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T=题名（书名、题名），A=作者（责任者），K=主题词，P=出版物名称，PU=出版社名称，O=机构（作者单位、学位授予单位、专利申请人），L=中图分类号，C=学科分类号，U=全部字段，Y=年（出版发行年、学位年度、标准发布年）

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AND代表“并且”；OR代表“或者”；NOT代表“不包含”；(注意必须大写,运算符两边需空一格)

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范例一：(K=图书馆学 OR K=情报学) AND A=范并思 AND Y=1982-2016
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119 篇 期刊文献
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日期分布

学科分类号

154 篇 医学
- 92 篇 基础医学(可授医学...
- 33 篇 临床医学
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- 18 篇 公共卫生与预防医...
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- 5 篇 轻工技术与工程
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- 1 篇 控制科学与工程
- 1 篇 纺织科学与工程
- 1 篇 农业工程
- 1 篇 生物医学工程（可授...
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- 2 篇 公共管理

主题

232 篇 模拟表位
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28 篇 噬菌体肽库
27 篇 噬菌体展示
23 篇 噬菌体展示肽库
19 篇 丙型肝炎病毒
18 篇 噬菌体随机肽库
17 篇 赭曲霉毒素a
15 篇 噬菌体展示技术
13 篇 免疫原性
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11 篇 噬菌体
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6 篇 酶联免疫吸附法
6 篇 脱氧雪腐镰刀菌烯...
5 篇 沙门氏菌
5 篇 亲和筛选

机构

36 篇 南昌大学
15 篇 南京农业大学
12 篇 华中科技大学
10 篇 第四军医大学
8 篇 湖北民族学院
8 篇 扬州大学
7 篇 南华大学
7 篇 第二军医大学
7 篇 吉林大学
7 篇 华中农业大学
6 篇 江西师范大学
6 篇 郑州大学
5 篇 解放军第302医院
5 篇 中南大学
4 篇 第三军医大学新桥...
4 篇 江西科技师范大学
4 篇 东北农业大学
4 篇 东北师范大学
4 篇 第四军医大学西京...
3 篇 黑龙江八一农垦大...

作者

11 篇 何庆华
11 篇 许杨
10 篇 成军
10 篇 李天群
10 篇 雷家慧
10 篇 姜昌富
8 篇 陈新华
8 篇 时红波
8 篇 王祥卫
8 篇 李莉
8 篇 钟彦伟
8 篇 王刚
8 篇 丁园
7 篇 华修德
7 篇 陈菊梅
7 篇 刘仁荣
7 篇 魏兰英
7 篇 王鸣华
7 篇 张立新
7 篇 潘虹

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268 篇 中文
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排序：

盐酸克仑特罗ELISA方法的建立及用噬菌体展示技术筛选其模拟表位

盐酸克仑特罗ELISA方法的建立及用噬菌体展示技术筛选其模拟表位

引用

作者：李鹏南昌大学

学位级别：硕士

盐酸克仑特罗（Clenbuterol，CLB），俗称瘦肉精，是一种β2-肾上腺素受体激动剂。作为治疗哮喘药物已经有30多年了。不幸的是这类药物被非法用来作为家畜的生长促进剂，用以改善营养物质在脂肪和肌肉之间的重新分配，增加瘦肉。这种非... 详细信息

盐酸克仑特罗（Clenbuterol，CLB），俗称瘦肉精，是一种β2-肾上腺素受体激动剂。作为治疗哮喘药物已经有30多年了。不幸的是这类药物被非法用来作为家畜的生长促进剂，用以改善营养物质在脂肪和肌肉之间的重新分配，增加瘦肉。这种非法应用会对食用残留有此类药物畜产品的消费者产生毒害作用，给人民的身体健康和生命安全造成潜在的危害。因此，世界上许多国家都禁止在畜牧业上使用盐酸克仑特罗。为了防止对人类的危害，必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。ELISA方法检测盐酸克仑特罗残留是一种快捷、可靠的方法，可在实际检测中应用。噬菌体肽库展示技术近年来发展很快，可以用来淘选CLB替代抗原的模拟表位。这也为其它小分子半抗原物质的ELISA方法的建立提供新的思路。本论文主要包含两部分内容： 1建立盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法。 2用噬菌体肽库展示技术淘选盐酸克仑特罗替代抗原的模拟表位。第一部分包括盐酸克仑特罗偶联抗原的合成，单克隆抗体的纯化和效价的测定，ELISA各个影响因素最佳条件的优化，该ELISA方法性能的评价等。根据实验建立了盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法，包被偶联抗原为0.5ng／mL，加入CLB单抗原液稀释为1∶250000，酶标二抗原液稀释为1∶5000。其间接竞争标准曲线其线性范围为0.38—50ng／mL，IC50为6.25ng／mL，检测下限为0.19ng／mL。曲线方程为y=35.149x+19.145，R=0.99378。批内和批间的变异系数分别为8.3％和9.97％。进行样品加标回收实验，平均回收率为93.14％。第二部分包括以抗CLB的单克隆抗体为靶分子，从噬菌体随机7肽库中进行4轮亲和淘选。从第4轮噬菌平板上随机挑选18个噬菌斑，经间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定，挑选出6个合适的噬菌体。经测序可知其序全列为N—His—His—Thr—Phe—Phe—Lys—His—C。用噬菌体P8替代CLB抗原建立了间接竞争ELISA标准曲线，并用该噬菌体进行样品加标回收实验。

关键词：盐酸克仑特罗偶联抗原单克隆抗体 ELISA 模拟表位噬菌体展示肽库

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IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用

IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与...

引用

作者：周宇南京农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病不仅引起患病动物死亡,而且还导致机体免疫抑制,使机体的免疫防御能... 详细信息

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病不仅引起患病动物死亡,而且还导致机体免疫抑制,使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败。对易感鸡群实施疫苗接种是预防该病最有效的方法,但由于各地流行的IBDV毒株的毒力与抗原性的差异,给疫苗毒株的选择造成较大的困难,每年因IBD发病死亡、免疫抑制、免疫失败造成的经济损失巨大。目前广泛应用中等毒力的IBD活疫苗,给IBD的防控带来极大的隐患,灭活疫苗存在着抗原制备的困难。因此,进一步研制新型基因工程疫苗,仍是当前禽病防控工作中亟待解决的重要课题。试验1：IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5e与vp2基因连接构建组合基因vp2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHT中,转化*** DH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBacHT-vp2-5e,用脂质体法转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒vBacHT-vp2-5e。对vBacHT-vp2-5e感染的Sf9细胞,以间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光；电镜检查,重组VP2-5E蛋白能够自组装成病毒样颗粒(VLP)；用免疫印迹分析(Western-blotting),在59kD处出现一条特异性蛋白条带。试验2：IBDV模拟表位与vp2组合基因重组蛋白的应用用IBDV模拟表位与vp2组合基因重组蛋白免疫SPF鸡,第一次免疫14d后,组合基因重组蛋白组的ELISA抗体效价为1746,攻毒死亡率为40%,而用单一VP2重组蛋白组的ELISA抗体效价为1359,攻毒死亡率为50%；第二次免疫14 d后,组合基因重组蛋白组ELISA抗体效价上升到4598,攻毒死亡率为0%,单一VP2重组蛋白组抗体效价为4044,攻毒死亡率为10%。实验结果表明,组合基因重组蛋白免疫鸡可以抵抗IBDV强毒攻击且优于单一VP2重组蛋白。以组合基因重组蛋白VP2-5E作为包被抗原,建立了IBDV抗体ELISA检测方法,重组抗原包被浓度为5μg/mL,被检血清样品1：400稀释。特异性试验表明,与新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、禽流感病毒H9N2亚型的阳性血清均无交叉反应；重复性试验结果表明,间接ELISA方法批内、批间变异系数小于10%。将本实验建立的方法与IDEXX公司ELISA检测试剂盒进行了比较,检测200份IBDV血清样品,阳性符合率为92.9%,阴性符合率100%。实验结果表明,本实验建立的IBDV抗体ELISA检测方法具有良好的特异性与重复性。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP2基因模拟表位组合基因间接ELISA

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基于表位和模拟表位特征的构象性B细胞表位预测方法研究

基于表位和模拟表位特征的构象性B细胞表位预测方法研究

引用

作者：李云云东北师范大学

学位级别：硕士

近年来,免疫信息学已经成为一个热门的研究领域。表位是免疫系统识别的主要化学物质,它的准确预测是免疫信息学研究中最主要的挑战之一。B细胞表位是位于抗原表面的,能够被抗体或B细胞抗原受体特异性识别并引发机体免疫应答的区域,它可... 详细信息

近年来,免疫信息学已经成为一个热门的研究领域。表位是免疫系统识别的主要化学物质,它的准确预测是免疫信息学研究中最主要的挑战之一。B细胞表位是位于抗原表面的,能够被抗体或B细胞抗原受体特异性识别并引发机体免疫应答的区域,它可以是抗原中的线性片段(也称线性B细胞表位)也可以是空间构象性区域(也称构象性B细胞表位)。B细胞表位预测在免疫应答、分子识别和疫苗研制等领域中都有重要的研究价值。然而生物实验的方法鉴定表位需要较高的成本和代价,而采用计算机预测的方法首先找到候选表位区域,再结合实验手段验证和鉴别,会降低成本、提高效率。所以,研究出精准、有效的构象性B细胞表位预测方法具有极高的应用价值。基于模拟表位的构象性B细胞表位预测方法是近年来表位预测研究的一个热点。模拟表位和真实表位一样可以结合单克隆抗体上的对位,并引起免疫响应,因此它被认为与真实表位具有功能等价性。基于模拟表位的表位预测方法的主要思想是,将模拟表位映射到抗原表面相似的区域,进而找到真实表位。该研究的要点是怎样利用模拟表位的序列信息准确的预测出表位。现存的基于模拟表位的B细胞表位预测方法一般都仅仅应用了抗原三维结构和模拟表位的序列信息来预测表位,但是这种方法在性能提高上似乎是遇到了瓶颈。表位在结构和理化特性上有一些特征信息,而模拟表位能模拟表位的功能,也有一些度量属性特征。本文尝试结合一些表位和模拟表位的特征信息来预测构象性B细胞表位,旨在突破这个性能瓶颈。本文从理化特性角度对表位和模拟表位的度量属性特征进行了较全面的比较和统计,旨在挖掘出表位信息和模拟表位序列信息中包含的深层的、可用于表位预测的特征信息。然后利用比较结果并借鉴Mapitope算法思想,我们筛选出了可用的四个特征信息,再结合随机森林分类方法形成了我们的基于表位和模拟表位特征的构象性B细胞表位预测新方法。通过与其他几个经典算法比较发现,我们的算法的敏感性有了较大的提高(敏感性值达到了0.53);并且所有测试样例都有一定数目的正确的表位被预测出来,这是其他方法所不具备的;而且在敏感性/特异性散点图中,我们的方法也表现良好。这也就充分证明了我们的方法的有效性。本文的研究工作不但对B细胞表位预测方法的理论研究具有重大作用,而且也将促进其向实用方向发展。

关键词： B细胞表位模拟表位表位预测特征随机森林

来源：评论

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三肽囊素单克隆抗体的制备及其噬菌体七肽模拟表位的筛选

三肽囊素单克隆抗体的制备及其噬菌体七肽模拟表位的筛选

引用

作者：郑智钢江西农业大学

学位级别：硕士

三肽囊素(赖氨酰-组氨酰-甘氨酰胺，KHG-NH，Bursin)是一种从鸡法氏囊中纯化到的三肽物质，具有诱导B淋巴细胞的分化、提高机体抗体水平、促进T淋巴细胞转化活性、抑制细胞凋亡等作用。基于三肽囊素对畜禽的免疫增强作用，大量的研究集... 详细信息

三肽囊素(赖氨酰-组氨酰-甘氨酰胺，KHG-NH，Bursin)是一种从鸡法氏囊中纯化到的三肽物质，具有诱导B淋巴细胞的分化、提高机体抗体水平、促进T淋巴细胞转化活性、抑制细胞凋亡等作用。基于三肽囊素对畜禽的免疫增强作用，大量的研究集中于将其作为一种免疫增强剂应用于畜禽生产，由于从禽法氏囊提取的数量有限、化学合成成本高等原因，难以在畜禽生产中广泛应用。本研究诣在研制高亲和力三肽囊素单克隆抗体基础上，从噬菌体随机肽库中筛选具有免疫增强活性的三肽囊素模拟表位，以期作为三肽囊素免疫增强活性的功能替代品在畜禽生产中的应用打下基础。 1.三肽囊素人工抗原的制备三肽囊素分子上有多个氨基可用于与载体蛋白偶联，载体蛋白与不同位置氨基偶联制备的人工抗原免疫小鼠均可能获得抗三肽囊素抗体，虽然大部分抗体适合用于建立三肽囊素的免疫学检测方法，但以不同单抗为配体筛选的噬菌体模拟表位的生物学特性可能存在较大差异。 (1)分别采用EDC法和SMCC法将三肽囊素分子赖氨酰(K)上的氨基分别与载体蛋白(BSA、OVA)的羧基发生定向偶联制备人工抗原BSA-KHG-NH、OVA-KHG-NH和BSA-S-KHG-NH;以BSA-KHG-NH免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠抗体效价高达1:102400;免疫鼠血清多克隆抗体与OVA-KHG-NH的结合能被Bursin、GKHG-NH标品特异性阻断，但不能被KHGK标品阻断，表明免疫小鼠产生了抗三肽囊素特异性抗体。以免疫小鼠血清建立的间接竞争ELISA标准曲线的检测线性范围在15～1000ng/mL之间，50%竞争抑制的三肽囊素浓度(IC50)为292ng/mL。 (2)采用EDC法将三肽囊素分子甘氨酰胺(G)上的氨基分别与载体蛋白(BSA、OVA)定向偶联制备人工抗原，以KHG-NH-BSA免疫BALB/c小鼠。虽然免疫小鼠产生了较高的抗体效价，但是小鼠血清多抗与KHG-NH-OVA或KHG-NH-8MAP的结合不能被能被三肽囊素(KHG-NH)特异性阻断，由此推测免疫小鼠未产生高滴度的抗三肽囊素特异性抗体。 2.抗三肽囊素单克隆抗体的研制 (1)以三肽囊素人工抗原BSA-KHG-NH免疫5只BALB/c小鼠，共进行4次细胞融合，筛选到18株能稳定分泌抗三肽囊素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为4A11、7B2、2D2、2A6、3E10、5D8、5F2、5F8、6D4、8C11、11C4、11E9、12A5、12G10、14A9、15C10、15H5、17B2。筛选的18株单抗与三肽囊素分子的结合具有方向性，三肽囊素分子的甘氨酰胺(Gly)上的氨基与其他氨基酸连接后就不能与单抗结合;单抗与三肽囊素分子的结合存在较大差异，三肽囊素阻断的IC50为20.3～122.3ng/mL;18株单抗与GKHG-NH的交叉反应率为22.8～387.6%，与KHGK交叉反应率均小于4.3%;亲和常数为3.95×10～2.39×10;单肮腹水效价为1.28×10～5.12×10。从18株单抗中优选到2株(2D2、11C4)适合用于三肽囊素模拟表淘选。基于单抗2D2建立的三肽囊素间接竞争ELISA检测的线性范围为7.8～250ng/mL，50%竞争抑制浓度(IC50)为25.6ng/mL，回归方程为Y=116.07-19.79×Ln(x)，R=0.9971。以本试验建立的ELISA方法对6个法氏囊样品中三肽囊素含量进行了检测，结果分别为50.59、78.53、89.25、47.7、92.54和94.39ng/g法氏囊组织。 (2)以免疫抗原KHG-NH-BSA免疫5只BALB/c小鼠，进行了2次细胞融合，但未筛选到分泌抗三肽囊素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。 3．噬菌体七肽模拟表位的筛选及其生物活性的研究以单克隆抗体2D2为配体，从噬菌体随机七肽库中淘选三肽囊素模拟表位，通过4轮淘选，筛选到27个含三肽囊素模拟表位的噬菌体阳性克隆。通过对阳性噬菌体克隆特异性分析，优选“NO.40”与单抗2D2亲和性最高(IC50=60.1ng/mL)，用于进行免疫增强活性研究。将不同浓度的Bursin标品、GKHG-NH四肽、KHGK四肽、KHG三肽以及5个IC50值不同的噬菌体克隆分别加入到杂交瘤细胞2C6株(抗猪痘病毒P35蛋白单抗)培养液中，培养48h后检测其细胞液中抗P35蛋白抗体效价，并根据建立的P35单克隆抗体2C6建立标准曲线计算每孔抗体蛋白含量。结果表明Bursin标品浓度为5μg/mL时，抗体分泌增加了35.4%，其它三肽囊素类似肽对抗体分泌增强作用不明显;“NO.40”噬菌体(1.5×10pfu/mL)使抗体分泌增加26.6%，其它噬菌体对抗体分泌增强作用不明显。三肽囊素噬菌体七肽模拟表位的免疫增强生物学活性结果初步证明：三肽

关键词：三肽囊素人工抗原单克隆抗体噬菌体展示模拟表位

来源：评论

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噻虫啉模拟表位的筛选及噬菌体酶联免疫分析方法研究

噻虫啉模拟表位的筛选及噬菌体酶联免疫分析方法研究

引用

作者：殷维南京农业大学

学位级别：硕士

合成了噻虫啉半抗原,采用混合酸酐法将噻虫啉半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联制备了包被抗原;与牛血清蛋白（BSA）偶联制备了免疫抗原用于免疫BALB/c小鼠。将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫过的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列... 详细信息

合成了噻虫啉半抗原,采用混合酸酐法将噻虫啉半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联制备了包被抗原;与牛血清蛋白（BSA）偶联制备了免疫抗原用于免疫BALB/c小鼠。将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫过的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆,最后得到能稳定分泌抗噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株（3A5）。将3A5杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水,采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水得到抗体。基于单克隆抗体建立了噻虫啉间接竞争ELISA方法,并对抗原抗体浓度和工作溶液（甲醇含量、离子强度、pH值）进行优化。在最佳优化的条件下（5%甲醇PBS溶液、Na+ 0.14 M、pH 7.4）,间接竞争ELISA的IC50值和最低检测限（IC10值）分别为26.3μg/L和1.4μg/L。与噻虫啉结构类似物的交叉反应率都小于0.1%,可以认为没有交叉反应。利用*** Display Cloning System构建了随机展示线性八肽库。将33-bp的简并序列连接到M1 3KE载体上,把连接产物电击转化到大肠杆菌感受态细胞制备噬菌体展示线形八肽库,TU为8.7×108 pfu/μg,滴度为1.6×1012pfu/mL。利用生物淘选的方法,从环形8肽噬菌体库及线形8肽噬菌体库中筛选出6种噬菌体展示多肽,并建立了噻虫啉残留噬菌体酶联免疫分析方法。在最优的条件下（5%甲醇PBS溶液、Na+强度0.14M、pH8.5）,噬菌体酶联免疫分析方法的IC50值为8.3ug/L,最低检测限IC10值为0.7μg/L,检测范围（IC20-IC80）为1.2-61.1 ug/L。与传统的ELISA法相比,灵敏度提高3倍以上,与其它结构相似的交叉反应率小于0.01%,可以认为没有交叉反应。在土壤、梨、番茄、甘蓝样品中的添加回收率在80.33～116.3%之间,RSD在1.98-9.76%之间,符合农药残留检测的标准。噬菌体ELIS A的检测结果与HPLC的检测结果高度一致,两种检测方法的相关性方程为Y=1.0267x+0.0015,R2=0.9894。研究结果表明从噬菌体展示库中淘选噬菌体展示多肽可以建立敏感的免疫分析的方法,同时建立的分析方法是一种潜在的、有用的检测环境和农产品中噻虫啉的工具。

关键词：噻虫啉酶联免疫分析噬菌体展示肽噬菌体肽库模拟表位

来源：评论

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1.黄曲霉毒素B<,1>胶体金免疫层析快速检测方法的研究;2.应用噬菌体展示肽库淘选黄曲霉毒素B<,1>模拟表位

1.黄曲霉毒素B<,1>胶体金免疫层析快速检测方法的研究;2.应用噬菌...

引用

作者：邓省亮南昌大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AF)是真菌的次级代谢产物，主要由黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉产生，广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农产品中。因AF具有强烈的毒性和致癌性，1993年AF被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为Ⅰ类... 详细信息

黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AF)是真菌的次级代谢产物，主要由黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉产生，广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农产品中。因AF具有强烈的毒性和致癌性，1993年AF被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。AF是一类结构类似化合物，已经分离鉴定出黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，简称AFB1)、B2、G1、G2、M1、M2等二十余种，其中以AFB1毒性最强。为了防止AFB1含量超标的农产品进入人类食物链，许多国家已经制定了农产品中AFB1的限量标准。因此，建立一种快速检测AFB1的方法具有重要意义。\n 本论文研究的内容主要包括以下两个方面：\n 1、AFB1胶体金免疫层析快速检测方法的研究\n (1)利用辛酸-硫酸铵盐析法纯化小鼠腹水中抗AFB1单克隆抗体，分别采取间接非竞争ELISA和SDS-PAGE对纯化后抗体的活性和纯度进行鉴定。结果显示抗体和腹水效价分别为1∶1.0×106和1∶2.0×106，SDS-PAGE图谱显示两条带，分别为抗体的重链和轻链。\n (2)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。胶体金标记抗体经纯化后，使用XYZ3000点喷平台系统将金标抗体喷在玻璃纤维膜上；将AFB1-BSA(检测线)和驴抗鼠IgG(质控线)分别喷在硝酸纤维素膜(Nitrocellulosemembrane，NCM)上，检测线和质控线两者之间相距4mm。干燥后依次将NCM、玻璃纤维(胶金垫)、样本垫、滤纸、吸水纸粘贴在胶板上，使用BiodotCM4000切刀切成4mm×55mm的试纸条，装入检测卡中密封保存。\n (3)通过单因素实验确定了试纸条的工艺参数，具体如下：胶体金粒径为40nm，胶体金标记抗体量为0.5μg/mL,胶体金标记抗体纯化后稀释至OD值为6.0，NCM型号为CN140，NCM上包被AFB1-BSA和驴抗鼠IgG的浓度分别为0.3mg/mL、0.5mg/mL。\n (4)由上述条件组装的AFB1试纸条最低检测限为5ng/mL，与赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、桔霉素、展青霉毒素无交叉反应，重复性为98％。根据试纸条行业经验推算，试纸条在4℃可保存15个月。\n (5)分别用AFB1试纸条和ELISA方法检测11份样品中AFB1的含量，用甲醇-水(80：20，含0.4％氯化钠)提取，离心后取上清。用0.01MPBS稀释上清液，使甲醇含量为30％，即为试纸条和ELISA的样品测定液。通过试纸条检测，11份样品中仅3号花生和4号花生样品呈阳性，其它样品均为阴性。经ELISA测定，3号花生和4号花生样品中AFB1含量分别60.92ng/mL和7.40ng/mL(此测定值指样品测定液中AFB1的含量)，其它样品中AFB1含量均低于5ng/mL，两种方法的检测结果一致。\n 2、采用噬菌体随机展示肽库淘选AFB1模拟表位\n (1)以抗AFB1单克隆抗体为靶分子，从噬菌体随机7肽库中进行4轮亲和淘选。从第4轮噬菌平板上随机挑选18个噬菌斑，经间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定，获得了15个能与抗AFB1单克隆抗体结合的阳性噬菌体克隆，其中5个能被黄曲霉毒素B1抑制，分别为phage3(P3)、P10、P11、P13和P17。\n (2)提取上述5个噬菌体的DNA，进行测序。根据噬菌体文库简要遗传密码将插入的DNA序列翻译成氨基酸序列。结果显示P3和P10为同一序列，并与P11、P13、P17展现出His-X-X-Asp-Pro-X-His(HXXDPXH)共有序列，其中X为任意氨基酸。\n (3)用上述5个噬菌体替代AFB1-BSA抗原分别建立间接竞争ELISA标准曲线，结果显示P10竞争曲线最好，其线性范围为500～2000pg/mL，IC50为900pg/mL，检测下限为50pg/mL。\n (4)用P10替代AFB1-BSA建立ELISA分析方法，进行样品加标回收实验，回收率在67.5％～72.

关键词：食品检验黄曲霉毒素单克隆抗体胶体金免疫层析快速检测噬菌体展示肽库模拟表位

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结核分枝杆菌模拟表位的筛选及其在结核病血清学诊断中的初步应用

结核分枝杆菌模拟表位的筛选及其在结核病血清学诊断中的初步应用

引用

作者：王丽南华大学

学位级别：硕士

[目的]以纯化的混合结核病阳性血清为靶分子,采用噬菌体展示随机肽库技术筛选结核分枝杆菌的模拟表位,并分别鉴定其相应的噬菌体和多肽在结核病血清学诊断中的应用价值。[方法]（1）利用饱和硫酸铵盐析沉淀法对收集的结核病阳性血清进... 详细信息

[目的]以纯化的混合结核病阳性血清为靶分子,采用噬菌体展示随机肽库技术筛选结核分枝杆菌的模拟表位,并分别鉴定其相应的噬菌体和多肽在结核病血清学诊断中的应用价值。[方法]（1）利用饱和硫酸铵盐析沉淀法对收集的结核病阳性血清进行初步纯化。BCA蛋白定量法测定纯化的混合血清的蛋白浓度。（2）应用噬菌体展示随机12肽库展开三轮生物淘选,其中靶分子为上述纯化的混合结核病阳性血清。淘选完成后,对富集的噬菌体进行扩增培养,应用碘化钠法提取随机挑取噬菌体的单链DNA,对其进行测序,根据其反向互补序列推导出相应的外源性氨基酸序列。最后通过BLAST比对,针对其同源性进行分析。（3）分别用ELISA和斑点印迹试验检测阳性噬菌体与结核病阳性血清结合的特异性。（4）间接ELISA法检测核心噬菌体与结核病患者血清、健康人血清及肺炎支原体/肺炎衣原体血清的反应情况,评价筛选的核心噬菌体在结核病血清学诊断中的应用价值。（5）用固相法合成核心噬菌体的外源性多肽,并用反相高效液相色谱法进行纯化,用间接ELISA法检测多肽与结核病患者血清、健康人血清及肺炎支原体与肺炎衣原体血清的反应情况,评价筛选的多肽在结核病血清学诊断中的应用价值。[结果]（1）利用饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化后,获得了纯度较高的结核病阳性血清。应用BCA蛋白定量试剂盒,并经核酸蛋白仪测定后,其最终浓度为1500μg/mL。（2）以纯化的混合结核病阳性血清为靶分子,对噬菌体展示随机12肽库进行了三轮生物淘选:第一轮到第三轮淘选的产出率,分别为5.0×10-9、1.4×10-7和2.3×10-6;从中随机挑选的37个噬菌体（单克隆）展示的外源性多肽序列,可推导出两组一致性较高的核心序列:即S-V-S-V-G-M-K-P-S-P-R-P（CS1）和T-M-G-F-T-A-P-R-F-P-H-Y（CS2）。BLAST结果表明CS1与结核分枝杆菌的一个未命名蛋白和乙醛脱氢酶具有较高的同源性;CS2与转位酶的同源性较高。（3）ELISA实验的结果表明,7个代表性噬菌体克隆（即P1P7）,都能与结核病阳性血清发生特异结合;斑点免疫印迹试验进一步证明7个阳性噬菌体均与结核病阳性血清具有较强的结合能力。（4）经间接ELISA法检测,两个核心噬菌体均能与结核病阳性血清发生特异结合。核心噬菌体1和2的灵敏度分别为78.57%和72.62%,特异度分别为95.31%和93.75%。（5）固相合成并经反相高效液相色谱纯化的多肽纯度达到99%以上,其分子量与预期相符。间接ELISA检测的结果表明,两条核心多肽均能与结核病阳性血清发生特异结合。CS1的灵敏度和特异度分别为89.41%和90.63%;CS2的灵敏度和特异度分别为85.88%和87.50%。[结论]（1）成功筛选到与结核病阳性血清特异结合的结核分枝杆菌的两个模拟表位。（2）含模拟表位的两个核心噬菌体均能与结核病阳性血清发生特异结合,其灵敏度和特异度较高,具有一定的血清学诊断价值。（3）核心多肽CS1和CS2均能与结核病阳性血清发生特异结合,且具有较高的灵敏度和特异度,具有一定的血清学诊断价值。

关键词：结核分枝杆菌噬菌体展示随机肽库模拟表位合成肽血清学诊断

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采用噬菌体肽库筛选Rh（D）血型抗原模拟表位及其鉴定

采用噬菌体肽库筛选Rh（D）血型抗原模拟表位及其鉴定

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作者：刘淑均安徽医科大学

学位级别：硕士

目的用人源纯化的混合抗Rh（D）多克隆抗体筛选噬菌体肽库，从中寻找到Rh（D）血型抗原的模拟表位，为研制针对Rh（D）血型不合新生儿溶血病（RhD-Hemolyticdisease of newborn, RhD-HDN）的新型诊断抗原、制备特异疫苗以及探索新的治... 详细信息

目的用人源纯化的混合抗Rh（D）多克隆抗体筛选噬菌体肽库，从中寻找到Rh（D）血型抗原的模拟表位，为研制针对Rh（D）血型不合新生儿溶血病（RhD-Hemolyticdisease of newborn, RhD-HDN）的新型诊断抗原、制备特异疫苗以及探索新的治疗方法提供实验基础。方法1.收集5例经不规则抗体筛查为阳性并鉴定含抗Rh（D）抗体的Rh（D）阴性者血清，经等比例混合后，分别用RhD（-）A型、RhD（-）B型压积红细胞对血清中的抗A、抗B抗体于4℃过夜吸收处理；渗透浓度为30mmol/L的PB作为裂解液,将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞,观察其抗原性；以血影细胞作为抗原，吸附血清中抗Rh（D）抗体，再用低pH值缓冲液洗脱、分离纯化抗Rh（D）抗体，用DEAE-Sephadex A-50层析法提取其中免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）组分；用western blot鉴定条带成分，微柱法测抗Rh（D）抗体效价。 2.用纯化的多克隆抗Rh（D）抗体对噬菌体随机十二肽库进行三轮吸附-洗脱-扩增过程筛选，计算每轮的富集率；酶联免疫吸附（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay, ELISA）法检测每轮筛选后洗脱物与抗Rh（D）抗体的结合情况；ELISA法检测随机挑取的第三轮筛选后滴度测定平板上的26个噬菌体克隆与抗Rh（D）抗体结合情况；对ELISA法检测中A450值高于0.5的16个噬菌体克隆进行阳性噬菌体克隆的初筛实验，逐一检测每个噬菌体克隆与抗体的结合力；提取阳性克隆DNA并进行测序，推导外源多肽的氨基酸序列。凝集抑制实验检测噬菌体展示的多肽对Rh（D）血型抗原结合的模拟作用。结果 1.5例血清中均含抗Rh（D）抗体，微柱法检测混合血清抗Rh（D）抗体效价为32；混合血清中的抗A和抗B血型抗体被完全吸收，吸收后血清中的抗A和抗B效价均＜2；制备的血影细胞保持了较强的抗原性；纯化后抗Rh（D）抗体IgG组分效价达到32。 2.三轮筛选后，富集率从（4.45×10-6）%增加到（4.27×10-5）%；随着筛选轮数增加，噬菌体洗脱物与抗Rh（D）抗体的结合力逐渐增强；第三轮筛选后26个噬菌体克隆与抗Rh（D）抗体具有不同的结合力，其中2,8,12,17,21,22克隆与抗Rh（D）抗体呈高亲和力结合；初筛实验中洗脱的噬菌体滴度测定显示克隆2,8,12,17,21,22在与抗体结合后的洗脱物中含量较高，并且与牛血清白蛋白（BSA）反应结合后的洗脱物中含量很低；上述6个阳性克隆中4个噬菌体克隆DNA序列一致：5-CCGAGCCAGGGGTACGTGATACTGCTGGACGAGAAG-3，展示相同的氨基酸序列（PSQGYVILLDEK），命名为C2；另外2个噬菌体克隆DNA序列一致：5'-ACAATGTTAAATCGTGCTCATGATTTTTCTGAATGT-3'，展示相同的氨基酸序列（TMLNRAHDFSEC），命名为C21。凝集抑制实验结果表明展示这两个多肽的噬菌体可以抑制Rh（D）抗原阳性红细胞的凝集作用。结论 1.本实验纯化了抗Rh（D）多克隆抗体，并获得了高效价的抗Rh（D）抗体的IgG组分，为下一步利用噬菌体肽库获得Rh（D）血型抗原模拟表位研究奠定基础。 2.多肽PSQGYVILLDEK和TMLNRAHDFSEC可以模拟Rh（D）血型抗原表位，具有建立针对RhD-HDN的新型诊断抗原和制备特异疫苗的潜能。

关键词：抗Rh(D)抗体纯化噬菌体随机肽库模拟表位 Rh(D)血型抗原

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玉米赤霉烯酮模拟表位筛选以及应用

玉米赤霉烯酮模拟表位筛选以及应用

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作者：李杨会郑州大学

学位级别：硕士

玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一类具有强烈的雌激素作用的真菌毒素,普遍存在于受污染的谷物和谷物副产品中。ZEN的强毒性使得它对生殖系统、内分泌系统以及免疫系统存在很大的威胁,严重时可能引起肿瘤的发生,给人类和动物的健康... 详细信息

玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一类具有强烈的雌激素作用的真菌毒素,普遍存在于受污染的谷物和谷物副产品中。ZEN的强毒性使得它对生殖系统、内分泌系统以及免疫系统存在很大的威胁,严重时可能引起肿瘤的发生,给人类和动物的健康造成很大的影响。因此需要采取有效的措施来预防和消除ZEN的毒性作用,并建立一种安全无毒的方法来检测ZEN的残留。使用化学方法合成抗原的过程中避免不了毒素分子的使用,毒素标准品价格十分昂贵而且对实验人员的健康构成威胁。噬菌体展示技术的运用为我们提供一种新的替代毒素的方法,有关噬菌体模拟表位的研究也引起越来越多人的关注。本文研究的主要内容包括:1.运用噬菌体展示技术筛选ZEN模拟表位（1）以抗ZEN的单克隆抗体（Monoclonal antibody,m Ab）4D7为配基,进行亲和淘选,整个淘选过程共进行4轮。从最后一轮洗脱产物测定滴度的平皿上随机选取了44个噬菌斑克隆进行鉴定,分别命名为Z1-Z44。通过Phage-ELISA和间接竞争ELISA（ic ELISA）对挑取的克隆进行鉴定,在ZEN标准品存在与不存在时有较大差别的噬菌体克隆鉴定为阳性克隆,最终共获得38个阳性噬菌体克隆。（2）对鉴定得到的38个阳性克隆进行测序,由插入的核苷酸序列翻译成噬菌体展示肽的氨基酸序列,结果显示38个阳性克隆展示6种不同的模拟表位序列。（3）对其中三个展示的肽序列出现较多的噬菌体Z8,Z21和Z25绘制它们竞争抑制曲线,通过线性方程计算出Z8,Z21和Z25的IC50值分别为0.918 ng/m L,1.972 ng/m L和1.29 ng/m L。2.模拟表位的免疫原性研究将Balb/c小鼠随机分为6组,每组6只。第一组至第三组分别免疫1012pfu的Z8、Z21和Z35噬菌体克隆;第四组注射以1:1:1比例混合的Z8、Z21和Z35噬菌体克隆;第五组免疫ZEN-BSA,作为对照;第六组注射原始肽库的M13噬菌体,用于阴性对照。在第二周和第四周进行两次加强免疫。在初次免疫后的第35天,从小鼠的尾静脉收集血清以制备血清样品。经过三次免疫后,用淘选得到的噬菌体免疫的小鼠均产生了特异性抗体,滴度为1:3200（Z8）,1:3200（Z21）,1:6400（Z35）,1:6400（1:1:1比例混合的Z8:Z21:Z35）,并且血清抗体与ZEN-OVA的结合可以被ZEN标准品溶液所抑制。3.建立基于模拟表位的荧光免疫分析方法羧基水溶性量子点（Qantum dots,QDs）与4D7 m Ab通过碳二亚胺法进行偶连,制备QDs-m Ab荧光探针。以敏感性最好的模拟表位Z8代替化学合成抗原,避免了检测过程中毒素的使用。然后通过优化噬菌体的包被浓度、荧光探针的稀释倍数建立一种基于模拟表位的直接竞争荧光免疫分析方法（Direct compete fluorescence-linked immunosorbent assay,dc FLISA）检测ZEN。通过线性方程计算出其IC50值为0.159 ng/m L。与未使用QDs作为荧光标记物的P-ELISA相比,P-FLISA（Phage Fluorescence-linked immunosorbent assay,P-FLISA）在检测过程中没有毒素分子的使用,并且灵敏度有了很大的提高,表明了在免疫分析中用QDs作为荧光标记物具有较好的前景。

关键词：玉米赤霉烯酮模拟表位免疫原性荧光免疫分析量子点

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噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位

噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位

引用

作者：贺雪姣第四军医大学

学位级别：硕士

结直肠癌已成为我国继肺癌、胃癌、肝癌后的第四大最常见癌症。既往研究发现,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在结直肠癌中常出现过表达,并进一步通过其信号转导引起肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭和转移... 详细信息

结直肠癌已成为我国继肺癌、胃癌、肝癌后的第四大最常见癌症。既往研究发现,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在结直肠癌中常出现过表达,并进一步通过其信号转导引起肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭和转移能力增强,细胞凋亡抑制,因此,EGFR已成为抗肿瘤药物的一个理想靶点。经FDA批准上市,针对EGFR抗原表位研制的单克隆抗体药物有尼妥珠单抗和西妥昔单抗。这两株单抗在治疗EGFR高表达的结直肠癌及其他肿瘤中,能专一的针对肿瘤细胞,减少对正常组织的损害,显著提高患者的生存状态。但其存在一定的不足,首先,分子量相对较大,降低了单抗药物的治疗效果,导致临床使用效果不理想。其次,价格昂贵,且在治疗过程中需长期使用,给病人及家属带来了较大的经济负担。如果能将单抗药物与其靶点结合的位点模拟出来,制成多肽疫苗,就可以避免单克隆抗体药物的不足,大大提高治疗效果,减轻患者的经济负担。模拟抗原表位的方法有两种,通过将噬菌体展示技术与传统的抗原表位分析方法相比,我认为噬菌体展示技术具有独特的优势。噬菌体展示技术是将外源蛋白基因序列插入至噬菌体外壳蛋白,随着噬菌体的重新组装将外源蛋白融合在噬菌体的表面,其在抗原表位筛选中的优点是既可识别并结合肿瘤抗原,又能感染宿主菌进行扩增。噬菌体随机肽库包含大量不同序列结构的多肽,其可以作为任何靶抗原表位的模拟肽,通过肽库对靶抗原进行筛选时,不需要空间构象,只需靶抗原就可获得具有抗原性和免疫原性的蛋白多肽,且反映了抗原结合位点的空间构像。目前该技术在肿瘤的基础研究以及治疗新技术的开发中得到广泛应用。本实验拟用尼妥珠单抗及西妥昔单抗分别作为抗EGFR的靶标蛋白,应用噬菌体随机十二肽库对其抗原表位进行探讨分析。用两株单克隆抗体药物对同一靶点抗原表位进行筛选分析,目前尚未有文献报道。拟经过三轮噬菌体的“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选实验,获得与单抗特异性结合的单克隆噬菌体,进而对噬菌体提取单链DNA并测序,获得抗EGFR抗体对应抗原表位的氨基酸序列,对两株单抗获得的氨基酸序列进行分析比较。采用竞争ELISA检测方法,将筛选出高频的单克隆噬菌体与EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液竞争结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗,进一步检测所获得的短肽与西妥昔单抗及尼妥珠单抗的亲和活性,并对两株单抗获得短肽的亲和性进行分析比较,以寻找最具亲和活性的短肽。目的1.利用噬菌体十二肽库进行生物淘洗,筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位。2.筛选出的模拟短肽的生物活性检测。方法以尼妥珠单抗及西妥昔单抗作为抗EGFR抗原的靶分子,在噬菌体十二肽库中淘选表皮生长因子受体的抗原模拟表位,经过3轮生物淘洗后,挑选单克隆噬菌斑进行扩增,用ELISA方法检测,选择与西妥昔单抗或尼妥珠单抗亲和性较高的阳性单克隆噬菌体,对其进行扩增及测序。采用竞争ELISA的方法,对筛选出的高频噬菌体单克隆与EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液竞争结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗。结果1.以抗EGFR的单克隆抗体药物西妥昔单抗作为靶标蛋白,利用噬菌体随机十二肽库对靶蛋白进行三轮生物淘洗,对每轮淘洗出来的噬菌体均进行噬菌体滴度测定,测定结果可以看出,西妥昔单抗淘筛出来的噬菌体总体回收率从第一轮的(6.67×10-6)%增加到了第三轮的(2.80×10-3)%,可见通过三轮“吸附-洗脱-扩增”的生物淘洗,噬菌体回收率得到了富集,富集率达到了420倍。用同样的方法对尼妥珠单抗进行淘洗,对淘洗结果进行滴度测定,测定结果可以看出,尼妥珠单抗淘选出来的噬菌体总体回收率从第一轮的(8.67×10-6)%增加到了第三轮的(1.80×10-3)%,可见尼妥珠单抗通过三轮“吸附-洗脱-扩增”的生物淘洗,噬菌体的回收率也得到富集,富集度为208倍。2.在第三轮测噬菌体滴度的平板中,分别随机挑选30个分隔良好的单克隆蓝斑进行扩增,扩增后行滴度测定,以扩增的单克隆噬菌体作为检测组,以噬菌体原库扩增液作阴性对照组,进行ELISA检测。在阳性结果的评价中,以单克隆噬菌体扩增液(检测组)的OD值为噬菌体原库扩增液(阴性对照)的OD值的2倍以上视为阳性。以此标准对ELISA结果进行分析,确定西妥昔单抗的阳性结果有17个,而尼妥珠单抗的阳性结果有21个,阳性率分别为56.67%和70%。这表明西妥昔单抗及尼妥珠单抗均淘筛出来了特异性结合的噬菌体。随机挑选阳性噬菌体克隆进行依赖性分析,可见随着阳性噬菌体投入量的增加,其OD值也增大,说明其存在剂量依赖性。3.对检测出来的阳性噬菌体克隆提取单链DNA,并进行DNA序列测定,找出插入噬菌体的36个碱基,并将其翻译成氨基酸,此即为噬菌体递呈的12肽序列。对17个阳性的西妥昔单抗噬菌体进行测序,有三段短肽频率出现较高,分别为

关键词：表皮生长因子受体模拟表位噬菌体肽库西妥昔单抗尼妥珠单抗

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