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吉林大学学报（医学版） 2013年第4期39卷 704-709页

作者：孙晓宇何钟勤刘晓红高心钟丞薛莹吉林大学口腔医院牙体牙髓病科吉林长春130021 吉林大学中日联谊医院口腔科吉林长春130033 吉林省长春市中心医院口腔科吉林长春130051

目的:对殊异韦荣菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(sahH)基因进行克隆、鉴定、表达和纯化,为研究龋病的微生物致病机制提供理论依据。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,采用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒,转化到大肠杆菌(***... 详细信息

目的:对殊异韦荣菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(sahH)基因进行克隆、鉴定、表达和纯化,为研究龋病的微生物致病机制提供理论依据。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,采用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒,转化到大肠杆菌(***)BL21(DE3)感受态细胞中,酶切、PCR鉴定和测序后,IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果:PCR扩增产物全长为1 410bp。测序结果经BLAST软件分析,与GenBank中所报道的绿脓假单胞菌sahH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。该基因序列已登陆GenBank,序列号为KC477409。SDS-PAGE分析,重组质粒在*** JM109中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为50 000,诱导5h蛋白表达量最高,浓缩后蛋白浓度为5.4g.L-1。Western blotting法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。结论:成功克隆了殊异韦荣菌sahH基因,并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架,且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白。

关键词：殊异韦荣菌 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因克隆基因表达纯化

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殊异韦荣菌乳酸脱氢酶基因的克隆及鉴定

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吉林大学学报（医学版） 2011年第5期37卷 825-828页

作者：庾桦何钟勤高心钟丞李倪娜薛莹王志刚吉林大学口腔医院牙体牙髓病科吉林长春130021 承德医学院附属医院口腔内科河北承德067000 吉林大学中日联谊医院口腔科吉林长春130033 中国石油吉化集团公司总医院口腔科吉林吉林132022

目的:对殊异韦荣菌(***)乳酸脱氢酶(LDH)基因及其前后基因进行克隆和鉴定,为龋病的预防和治疗奠定理论基础。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,利用PCR方法扩增LDH及其前后同源区序列片段,并克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,酶切及... 详细信息

目的:对殊异韦荣菌(***)乳酸脱氢酶(LDH)基因及其前后基因进行克隆和鉴定,为龋病的预防和治疗奠定理论基础。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,利用PCR方法扩增LDH及其前后同源区序列片段,并克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,酶切及PCR鉴定后,进行测序。结果:PCR扩增产物特异,全长2 300 bp。测序结果经BLAST软件分析,共包含3个基因,分别是DNA旋转酶(gyr A)、LDH和一个由未知蛋白编码的基因。并与GenBank中所报道的变形链球菌LDH基因序列进行对比分析,其同源性为99%,该基因序列已登陆GenBank,序列号为EU518464。结论:成功克隆殊异韦荣菌LDH基因,并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架。

关键词：殊异韦荣菌乳酸脱氢酶基因克隆序列测定

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殊异韦荣菌sahH基因的克隆、重组蛋白表达和纯化

殊异韦荣菌sahH基因的克隆、重组蛋白表达和纯化

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作者：孙晓宇吉林大学

学位级别：硕士

韦荣菌（Veillonella）是一种革兰阴性厌氧小球菌，在口腔内主要寄生于黏膜、舌体和牙菌斑中，是牙菌斑中较早定植的常驻菌之一。口腔内各种细菌长期定居、生长繁殖、不断进行竞争和拮抗，这些活动主要是通过密度感应系统进行的。其中... 详细信息

韦荣菌（Veillonella）是一种革兰阴性厌氧小球菌，在口腔内主要寄生于黏膜、舌体和牙菌斑中，是牙菌斑中较早定植的常驻菌之一。口腔内各种细菌长期定居、生长繁殖、不断进行竞争和拮抗，这些活动主要是通过密度感应系统进行的。其中不同信号分子的产生就涉及到甲基循环。甲基循环中的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(sahH)是细胞内广泛存在的一种酶,能可逆地催化S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)水解生成腺苷(Ado)和同型半胱氨酸(Hcy)，参与细胞代谢过程中的甲基化作用。本实验提取殊异韦荣菌基因组DNA,利用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,酶切、PCR鉴定和测序后，IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果显示韦荣菌中存在sahH,PCR扩增产物全长为1410bp。测序结果经BLAST软件分析,与GenBank中所报道的绿脓假单胞菌sahH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。该基因序列已登陆GenBank,序列号为KC477409。SDS-PAGE分析,重组质粒在***109中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为50000,而且诱导5h，蛋白表达量最高,浓缩后蛋白浓度为5.4g·L-1。Westernblotting法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。通过实验从分子水平上探讨sahH甲基化机制及生理活性,了解信号传导通路和密度感应系统在口腔疾病中的作用，探讨口腔微生物环境之间的联系情况和致病机制，以期为龋病的预防和治疗扩展新的思路。

关键词：殊异韦荣菌 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因克隆基因表达纯化

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殊异韦荣菌中耐酸相关基因dltc和fhs的检测

殊异韦荣菌中耐酸相关基因dltc和fhs的检测

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作者：张红吉林大学

学位级别：硕士

韦荣球菌是口腔中一种革兰阴性专性厌氧球菌。目前从口腔中已经成功地分离出殊异韦荣球菌,小韦荣球菌和非典型韦荣球菌。变形链球菌胞壁上存在着与韦荣菌结合的受体,韦荣菌对牙面的粘附力较弱,不易与唾液中的羟基磷灰石结合,但当牙面上... 详细信息

韦荣球菌是口腔中一种革兰阴性专性厌氧球菌。目前从口腔中已经成功地分离出殊异韦荣球菌,小韦荣球菌和非典型韦荣球菌。变形链球菌胞壁上存在着与韦荣菌结合的受体,韦荣菌对牙面的粘附力较弱,不易与唾液中的羟基磷灰石结合,但当牙面上一旦有革兰阳性菌粘附时,韦荣菌随之移入,从而发生细菌间的协同代谢,使菌斑量明显增加。这说明韦荣菌可借助于牙面上的革兰阳性菌而粘附于牙面上,在菌斑形成中也起一定作用。韦荣菌占初期菌斑量的5%,因为不能代谢糖类,所以只能依靠代谢有机酸做为能源。韦荣菌能将细菌产生的酸性最强的乳酸转变为酸性较弱的乙酸和丙酸,使菌斑pH值上升,所以在牙菌斑生态系和龋病的发生中起重要作用。韦荣菌也具有一定的耐酸性,目前在一些原核生物中已分离、测序并克隆了多个耐酸性相关基因,其中dltC和fhs耐酸基因受到国内外学者的密切关注。本实验首先在体外人工诱导殊异韦荣球菌(ATCC17748),用传统方法提取细菌基因组,根据GenBank发表的dltC和fhs基因序列,设计引物进行PCR,获得殊异韦荣菌株耐酸基因dltC和fhs基因序列,利用PMD18-T载体进行T/A克隆,构建重组质粒,并进行测序鉴定。本实验以殊异韦荣菌为对象,证实殊异韦荣菌中存在耐酸相关基因dltc和fhs,对其测序结果进行了同源性比较,结果显示韦荣菌中dltc基因序列与GenBank中登陆的Streptococcus mutans D-alanyl carrier protein (dltC) gene(DQ272518.1)相似性83%,与Streptococcus mutan UA159(AEO14133.1)相似性83%,与Streptococcus mutans YtqB (ytqB) gene(AFO51356.1)相似性83%。fhs基因序列与GenBank中登陆的Lactococcus lactis subsp(AE006328)相似性98%,与Streptococcus mutan UA159(AEO14133.1)相似性71%,与Streptococcus mutans formyl-tetrahydrofolate synthetase (fhs)gene (U39612.1)相似性71%。

关键词：殊异韦荣菌耐酸相关基因 dltC fhs

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殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因的克隆及重组蛋白表达

殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因的克隆及重组蛋白表达

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作者：薛莹吉林大学

学位级别：硕士

殊异韦荣菌(Veillonella dispar)是口腔中常见的一种球菌，其具有专性厌氧以及生长缓慢的特点，其在口腔菌斑pH调节以及龋病的发生等方面都有着重要作用。电子传递黄素蛋白是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FlavinAdenine Dinucleotide,FAD)... 详细信息

殊异韦荣菌(Veillonella dispar)是口腔中常见的一种球菌，其具有专性厌氧以及生长缓慢的特点，其在口腔菌斑pH调节以及龋病的发生等方面都有着重要作用。电子传递黄素蛋白是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FlavinAdenine Dinucleotide,FAD)为辅酶的蛋白，参与细胞的电子传递及pH调节。本实验以殊异韦荣菌为研究对象，对其电子传递黄素蛋白基因(Electron Transfer Flavoprotein,etf)进行克隆及表达，为将来龋病防治提供理论基础。本实验第一部分提取殊异韦荣菌基因组，通过PCR反应扩增etf基因序列，并与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后，进行测序验证。PCR产物特异大小约900bp。测序结果经Blast软件分析该序列为etf基因，通过基因序列及氨基酸的分析证明其具有完整的阅读框架，该基因序列已登录GenBank，序列号为JQ669939。第二部分构建etf-pET28a-c(+)重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达，以及表达条件的优化。etf-pET28a-c(+)重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，蛋白大小约33KD，设定七个诱导剂浓度梯度、七个诱导时间梯度成功摸索出etf-pET28a-c(+)重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达的最佳诱导条件为0.2mM IPTG诱导3小时，并通过超声裂解鉴定表达形式为包涵体，进行了重组蛋白的高效表达。本实验成功克隆了殊异韦荣菌的etf基因序列，通过基因序列及氨基酸的分析证明其具有完整的阅读框架，并进行了重组质粒的构建及最适表达条件的摸索，鉴定蛋白表达形式为包涵体，希望通过对其的研究能够为后续蛋白功能研究提供理论基础并为龋病防治探寻新途径。

关键词：殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因克隆重组蛋白表达

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殊异韦荣菌中耐酸相关基因ffh的检测

殊异韦荣菌中耐酸相关基因ffh的检测

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作者：吕海驰吉林大学

学位级别：硕士

韦荣球菌是口腔中一种革兰阴性专性厌氧球菌，变链球菌胞壁上存在着与韦荣菌结合的受体。韦荣菌对牙面的粘附力较弱，但当牙面上—旦有革兰阳性菌粘附时，韦荣菌随之移入，使菌斑量明显增加，这说明韦荣菌可借助于牙面上的革兰阳性菌而... 详细信息

韦荣球菌是口腔中一种革兰阴性专性厌氧球菌，变链球菌胞壁上存在着与韦荣菌结合的受体。韦荣菌对牙面的粘附力较弱，但当牙面上—旦有革兰阳性菌粘附时，韦荣菌随之移入，使菌斑量明显增加，这说明韦荣菌可借助于牙面上的革兰阳性菌而粘附于牙面上，在菌斑形成中也起—定作用。由于韦荣球菌缺乏葡萄糖激酶(glucokinaseu)和果糖激酶(fructokinase)，因此不能代谢碳水化合物和多元醇，但能利用一些碳水化合物代谢的中间产物，特别是利用乳酸盐作为能源。韦荣球菌能将细菌产生的酸性最强的乳酸转变为酸性较弱的乙酸和丙酸，使菌斑pH值上升，所以在牙菌斑生态系和龋病的发生中起重要作用。韦荣菌在酸性环境中能够生长，说明其具有一定的耐酸性。目前在一些原核生物中已分离、测序并克隆了多个耐酸性相关基因。本实验首先在体外培养殊异韦荣菌，用V-gene细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取细菌基因组，根据耐酸相关基因ffh的同源性，从最保守区设计一对引物进行PCR，利用pGEM-T载体进行T-A克隆，构建重组质粒，从而检测殊异韦荣菌中是否存在耐酸相关基因ffh，并进行测序鉴定。本实验以殊异韦荣菌为对象，证实殊异韦荣菌中存在耐酸相关基因ffh,对其测序结果进行了同源性比较，结果显示殊异韦荣菌ffh基因序列与GeneBank中登陆的Streptococcus mutan Ffh (ffh)（AE014133.1）UA159相似性100％，与Streptococcus mutans Ffh (ffh)（AY857409.1）基因相似性99％，与Streptococcus mutans signal recognition particle protein(ffh)（U48883.1，SMU48883）相似性100％，并且所测殊异韦荣菌耐酸相关基因ffh序列已提交美国GenBank，登陆序列号为EU551144。

关键词：殊异韦荣菌耐酸相关基因 ffh

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殊异韦荣菌中乳酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及活性分析

殊异韦荣菌中乳酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及活性分析

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中华口腔医学会第14次全国口腔医学学术会议

作者：何钟勤钟丞高心薛莹孙晓宇刘晓红 130021 长春吉林大学口腔医学院牙体牙髓科吉林大学中日联谊医院口腔科长春130033 130021 长春吉林大学口腔医学院牙体牙髓科

目的：进一步测定殊异韦荣菌中依赖性乳酸脱氢酶(LDH)的活性,以期为研究该酶的具体功能及作用机制奠定基础,并为龋病预防和治疗提供新的思路.方法：重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,采用不同时间及6种不同浓度的异丙基硫... 详细信息

目的：进一步测定殊异韦荣菌中依赖性乳酸脱氢酶(LDH)的活性,以期为研究该酶的具体功能及作用机制奠定基础,并为龋病预防和治疗提供新的思路.方法：重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,采用不同时间及6种不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTC)诱导乳酸脱氢酶蛋白表达,选择最佳条件诱导LDH蛋白表达.并经His-标记蛋白纯化柱(HisTRAP FF柱)提纯,用LDH活性试剂盒测定蛋白活性.结果：pET-28a-LDH转入BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示最适表达条件分别为IPTG终浓度0.4mmoL/L、30℃诱导8h,IPTG终浓度0.4mmol/L、30℃诱导6h.经BandScan 5.0软件分析,pET-28a-LDH质粒转化BL21(DE3)表达相对含量为9.0％,高于Rosetta(DE3)的6.1％;LDH活性试剂盒测定的蛋白活性值为13.79.结论：本项研究获得了LDH蛋白的最适诱导条件,并测出殊异韦荣菌中依赖性LDH的活性,为进一步研究LDH的功能及在龋病防治中的作用奠定了基础.

关键词：口腔细菌学殊异韦荣菌乳酸脱氢酶重组表达蛋白纯化

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殊异韦荣菌中耐酸相关基因ffh的检测

殊异韦荣菌中耐酸相关基因ffh的检测

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全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会

作者：张志民吕海驰洪丽华朱来宽吉林大学口腔医学院牙体牙髓病科

目的:检测殊异韦荣菌中是否含有耐酸相关基因ffh。方法:体外诱导殊异韦荣菌菌株,碱裂解法提取细菌基因组,根据耐酸相关基因ffh的同源性,从最保守区设计一对引物进行PCR,利用pGEM-T载体进行T-A克隆,构建重组质粒,从而检测殊异韦荣菌中是... 详细信息

目的:检测殊异韦荣菌中是否含有耐酸相关基因ffh。方法:体外诱导殊异韦荣菌菌株,碱裂解法提取细菌基因组,根据耐酸相关基因ffh的同源性,从最保守区设计一对引物进行PCR,利用pGEM-T载体进行T-A克隆,构建重组质粒,从而检测殊异韦荣菌中是否存在耐酸相关基因ffh,并进行测序鉴定。结果:从殊异韦荣菌菌株中获得耐酸相关基因ffh部分片段,重组质粒含有其目的片段,对其进行测序,并将测序结果提交美国GeneBank。结论:殊异韦荣菌中存在耐酸相关基因ffh,在GeneBank上登陆序列号为EU551144。

关键词：殊异韦荣菌耐酸相关基因ffh PCR

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殊异韦荣菌丝氨酸羟甲基转移酶的基因克隆及重组表达

殊异韦荣菌丝氨酸羟甲基转移酶的基因克隆及重组表达

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作者：李倪娜吉林大学

学位级别：硕士

口腔中的细菌生长、繁育、成熟需要特定的微生态环境，牙菌斑的形成即是细菌和宿主之间相互作用的产物。由于生存环境影响和营养物质限制，细菌之间的关系会以不同形式存在，总体来说有两大主要方面,共生和拮抗。当细菌之间处于动态平... 详细信息

口腔中的细菌生长、繁育、成熟需要特定的微生态环境，牙菌斑的形成即是细菌和宿主之间相互作用的产物。由于生存环境影响和营养物质限制，细菌之间的关系会以不同形式存在，总体来说有两大主要方面,共生和拮抗。当细菌之间处于动态平衡状态时即以细菌性生物膜的形式存在，而细菌性生物膜正是导致龋病形成的重要基础条件。如果能打破这样的平衡状态从而破坏菌斑形成的条件可从某一方面抑制龋病的形成。韦荣菌（Veillonella）是一种革兰氏阴性厌氧小球菌，主要寄生在动物与人类的口腔、肠道以及呼吸道中，具有一定的耐酸性，可以在酸性环境下生长。有研究表明在韦荣菌定植于口腔后变形链球菌等细菌可随即定植从而形成牙菌斑生物膜这一较稳定结构。丝氨酸羟甲基转移酶为殊异韦荣菌中代谢的关键酶，催化丝氨酸和甘氨酸的转化，其中间产物四氢叶酸更是细胞DNA中的重要酶，对韦荣菌的生长繁殖其重要作用。本实验从分子生物学角度探讨该酶的作用，可能开辟一条龋病预防和治疗的新思路，同时也为生物性防龋的成功提供了可能性。本实验主要分为两个部分①通过PCR反应扩增了殊异韦荣菌丝氨酸羟甲基转移酶基因，并与克隆载体PMD18-T相连接，构建了殊异韦荣菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆质粒(gly-PMD18-T)。②以实验一中构建的克隆质粒为模板，重新设计引物，扩增出包含编码区及保守序列的丝氨酸羟甲基转移酶基因，并将其与表达载体pET28a相连接，构建了殊异韦荣菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的原核表达质粒(gly-pET28a),并将其转化入大肠杆菌BL21中表达。在37℃条件下用终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达分别诱导1、2、3h，将表达产物与未经IPTG诱导的重组质粒，pET28a载体及BL21空白菌做对照，进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示：①实验一最终测序结果殊异韦荣菌gly基因通过GenBank BLAST比较，与小韦荣球菌（Veillonella parvula）的gly基因的同源性达99%，该基因现已登陆NCBI GenBank，登录号为JQ929767。②实验二中殊异韦荣菌gly基因表达的蛋白产物在相应处有目的条带出现，对照组均未显示该条带。说明殊异韦荣菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的原核表达质粒gly-pET28a能够翻译表达蛋白，为下一步进行酶的活性测定实验及蛋白功能检测奠定了基础。

关键词：殊异韦荣菌丝氨酸羟甲基转移酶基因克隆重组表达

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