定

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作者：杨清浩第三军医大学

学位级别：博士

MUC1蛋白是一种高分子量糖蛋白,在人膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腺上皮细胞均有表达。MUC1可作为免疫治疗的靶点是基于以下特点:(1)肿瘤细胞表达量增高,为正常的100倍以上;(2)肿瘤细胞MUC1广泛分布,而正常细胞MUC1呈极性分布;(3)... 详细信息

MUC1蛋白是一种高分子量糖蛋白,在人膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腺上皮细胞均有表达。MUC1可作为免疫治疗的靶点是基于以下特点:(1)肿瘤细胞表达量增高,为正常的100倍以上;(2)肿瘤细胞MUC1广泛分布,而正常细胞MUC1呈极性分布;(3)糖链的糖基化不全,导致正常情况下隐蔽的肽链表位暴露。MUC1的免疫原性区域主要位于该蛋白分子胞外段的20个氨基酸重复序列区域(VNTR)。MUC1能引起T细胞免疫应答 ,通过T细胞受体直接识别,不受主要组织相容性复合体限制。MUC1还能引起B细胞免疫应答产生抗体。目前已有多种基于MUC1的免疫原作为疫苗用于肿瘤治疗的研究 ,有些已经进入临床试验阶段。为分析研究MUC1蛋白的结构和功能关系,了解其表面特性,本课题首先在方法学比较的基础上,联合运用多种方法对MUC1蛋白的二级结构和表面特性,如理化性质、亲水性、免疫原性等方面进行分析和预测。结果发现: MUC1存在有多个潜在的抗原表位位点; 位于胞外段的抗原表位位点见于VNTRs(含PDTR) 140aa-156aa, 159aa-174aa,179aa-196aa。选择针对该核心抗原表位的单抗,用于筛选随机肽库,有可能获得其抗体识别的模拟表位。采用离子交换柱层析从腹水中纯化了针对MUC1蛋白的鼠源性BC2抗体,洗脱液第3峰(命名为BC2 D3)含有纯度较高的BC2抗体(22KD、52KD),经Kodak成像系统进行扫描,所得BC2蛋白纯度约为90%,可用于MUC1抗原模拟表位的筛选。运用噬菌体随机7肽库技术,以纯化的BC2抗体为靶蛋白,进行噬菌体随机肽库 3 轮筛选,根据插入区的核酸序列推导出外源多肽的氨基酸序列,获得了MUC1抗原模拟表位TAPDLRP(x19),SAPDLRP(x9),AAPDSRP(x1)及 LAPDFRP (x1)。比较所获得的多肽氨基酸序列,依据其氨基酸序列同源程度,获得其同源性基序:XAPDXRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上,能较大程度地特异性抑制抗原抗体结合,提示这些阳性克隆的外源肽具有一定的MUC1抗原模拟功能。为证实模拟抗原的免疫原性,进一步用展示MUC1抗原模拟表位的噬菌体阳性克隆免疫小鼠,3次免疫小鼠后,血清(1:1000)中能检测到较强的MUC1抗体阳性;以最大OD450值之纯化血清做为一抗行蛋白印迹分析,结果显示:纯化血清可识别 MUC1蛋白;小鼠脾脏淋巴细胞增殖率检测结果表明:噬菌体展示肽表位可在无佐剂存在情况下,大大促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖,证明噬菌体是一较好的生物载体。结果表明该模拟抗原免疫小鼠后能激发体液及细胞免疫应答,具有良好的免疫原性。本研究对MUC1二级结构和表面特性的分析结果,为进一步研究MUC1结构和功能、构建MUC1突变体和选择表达新型MUC1分子奠定了基础。通过噬菌体随机肽库的筛选,获得了MUC1抗原模拟表位,为将来研制人上皮来源性肿瘤疫苗奠定了实验基础。

关键词： MUC1蛋白模拟抗原表位噬菌体展示随机7肽库肽抗体

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MUC1模拟表位疫苗筛选和治疗小鼠膀胱癌效应

MUC1模拟表位疫苗筛选和治疗小鼠膀胱癌效应

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作者：崔志刚第三军医大学

学位级别：博士

目的:从噬菌体随机12肽库中筛选新的MUC1的模拟表位,观察其免疫学特性,以及诱导机体产生特异性免疫应答和对小鼠膀胱癌的治疗作用。构建MUC1模拟表位原核表达载体,获得特异、纯化的模拟表位融合蛋白。本研究为研制针对MUC1为靶点的肿瘤... 详细信息

目的:从噬菌体随机12肽库中筛选新的MUC1的模拟表位,观察其免疫学特性,以及诱导机体产生特异性免疫应答和对小鼠膀胱癌的治疗作用。构建MUC1模拟表位原核表达载体,获得特异、纯化的模拟表位融合蛋白。本研究为研制针对MUC1为靶点的肿瘤疫苗奠定基础,为膀胱癌治疗提供新方法。方法:1.选用抗MUC1多肽表位的单克隆抗体BC2为筛选配基,利用噬菌体展示技术,从噬菌体随机12肽库中,通过3轮生物淘洗、测定噬菌体滴度、扩增噬菌斑、挑选特异性阳性噬菌体克隆,通过ELISA实验鉴定阳性噬菌体克隆与单克隆抗体BC2结合活性;抽提阳性噬菌体克隆的插入肽ssDNA模板,测定其DNA序列,按遗传密码表推导出插入肽的氨基酸序列,同MUC1核心肽表位序列APDTR进行比较,从中选出与原表位序列不同的模拟表位。利用表位预测专用数据库SYFPEITHI database进行氨基酸序列的表位预测,根据抗原肽的基序特征计算其积分,判断其与MHCⅠ类分子结合能力,合成相应的模拟表位肽,通过竞争ELISA实验判断模拟表位肽能否特异性抑制单克隆抗体BC2与MUC1抗原结合,进一步鉴定筛选出的MUC1模拟表位活性。2.利用阳离子脂质体介导转染方法,将人MUC1全长cDNA转入T739小鼠膀胱癌细胞BST739中,经G418筛选和克隆化培养,基因组PCR、RT-PCR、免疫组化、流式细胞仪从不同水平检测MUC1的表达,建立稳定表达人MUC1T739小鼠膀胱癌细胞株,观察转入人MUC1肿瘤细胞体内外生长特性和体内致瘤性。3.无菌取T739小鼠股骨和胫骨,PBS冲出骨髓细胞,红细胞裂解液裂解红细胞,按2×106/ml的细胞密度加入含有树突状细胞(DC)专用培养基塑料培养皿,同时加入细胞因子rmGM-CSF,rmIL-4 1000U/ml,37℃,5% CO2体外培养,第6天加入LPS(1μg/ml)刺激DC成熟,第7天收集细胞,显微镜下观察成熟DC形态,流式细胞仪检测成熟DC标记33D1单抗的表达以判断DC纯度。4.体外用合成的模拟表位肽刺激成熟DC,PBS洗涤三次,然后分别用PBS,未刺激的DC,MUC1模拟表位肽刺激的DC,通过小鼠尾静脉注射,免疫T739小鼠,每只注射2×105细胞,每周免疫一次,共三次。

关键词： MUC1粘蛋白噬菌体展示肽库模拟抗原表位肿瘤疫苗膀胱癌克隆表达

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噬菌体展示日本血吸虫SSj14单抗的模拟表位及免疫保护性研究

噬菌体展示日本血吸虫SSj14单抗的模拟表位及免疫保护性研究

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作者：王欣之扬州大学

学位级别：硕士

目的:用日本血吸虫保护性单抗ssj14从噬菌体随机十二肽库中筛选日本血吸虫（schistosoma japonicum,sj）的保护性模拟抗原表位,并研究其在日本血吸虫保护性免疫预防中的作用及机理。方法:用纯化的ssj14单抗筛选噬菌体展示随机十二肽... 详细信息

目的:用日本血吸虫保护性单抗ssj14从噬菌体随机十二肽库中筛选日本血吸虫（schistosoma japonicum,sj）的保护性模拟抗原表位,并研究其在日本血吸虫保护性免疫预防中的作用及机理。方法:用纯化的ssj14单抗筛选噬菌体展示随机十二肽库,经三轮筛选,阳性噬菌体克隆得到富集,并以常规ELISA法检测到噬菌体单个克隆,同时随机挑取33个阳性噬菌体克隆进行测序,得到11种多肽序列。用11个噬菌体克隆分别与虫卵可溶性抗原（SEA）进行竞争ELISA试验以检测噬菌体克隆的免疫活性,同时用ssjl4单抗对噬菌体克隆进行Western-blotting分析。根据所得的检测结果,选取3个具有免疫活性的噬菌体克隆及富集后的混合噬菌体,按1.5×1011pfu/鼠的剂量与弗氏佐剂混合,在0,2,4周,皮下注射免疫BALB/c鼠,以原始肽库和TBS为对照组。于末次免疫后两周,按40±1条/鼠腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴。攻击感染42天后剖杀所有小鼠,计数获检虫体数和虫卵数,计算各组减虫率和减卵率。分别在免疫及攻击感染0,2,4,6,8,12周时,小鼠眼眶窦采血,常规方法分离血清,检测三免之后小鼠血清中IL-12的浓度以及小鼠血清内抗体滴度。选择上述一条代表性多肽HNNSLPFFKLAT人工合成后,与BSA偶连,分别以弗氏佐剂和IL-12（1ug/鼠）为佐剂,按合成多肽40ug/鼠剂量免疫小鼠。分别以合成多肽和SEA为抗原建立ELISA方法,检测40份小鼠感染血清和20份小鼠健康血清并分析比较。结果:三轮筛选后,阳性噬菌体得到有效富集,直接ELISA检测到阳性克隆率为90%,对30个随机阳性噬菌体克隆进行测序,得到11种多肽序列,分别为

关键词：噬菌体展示日本血吸虫ssj14单抗模拟抗原表位 IL-12免疫保护

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MUC1模拟表位肽对表达人MUC1 T739小鼠膀胱癌细胞的细胞毒作用的实验研究

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中华临床医师杂志（电子版） 2012年第2期6卷 75-78页

作者：崔志刚刘刚裘辉潘进勇路浩军张立新解放军第306医院泌尿外科北京100101

目的观察MUC1模拟表位肽对表达人MUC1T739小鼠膀胱癌细胞的细胞毒作用。方法培养、诱导T739小鼠骨髓成熟树突状细胞,流式细胞仪鉴定纯度,用负载模拟表位肽成熟树突状细胞免疫T739小鼠,酶联免疫斑点(ELISPOT)检测活化的模拟表位特异性T细... 详细信息

目的观察MUC1模拟表位肽对表达人MUC1T739小鼠膀胱癌细胞的细胞毒作用。方法培养、诱导T739小鼠骨髓成熟树突状细胞,流式细胞仪鉴定纯度,用负载模拟表位肽成熟树突状细胞免疫T739小鼠,酶联免疫斑点(ELISPOT)检测活化的模拟表位特异性T细胞,用非放射性乳酸脱氢酶法检测不同效:靶比例时活化的模拟表位特异性T细胞体外细胞毒效应。结果培养出成熟树突状细胞,纯度为78.8%,肽免疫的T739小鼠特异性分泌IFN-γ的T细胞频数是106.5±12.8,而PBS和DC+PBS组频数均少于10,数量明显少于肽+DC组。当效靶比为100:1时肽免疫的T739小鼠产生的活化T淋巴细胞具有显著细胞毒功能,与PBS和DC+PBS免疫小鼠相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论负载MUC1模拟表位肽的树突状细胞免疫小鼠,可诱导产生特异性细胞毒性T细胞。

关键词：膀胱肿瘤 CA-15-3抗原 T淋巴细胞细胞毒性模拟抗原表位

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HSV-2gD核酸疫苗的构建及免疫效果观察

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第5期28卷 458-461页

作者：焦凤萍刘莉王玉于爱莲于广福泰山医学院病原学教研室山东泰安271016 城市疾病预防控制中心山东聊城252000

目的:在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建P6与IL-18串联的重组表达质粒,并在真核细胞中表达。将重组质粒免疫小鼠,观察免疫效果。方法:采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-I... 详细信息

目的:在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建P6与IL-18串联的重组表达质粒,并在真核细胞中表达。将重组质粒免疫小鼠,观察免疫效果。方法:采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18,以酶切、测序鉴定。将重组质粒分别转染CHO细胞进行瞬时表达,通过间接免疫荧光和Western blot法检测P6的表达情况。将构建的真核表达质粒肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔1周。末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后1个月,处死小鼠,无菌分离脾脏,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率。结果:构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,经间接免疫荧光、Western blot法检测可证实模拟抗原表位序列P6具有近似天然序列的生物学活性。重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体的产生,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18。可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论:成功构建和表达了重组质粒pcD-NA3.1-IL18-P6,其能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,从而为构建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基础。

关键词：单纯疱疹病毒白细胞介素-18 模拟抗原表位疫苗

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用噬菌体模拟抗原检测白念珠菌菌丝蛋白抗体的研究

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中华检验医学杂志 2005年第9期28卷 912-914页

作者：李芳秋邵海枫王卫萍郝秀芳南京军区南京总医院全军医学检验中心 210002

目的用噬菌体展示文库技术制备白念珠菌菌丝蛋白模拟抗原,建立测定白念珠菌抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。方法用抗白念珠菌菌丝蛋白P47的单克隆抗体从噬菌体随机12肽库中筛选能与之免疫学结合的肽,即模拟抗原表位。将该模拟抗原包... 详细信息

目的用噬菌体展示文库技术制备白念珠菌菌丝蛋白模拟抗原,建立测定白念珠菌抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。方法用抗白念珠菌菌丝蛋白P47的单克隆抗体从噬菌体随机12肽库中筛选能与之免疫学结合的肽,即模拟抗原表位。将该模拟抗原包被微孔板,用于酶联免疫吸附测定法测定病人血清白念珠菌菌丝蛋白抗体。结果用噬菌体模拟抗原建立ELISA,其敏感性、特异性及重复性良好,测定了10份确诊白念珠菌侵袭性感染的病人血清,全部阳性,与用纯化的菌丝蛋白抗原P47测定结果一致;服用免疫抑制剂患者血清阳性率33%,健康人群阳性率为2%。结论用抗白念珠菌菌丝蛋白单克隆抗体从噬菌体展示随机肽库筛到的噬菌体模拟抗原可代替白念珠菌P47抗原进行抗体测定。

关键词：噬菌体分子模拟白念珠菌抗原抗体酶联免疫吸附测定噬菌体展示文库模拟抗原表位白念珠菌蛋白抗体抗原检测

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噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位

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中国兽医学报 2013年第12期33卷 1818-1821,1827页

作者：许达李春玲李淼宋帅杨冬霞陈金顶华南农业大学兽医学院广东广州510642 广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生实验室广东广州510640

为了研究副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和Western blot等检验,最终确定了4个各结果... 详细信息

为了研究副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和Western blot等检验,最终确定了4个各结果均为阳性的优势短肽。将4个短肽序列与GenBank中HPS外膜蛋白p5的序列进行比对分析,发现这些序列没有同源性或同源性较低,但竞争ELISA结果显示这些短肽与单抗的结合都能够被外膜蛋白P5有效的抑制。以上结果显示,通过噬菌体展示技术成功获得了4个HPS外膜蛋白P5的模拟表位,为后期开展以抗原表位为基础的诊断、表位疫苗等研究提供了依据。

关键词：副猪嗜血杆菌外膜蛋白噬菌体展示模拟抗原表位

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应用噬菌体展示技术对对虾白斑综合症病毒（WSSV）中和抗体及感染相关蛋白的研究

应用噬菌体展示技术对对虾白斑综合症病毒（WSSV）中和抗体及感染...

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作者：袁丽中国科学院研究生院（水生生物研究所）

学位级别：博士

对虾白斑综合症自1992年爆发以来,以其传播速度快,致死率高的特点,对全世界各国的对虾养殖业造成了严重的威胁。引起该病的病原体——对虾白斑综合症病毒(WSSV),在分类学上已经被鉴定为一个新的病毒家族中的新种,其结构非常复杂,对其感... 详细信息

对虾白斑综合症自1992年爆发以来,以其传播速度快,致死率高的特点,对全世界各国的对虾养殖业造成了严重的威胁。引起该病的病原体——对虾白斑综合症病毒(WSSV),在分类学上已经被鉴定为一个新的病毒家族中的新种,其结构非常复杂,对其感染宿主的分子机理的研究难以借鉴已知病毒的研究结果。而且对虾细胞系尚未成功建立,这对WSSV中和抗体的筛选及感染相关蛋白的研究带来了困难。为此,本研究应用噬菌体展示技术对WSSV的中和抗体及感染相关蛋白进行了研究。本研究以对虾淋巴原代细胞培养为基础,建立了一种高通量体外筛选中和抗体的方法。应用该方法对本实验室已获得的抗WSSV的单链抗体进行筛选,得到了一个能够阻止WSSV与对虾淋巴原代培养细胞结合的单链抗体P1D3。活体中和实验也证实该单链抗体具有一定的中和作用。由于单链抗体是在大肠杆菌中表达和制备的,能够低成本,快速地进行无限扩增,因此该单链抗体有望发展成一种具有抗病毒能力的对虾饲料添加剂。为了完善上述已建的立体外筛选中和抗体的方法,本实验还建立了一种新的荧光定量PCR方法,对WSSV病毒粒子进行定量分析,并将该方法应用到体外筛选中和抗体的方法中。实验证明纯化的WSSV病毒悬液不需要提取DNA而可以直接作为FQ-PCR的模板进行扩增,并且能准确测定模板DNA的拷贝数,从而使该体外中和抗体筛选方法操作更为方便,也更为准确。为研究单链抗体P1D3对应于WSSV上的抗原模拟表位,本研究以pCANTAB 5 E噬菌粒为载体,构建了较高容量的噬菌体展示随机十肽库,并用一种已知抗原的能与WSSV特异性结合的单链抗体A1对噬菌体展示随机肽库进行淘选,得到了一系列的阳性多肽序列。根据这些阳性多肽的氨基酸序列相似性比对分析,对单链抗体A1的抗原模拟表位做出了预测。随后对单链抗体P1D3也进行了相同的研究,得到了大量的阳性多肽序列,但是尚未成功得到P1D3的抗原模拟表位,这部分研究工作有待进一步深入。本研究还优化了对活体对虾进行体内淘选和器官体外淘选的方法,并对T7噬菌体展示的WSSV cDNA文库进行了淘选,以期获得能与对虾相关器官上的

关键词：对虾白斑综合症病毒(WSSV) 噬菌体展示中和抗体单链抗体(scFv) 荧光定量PCR 原代细胞培养模拟抗原表位体外淘选体内淘选病毒感染相关蛋白

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HSV-2NP6与IL-18真核表达载体的构建与表达

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中国病原生物学杂志 2011年第6期6卷 404-407,396页

作者：焦凤萍刘莉于爱莲王玉于广福泰山医学院病原学教研室山东泰安271000 聊城市疾病预防控制中心山东聊城252000

目的在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,在GenBank上选取与P6序列相对应且相似的HSV-2天然野生株gD的基因序列NP6,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建和表达NP6与IL-18串联的重组表达质粒,并观察免疫小鼠后的效果。方... 详细信息

目的在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,在GenBank上选取与P6序列相对应且相似的HSV-2天然野生株gD的基因序列NP6,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建和表达NP6与IL-18串联的重组表达质粒,并观察免疫小鼠后的效果。方法采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6和pcDNA3.1-IL18。将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-18和pcDNA3.1-IL-18-HSVNP6肌内注射免疫BALB/c小鼠3次,每次间隔1周。末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量。结果构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,间接免疫荧光、Western blot检测证实模拟抗原表位序列NP6具有近似天然序列的生物学活性;用表达质粒免疫小鼠,可刺激产生高滴度的特异性抗体,并可产生较高水平的IL-18和IFN-γ。结论成功构建和表达了重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6,表达产物具有免疫原性。

关键词：单纯疱疹病毒 IL-18 模拟抗原表位真核表达

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